潘蕾蕾,馬俊,葉亭亭,陳劍平 （. 宣城中心醫(yī)院心胸乳腺外科，安徽 宣城 4000；. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院甲乳外科，安徽 蕪湖 4000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2020年乳腺癌新增人數(shù)約226萬，已經(jīng)超過肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。手術(shù)及放化療是臨床治療乳腺癌的主要方法，但放療抵抗或化療耐藥會影響患者療效及預(yù)后[2]。細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，主要依賴Gasdermin(GSDM)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性。有研究表示，caspase-3可通過切割GSDM蛋白N端結(jié)構(gòu)增加細(xì)胞焦亡，從而降低癌細(xì)胞化療耐藥性[3]。乳腺癌細(xì)胞在缺血環(huán)境下無法進(jìn)行增殖及轉(zhuǎn)移，腫瘤血管生成可為癌細(xì)胞活化提供血供，從而促進(jìn)乳腺癌疾病進(jìn)展。因此，眾多學(xué)者認(rèn)為可將抑制腫瘤血管生成作為抗乳腺癌的靶點[4-5]。現(xiàn)階段，在血管新生的病理生理過程中，細(xì)胞自噬作用持續(xù)存在，在血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）誘導(dǎo)的血管生成中，自噬相關(guān)信號可通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞表面內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)表達(dá)而促進(jìn)血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶的α亞單位在腫瘤中存在異常表達(dá)，對癌細(xì)胞增殖及遷移等具有調(diào)控作用[6]。Na+-K+-ATP酶α2亞基(ATP1A2)基因在乳腺癌中高表達(dá)，其功能缺失會使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，從而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。但ATP1A2基因與腫瘤血管生成及細(xì)胞自噬的關(guān)系目前尚不清楚。

腦膜瘤相關(guān)蛋白(meningioma-associated protein,MAC30)是胰島素生長因子結(jié)合蛋白家族成員之一，主要存在于細(xì)胞核的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并在機(jī)體組織中廣泛表達(dá)[7]。在乳腺癌組織中MAC30表達(dá)升高，通過下調(diào)MAC30能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移，但是關(guān)于下調(diào)MAC30對乳腺癌細(xì)胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影響目前尚未可知。因此，本研究通過體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞，觀察下調(diào)MAC30對乳腺癌的改善作用，以期為其治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺上皮細(xì)胞HMEC和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231、MCF-7、SKBR3均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心，于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，置于含1%雙抗的10%胎牛血清中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，細(xì)胞生長至80%~90%時進(jìn)行傳代，生長至90%時終止消化反應(yīng)，培養(yǎng)基中2~3 d傳代。

1.2 試劑與儀器來源

MAC30 Lenti-shRNA和陰性對照Lenti-shRNA(NC-shRNA)由上海吉凱基因公司合成；RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢益普生物科技有限公司；ATP1A2多克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自上海圻明生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG購自武漢純度生物科技有限公司；CCK-8法試劑盒購自上海Beyotime公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籈CL顯色試劑盒購自北京索寶萊科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；酶標(biāo)儀（型號：HBS-1096A）購自上海研卉生物科技有限公司；TDZ4-WS低速臺式離心機(jī)購自湖南湘瑞生物有限公司；凝膠成像系統(tǒng)及Western blot電泳系統(tǒng)均購自北京賽百奧科技有限公司；熒光定量PCR儀購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 qRT-PCR檢測HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

使用TRIzol法提取HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞中總RNA，無核酸酶溶解后轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反應(yīng)體系，條件為：42 ℃ 60 min，72 ℃ 5 min，4 ℃終點。采用qRT-PCR檢測，每個細(xì)胞設(shè)置6個復(fù)孔，上下游引物均為0.5 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱3 min，95 ℃ 5 s，58 ℃退火，40個循環(huán)。引物序列：MAC30上游為5'-CTCAGCCACATCCCC-3'，下游為5'-CACAAGCTCG CAAAAC-3'；β-actin上游為5'-GGAAATCGTGCGTGACATTA-3'，下游為5'-GGAGCAATGATCTTG ATCTTC-3'。根據(jù)2-△△Ct法計算各組細(xì)胞中MAC30相對表達(dá)量。

1.4 MCF-7細(xì)胞分組

取MCF-7細(xì)胞，待生長至50%~60%后采用培養(yǎng)基制成單個細(xì)胞懸液，分為乳腺癌組（MCF-7細(xì)胞）、NC組（MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-NC-shRNA）、MAC30 shRNA組（MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-shRNA）、ATP1A2組（MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATP1A2-shRNA）及MAC30 shRNA+ATP1A2組（MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染MAC30-shRNA、ATP1A2-shRNA）。

1.5 MAC30 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染

將生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞制備成5×107/mL的細(xì)胞懸液，接種至6孔板中，37 ℃孵育24 h，待細(xì)胞達(dá)到30%時更換培養(yǎng)基，加入感染增強(qiáng)液，根據(jù)最佳感染復(fù)數(shù)及病毒滴度，加入MAC30 Lenti-shRNA和陰性對照NC-shRNA培養(yǎng)液，次日換掉病毒培養(yǎng)液，加入1 mg新鮮培養(yǎng)基，96 h后采用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.6 ATP1A2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

構(gòu)建TP1A2質(zhì)粒[7]，將MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長覆蓋孔板80%~90%時開始轉(zhuǎn)染，配制轉(zhuǎn)染混合液，將4 μg質(zhì)粒加入500 μL無血清培養(yǎng)基中，將5 μL ip 2000加入500 μL無血清培養(yǎng)液混勻，室溫下靜置20 min。PBS沖洗3次，加入1 mL Lipo?fectamine 2000轉(zhuǎn)染混合液及無血清培養(yǎng)基1.5 mL，培養(yǎng)6 h后，換成常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.7 MCF-7細(xì)胞增殖實驗

采用CCK-8法檢測各組MCF-7細(xì)胞增殖情況。將5×103個對數(shù)生長的MCF-7細(xì)胞接種至96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑(5 g/L)，每孔20 μL，再加入200 μL二甲基亞砜溶液，充分溶解15 min，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時取出培養(yǎng)板，在酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測吸光度OD值，實驗3次，復(fù)孔2次。

1.8 MCF-7細(xì)胞焦亡實驗

100 μL的Binding buffer重懸細(xì)胞后加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI混合液，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL含Binding buffer的細(xì)胞懸液，30 min后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。以AnnexinV-FITC+/PI+雙陽性細(xì)胞百分率作為焦亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.9 體外血管形成實驗

取48孔板，于冰上每孔加入60 μL基質(zhì)膠溶液，然后在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱靜置30 min使其凝固，取各組細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，棄掉上清液后重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/mL接種于24孔板，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后置于倒置顯微鏡下觀察。計算5個視野的血管管腔數(shù)目，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.10 Westerm blot檢測各組細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平

10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白（40 μg），轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后再用5%脫脂奶粉封閉2～3 h，加入一抗ATP1A2（1∶100)、SCr（1∶200）、AKT（1∶150）、PI3K（1∶200），內(nèi)參為GAPDH（1∶2 000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST沖洗3次，室溫下與辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）結(jié)合孵育2 h，雜交沖洗。然后將膜浸入ECL工作液，計算目標(biāo)蛋白與GAPHD之間的OD值，檢測相對表達(dá)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，事后檢驗采用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

與HMEC細(xì)胞相比，MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)水平均升高（P<0.05），其中MCF-7細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)水平最高，見圖1。故本研究選擇MCF-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 HMEC、MDA-MB231、MCF-7和SKBR3細(xì)胞MAC30 mRNA表達(dá)

2.2 各組MCF-7細(xì)胞中MAC30 mRNA表達(dá)

乳腺癌組與NC組MAC30 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與乳腺癌組和NC組相比，MAC30 shRNA組MAC30 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05）；與MAC30 shRNA組相比，ATP1A2組MAC30 mRNA表達(dá)水平升高（P<0.05）；與ATP1A2組相比，MAC30 shRNA+ATP1A2組MAC30 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05），見圖2。

圖2 各組MCF-7細(xì)胞中MAC30 mRNA表達(dá)

2.3 各組MCF-7細(xì)胞增殖活性比較

24 h、48 h、72 h及96 h時，乳腺癌組與NC組MCF-7細(xì)胞增殖活性比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與乳腺癌組和NC組相比，MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞增殖活性均降低（P<0.05）；MAC30 shRNA組與ATP1A2組細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比，MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞增殖活性降低（P<0.05），見圖3。

圖3 各組MCF-7細(xì)胞增殖活性

2.4 各組MCF-7細(xì)胞焦亡率比較

MAC30 shRNA及ATP1A2質(zhì)粒均可以誘發(fā)MCF-7細(xì)胞形態(tài)改變，主要體現(xiàn)在細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞顆粒增多及大量焦亡。細(xì)胞之間連接較少，以MAC30 shRNA+ATP1A2組最佳，培養(yǎng)液出現(xiàn)大量細(xì)胞懸浮，見圖4a。乳腺癌組與NC組MCF-7細(xì)胞焦亡率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與乳腺癌組和NC組比較，MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組MCF-7細(xì)胞焦亡率均升高，其中MAC30 shRNA+ATP1A2組最高，而MAC30 shRNA組與ATP1A2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4b。

圖4 各組MCF-7細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞焦亡率比較

2.5 各組MCF-7細(xì)胞血管形成數(shù)目比較

乳腺癌組與NC組細(xì)胞血管形成數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與乳腺癌組和NC組相比，MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目減少（P<0.05），MAC30 shRNA組與ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比，MAC30 shRNA+ATP1A2組細(xì)胞血管形成數(shù)目減少（P<0.05），見圖5。

圖5 各組MCF-7細(xì)胞血管形成比較（ ×200）

2.6 各組MCF-7細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比較

乳腺癌組與NC組細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與乳腺癌組和NC組相比，MAC30 shRNA組、ATP1A2組及MAC30 shRNA+ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平降低（P<0.05）；MAC30 shRNA組與ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與MAC30 shRNA組和ATP1A2組相比，MAC30 shRNA+ATP1A2組ATP1A2、SCr、AKT及PI3K表達(dá)水平降低（P<0.05），見圖6。

圖6 各組MCF-7細(xì)胞ATP1A2、SCr、AKT及PI3K水平比較

3 討論

乳腺癌是我國發(fā)病率居首位的惡性腫瘤[8]。研究其治療機(jī)制對于提高臨床治療效果、延長患者預(yù)后具有重要作用。本研究通過觀察下調(diào)MAC30對乳腺癌細(xì)胞焦亡、血管生成及ATP1A2蛋白水平的影響，為乳腺癌的治療提供參考。

MAC30是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族成員之一，位于染色體17q11.2，具有調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)活性的作用[9]。MAC30在人體內(nèi)（包括肝細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等）廣泛分布，在某些癌細(xì)胞和癌組織中也有表達(dá)[10]。MAC30在不同惡性腫瘤中的表達(dá)存在差異，如在胰腺癌[11]中呈低表達(dá)，而在胃癌[11]、結(jié)腸癌[11]及卵巢癌[12]中呈高表達(dá)。MAC30可能參與乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。乳腺癌組織中MAC30的表達(dá)高于正常組織。此外，腫瘤細(xì)胞表面的MAC30與癌細(xì)胞的浸潤能力和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。因此，MAC30也被認(rèn)為是開發(fā)抗腫瘤藥物的一個潛在靶點。在乳腺癌中MAC30過表達(dá)可被乳腺癌易感基因1(breast cancer1,BRCA1)誘導(dǎo)后突變，進(jìn)而加快疾病進(jìn)展。MAC30作為細(xì)胞內(nèi)孤兒受體，可與sigma2受體結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞生長及分化[13]。本研究結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)MAC30可抑制癌細(xì)胞增殖，加快焦亡。有研究證實，在胃癌細(xì)胞中抑制MAC30可降低蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/AKT磷酸化及細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)活化，進(jìn)而降低胃癌細(xì)胞活性，推測MAC30表達(dá)與腫瘤細(xì)胞活性相關(guān)[14]。細(xì)胞焦亡作為細(xì)胞程序性死亡的方式之一，當(dāng)細(xì)胞焦亡發(fā)生時GSDMD活性升高，可通過促進(jìn)細(xì)胞膜裂解而加快腫瘤細(xì)胞死亡[15]。下調(diào)MAC30可加快癌細(xì)胞焦亡，推測機(jī)制為抑制MAC30后磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/AKT受到抑制，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞焦亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

當(dāng)腫瘤體積較小時，由于腫瘤細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣等的需求量相對較低，可以通過彌散方式從周圍組織中攝取所需的營養(yǎng)物質(zhì)。但當(dāng)腫瘤體積增大到一定程度時，彌散方式無法滿足腫瘤細(xì)胞的需求，腫瘤細(xì)胞就會陷入缺氧狀態(tài)。為了維持生長，腫瘤細(xì)胞開始釋放一系列生長因子（如VEGF等）來刺激周圍血管的生長和形成[16]。乳腺癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)激活可加快VEGF表達(dá)，進(jìn)而加快細(xì)胞侵襲，誘導(dǎo)腫瘤血管形成[17-18]。本研究結(jié)果表明，下調(diào)MAC30可抑制乳腺癌細(xì)胞血管生成，從而抑制腫瘤生長，阻止疾病發(fā)展。MAC30雖然為IGF家族成員之一，但與IGF-1并不完全相同。MAC30在乳腺癌細(xì)胞中與IGF-1的表達(dá)水平一致。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，IGF-1的表達(dá)水平升高，并通過激活下游PI3K/AKT等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[19-20]。在乳腺癌細(xì)胞中IGF-1表達(dá)升高并參與腫瘤血管生成，因此推測下調(diào)MAC30可以抑制IGF-1活性，降低腫瘤組織中VEGF表達(dá)，減少血管形成數(shù)目，從而改善病情。本研究結(jié)果表明，下調(diào)MAC30后對ATP1A2活性具有調(diào)節(jié)作用，可以抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

ATP1A2是一個編碼鈉鉀泵α2亞基的基因，在細(xì)胞膜上扮演著重要的離子輸送功能?，F(xiàn)階段，隨著對ATP1A2基因研究的深入，其被認(rèn)為與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)系。有研究表明，ATP1A2在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且ATP1A2高表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后往往不佳[21]。ATP1A2對腫瘤細(xì)胞生物活性具有調(diào)控作用。有研究表明，上調(diào)ATP1A2可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而對其抑制后則能夠減少乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。本研究推測在乳腺癌中，MAC30的過表達(dá)可以調(diào)節(jié)SCr/PI3K/AKT通路的活性，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲，相反的抑制MAC30可能降低SCr/PI3K/AKT信號通路表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用。本研究表明下調(diào)MAC30可以抑制ATP1A2、SCr、PI3K、AKT表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞生長，減少血管生成，加快焦亡。

綜上所述，下調(diào)MAC30可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及血管生成，加快焦亡，其機(jī)制與抑制ATP1A2表達(dá)相關(guān)。但本研究未進(jìn)行動物相關(guān)實驗，關(guān)于MAC30調(diào)節(jié)ATP1A2的相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。