蔡 婷,梁文菲,李瑩瑩,肖 慧,楊千培,胡愛琳,柳 維,熊 武

糖尿病是一種由多種病因引起持續(xù)慢性高血糖的代謝性疾病,其血管病變與高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞過早衰老和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitors cells,EPCs)功能失調(diào)有關(guān)。EPCs是一種骨髓來源的血管干細(xì)胞,能分化成內(nèi)皮細(xì)胞,具有修復(fù)內(nèi)皮和促進(jìn)血管生成的作用[1]。持續(xù)高血糖會導(dǎo)致機體EPCs數(shù)量減少,同時造成血管生成功能受損,從而推動糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[2]。據(jù)此,恢復(fù)體內(nèi)EPCs的數(shù)量和功能,促進(jìn)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和血管新生,是防治糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵。人參皂苷Rg1是中藥人參的主要生物活性成分,有研究表明,人參皂苷Rg1能通過減輕胰島素抵抗發(fā)揮降血糖的作用,可以用于緩解糖尿病及其血管并發(fā)癥。目前研究證實人參皂苷Rg1能通過促進(jìn)EPCs增殖發(fā)揮促進(jìn)血管再生的作用[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[4-5]、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal derived factor-1α,SDF-1α)[6]、血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)[7]、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)[8-9]是與血管生成相關(guān)的生長因子。然而人參皂苷Rg1對高糖誘導(dǎo)損傷的EPCs生物學(xué)功能修復(fù)及對分泌VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2的影響鮮有報道。故本研究將通過分離人EPCs,探討人參皂苷Rg1干預(yù)下對高糖誘導(dǎo)損傷EPCs生物學(xué)功能及分泌VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 人參皂苷Rg1(純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司,貨號:B21057);EGMTM-2MV培養(yǎng)基(美國Lonza公司,貨號:CC-3162);青霉素-鏈霉素雙抗溶液(南京凱基生物科技有限公司,貨號:KGY002);DMEM/F12培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液(美國Hyclone公司,貨號:SH30023.01B、SH30256.01B);胎牛血清(美國GIBCO公司,貨號:10270-106);胰酶(美國GIBCO公司,貨號:15050-057);乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)購自北京博蕾德生物科技有限公司(濃度:10 mg/L);荊豆凝集素(FITC-UEA-I)購自美國Sigma公司(貨號:L-9006);Anti-CD31抗體、山羊抗兔IgG(FITC)(英國Abcam公司,貨號:ab28364、ab6717);細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號:C0037);Matrigel基質(zhì)凝膠(美國Becton Dickson公司);VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司(貨號:JL18341、JL13740、JL10166、JL13552)。

1.2 儀器與器材 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司,型號:SW-CJ-1FD);熒光顯微鏡[同舟同德(北京)儀器儀表有限公司,型號:Olympus-BX51];二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司,型號:XD-101);96孔板(美國Corning公司,型號:3590);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Fisher公司,型號:5111918);生物倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:BX51);臺式低速離心機、4 ℃離心機(德國Eppendorf公司,型號:5804、5415R);振蕩器(上海滬西分析儀器廠,型號:WH-2)。

1.3 實驗方法

1.3.1 EPCs的分離培養(yǎng)與鑒定 取得足月健康新生兒的臍帶血(在獲得產(chǎn)婦及其家屬同意并簽署知情同意書的情況下進(jìn)行標(biāo)本采集,已獲得本院倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號:HN-LL-KY-2020-013-01),經(jīng)密度梯度離心后獲得單個核細(xì)胞,在EGMTM-2MV培養(yǎng)基中進(jìn)行計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度后將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先包被纖維連接蛋白的6孔板中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合率達(dá)到90%后,采用胰酶消化按1∶3進(jìn)行傳代。

參考胰酶消化法、免疫磁珠分選法[10]、FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL雙熒光染色法[11-12],推測能夠同時攝取Dil-Ac-LDL與結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞則被認(rèn)為是正在分化的EPCs,與EPCs的生長形態(tài)相符,并具備EPCs的表面標(biāo)志和功能特征。因此,本研究基于EPCs能夠同時攝取Dil-Ac-LDL并結(jié)合FITC-UEA-I則被認(rèn)為是正在分化的EPCs的原理,以及參考CD31作為EPCs的主要表面標(biāo)志物也在鑒定中作為參考指標(biāo)。采用CD31免疫磁珠分選法、FITC-UEA-1聯(lián)合Dil-Ac-LDL雙熒光染色法共同鑒定EPCs。

1.3.2 EPCs分組及處理 使用含30 mmol/L濃度葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d來制備高糖受損EPCs模型。將高糖受損EPCs隨機分為實驗組、模型組,實驗組用最佳質(zhì)量濃度的人參皂苷Rg1處理,模型組用等體積的PBS處理模型組。正常組EPCs用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后再用等體積PBS處理。

1.3.3 人參皂苷Rg1對高糖受損EPCs生物學(xué)功能的影響

1.3.3.1 人參皂苷Rg1處理高糖受損EPCs最佳濃度的選擇 于96孔板中接種增殖活躍的EPCs,分別使用0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L的人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù)。用胰蛋白酶消化貼壁EPCs,使其脫落,對細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)后,將EPCs鋪在24孔板上,置于37 ℃,5%CO2孵育箱中培養(yǎng)9 h后,將EPCs接種在大鼠纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板中,37 ℃培養(yǎng)30 min,用隨機200倍視野對貼壁EPCs進(jìn)行計數(shù),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測EPCs存活率,以確定人參皂苷Rg1促進(jìn)EPCs增殖的最佳濃度。

1.3.3.2 增殖能力檢測 取對數(shù)生長期EPCs,胰酶消化,離心,計數(shù),并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度。將EPCs按照每孔1×105個細(xì)胞分于96孔板中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁生長后,收集指數(shù)生長期EPCs,于96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液,并將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。實驗組使用最佳濃度人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù),模型組和正常組加入等體積PBS,并向每孔中加入CCK-8溶液10 μL,孵育4 h后,使用酶標(biāo)儀測定各組在450 nm處的吸光度(OD)。

1.3.3.3 黏附能力檢測 取貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化,將處理后的細(xì)胞離心重懸,將制成的懸液置于500 μL培養(yǎng)液中并計數(shù)。取EPCs平鋪于24孔板中,置于37 ℃、5%CO2的恒溫箱中孵育1 h,實驗組用40 mg/L人參皂苷Rg1干預(yù),模型組和正常組用等體積PBS干預(yù),各培養(yǎng)8 h后,將接種了干預(yù)后EPCs的大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板放在37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min,在顯微鏡下用200倍視野隨機觀察、計數(shù)。

1.3.3.4 成血管能力檢測 將Matrigel基質(zhì)膠過夜溶解,次日用M200無血清及生長因子補充物的培養(yǎng)基1∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠并加入12孔板中,在37 ℃孵箱中放置30 min。將增殖期的EPCs用胰酶處理后,重懸離心并調(diào)整重懸液密度,將重懸液轉(zhuǎn)入12孔板中培養(yǎng),取貼壁細(xì)胞,實驗組用40 mg/L人參皂苷Rg1干預(yù),模型組和正常組采用等體積PBS干預(yù),然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培育24 h,在顯微鏡下隨機選取4個視野觀察、拍照,計算小管形成長度并取平均值。

1.3.3.5 遷移能力檢測 用黑色馬克筆在6孔板背后用橫劃線進(jìn)行標(biāo)記,橫穿過每個孔,每孔間隔1 cm之間劃一橫、兩豎線,保證每個孔上至少有5條線通過。在每個孔中分別加入約5×105個處于增殖生長期的EPCs,用無菌200 μL槍頭在預(yù)移植培養(yǎng)1 d后的培養(yǎng)細(xì)胞孔底部孔板中央分別劃一橫、兩豎線痕跡,用PBS液體洗去底部脫落的EPCs。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)分別含有40 mg/L人參皂苷Rg1和PBS液體處理過的兩種無血清M199完全培養(yǎng)基。在倒置顯微鏡(×200)下攝像,記為0時,利用顯微標(biāo)尺選擇兩個不同視野,分別測量0 h、48 h的劃痕創(chuàng)傷面積和邊距,以遷移寬度表示細(xì)胞遷移能力。

1.3.3.6 血管生成相關(guān)生長因子檢測 實驗組采用40 mg/L的人參皂苷Rg1干預(yù)48 h,模型組、正常組均采用相等含量PBS上清液進(jìn)行干預(yù)48 h。將抗體細(xì)胞液和上清液先后進(jìn)行二次收集,再先后加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、緩沖液,進(jìn)行抗體稀釋并綜合檢測各種抗體后進(jìn)行振蕩,室溫培養(yǎng)1.5 h,將磷酸辣根酶和過氧化物水解酶合成標(biāo)記后的鏈霉親和素抗體進(jìn)行稀釋,振蕩后在室溫培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)30 min,最后加入細(xì)胞終止液和顯色底物硼酸三甲酯(TMB),在15 min之內(nèi),使用酶標(biāo)儀測定各組上清液中VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2在450 nm處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度(pg/mL)。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的分離和培養(yǎng) EPCs培養(yǎng)7 d后,細(xì)胞呈集落分布的鵝卵石樣。詳見圖1。

圖1 EPCs培養(yǎng)第7天形態(tài)圖(×200)

2.2 EPCs的鑒定 EPCs被CD31免疫熒光抗體標(biāo)記后細(xì)胞膜呈綠色,EPCs攝取DAPI后細(xì)胞核呈藍(lán)色改變,融合圖像顯示EPCs細(xì)胞膜呈綠色熒光改變,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光改變(見圖2)。EPCs結(jié)合FITC-UEA-I呈綠色熒光標(biāo)記改變,EPCs攝取Dil-Ac-LDL呈紅色熒光標(biāo)記改變,雙熒光染色后呈橙黃色改變(見圖3)。

圖2 CD31抗體聯(lián)合DAPI核染鑒定結(jié)果(熒光鏡,×400)

圖3 熒光染色鑒定結(jié)果(熒光鏡,×400)

2.3 人參皂苷Rg1對高糖誘導(dǎo)損傷EPCs增殖的影響 隨著人參皂苷Rg1濃度的增加,EPCs細(xì)胞增殖活力逐漸增高。當(dāng)人參皂苷Rg1濃度為40 mg/L時,EPCs細(xì)胞增殖活力最高,而在80 mg/L后,隨著人參皂苷Rg1濃度的逐漸增高,EPCs細(xì)胞增殖活力隨之降低(見圖4),基于此,本實驗選擇促進(jìn)EPCs增殖的最佳質(zhì)量濃度40 mg/L人參皂苷Rg1進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 不同濃度人參皂苷Rg1對高糖誘導(dǎo)損傷EPCs增殖活力的影響

2.4 人參皂苷Rg1對高糖誘導(dǎo)損傷EPCs增殖、黏附、成管及遷移能力的影響 與正常組相比,模型組中高糖誘導(dǎo)損傷EPCs增殖能力、黏附能力、成管能力明顯減弱,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,實驗組在40 mg/L人參皂苷Rg1干預(yù)后,其增殖、黏附、成管、遷移的功能明顯增強,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖5～圖7和表1。

表1 人參皂苷Rg1對高糖環(huán)境下EPCs生物學(xué)功能的影響

圖5 人參皂苷Rg1對高糖受損的EPCs黏附生物學(xué)功能的影響(×200)

圖6 人參皂苷Rg1對高糖受損的EPCs成管生物學(xué)功能的影響(×200)

圖7 人參皂苷Rg1對高糖受損的EPCs遷移的影響(×200)

2.5 人參皂苷Rg1對高糖環(huán)境下EPCs分泌血管生成相關(guān)生長因子的影響 與正常組比較,模型組EPCs分泌VEGF、SDF-1α、Ang-1明顯減少,而MMP-2的分泌增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,實驗組在40 mg/L人參皂苷Rg1干預(yù)后,EPCs分泌VEGF、SDF-1α、Ang-1明顯增加,而MMP-2的分泌減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 人參皂苷Rg1對高糖環(huán)境下EPCs分泌血管生成相關(guān)生長因子的影響 單位:pg/mL

3 討 論

糖尿病是一種具有長期持續(xù)血糖升高特征的多病因代謝紊亂性疾病,嚴(yán)重影響著人類的健康。糖尿病的高血糖狀態(tài)將直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙并影響缺血組織血管新生,出現(xiàn)各種與血管新生相關(guān)的并發(fā)癥[13]。而EPCs是一種能夠分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的專能干細(xì)胞,在缺血等造成血管損傷的環(huán)境中,EPCs從骨髓遷移到缺血部位,合并到新形成的毛細(xì)血管中,并刺激代償性血管生成[14]。EPCs移植已經(jīng)成為治療缺血性疾病的一種實驗性療法。目前研究表明,EPCs在血管生成和維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起重要作用[14-15]。然而糖尿病所致的高糖環(huán)境將直接導(dǎo)致循環(huán)EPCs減少和功能受損[16]。糖尿病狀態(tài)下的高血糖主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧積累,從而減少EPCs數(shù)量,損害EPCs功能,而降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平可能成為恢復(fù)糖尿病EPCs功能的有效途徑。糖尿病病人即使血糖水平得到控制且平穩(wěn)后,體內(nèi)EPCs數(shù)量減少和功能受損仍然持續(xù)存在,這為臨床上糖尿病血管并發(fā)癥的防治帶來了挑戰(zhàn)。

人參皂苷Rg1作為中藥人參的主要活性成分之一,可通過抑制凋亡相關(guān)蛋白[17]、下調(diào)炎癥介質(zhì)[18]和抗氧化等多種機制發(fā)揮降血糖及減輕胰島素抵抗作用,因此,人參皂苷Rg1可以用于緩解糖尿病及治療糖尿病血管相關(guān)并發(fā)癥。另有研究證實人參皂苷Rg1可促進(jìn)EPCs增殖和血管生成,從而促進(jìn)糖尿病大鼠足潰瘍愈合[19-20]。與本研究發(fā)現(xiàn)的人參皂苷Rg1能改善高糖受損EPCs的生物學(xué)功能相吻合。人參皂苷Rg1可明顯提高高糖誘導(dǎo)損傷EPCs的遷移、成管、增殖及黏附功能,提示人參皂苷Rg1可以明顯改善高糖誘導(dǎo)損傷EPCs的生物學(xué)功能障礙。蔣文捷等[3]的研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1能保護(hù)過氧化氫誘導(dǎo)損傷的大鼠骨髓來源的EPCs,其機制可能與蛋白激酶B(Akt)介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。由此,人參皂苷Rg1發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮生物學(xué)功能的作用可能與抑制其氧化應(yīng)激相關(guān)。

VEGF是一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的細(xì)胞因子,具有高度特異性。王麗萍等[4]研究證實,高糖作用下人EPCs的活力明顯下降及VEGF表達(dá)量明顯減少。魏英等[5]研究發(fā)現(xiàn),人參總皂苷有促進(jìn)血管新生從而改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用,其機制可能與上調(diào)心肌組織VEGF基因表達(dá)密切相關(guān)。SDF-1α是屬于趨化因子蛋白家族的小分子的細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)EPCs遷移從而促進(jìn)體內(nèi)EPCs介導(dǎo)血管生成[6]。Ang-1作為一種具有強大血管生成活性的堿性蛋白質(zhì),主要存在于正常血漿及實體瘤組織。方濤等[7]研究證實負(fù)載Ang-1的納米微粒心肌局部注射可使心肌梗死區(qū)域血管增生。MMP-2是一種分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的明膠酶,在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期,即新生血管發(fā)生之前,能促使視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8-9]?？梢姶龠M(jìn)EPCs分泌VEGF、SDF-1α、Ang-1,抑制EPCs分泌MMP-2,可成為促進(jìn)血管新生、抑制高糖環(huán)境所致慢性難愈性創(chuàng)面愈合的有效治療方式之一。本研究發(fā)現(xiàn),高糖環(huán)境下EPCs中VEGF、SDF-1α、Ang-1的表達(dá)水平明顯下降,MMP-2的表達(dá)水平升高,而予以人參皂苷Rg1干預(yù)后能明顯提高高糖受損EPCs關(guān)于VEGF、SDF-1α、Ang-1的表達(dá),降低MMP-2的表達(dá),提示人參皂苷Rg1可通過調(diào)節(jié)VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2的表達(dá)改善高糖受損EPCs生物學(xué)功能。然而本實驗僅是離體細(xì)胞實驗,未模擬體內(nèi)具體環(huán)境,仍然存在一定的局限性,人參皂苷Rg1改善高糖受損EPCs生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)VEGF、SDF-1α、Ang-1、MMP-2分泌的具體機制有待在體內(nèi)外水平進(jìn)一步探索。