李宇鹍 劉欣 王榮 沈茜 丁雪麗 田字彬

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,山東 青島 266003; 2 濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院)

高尿酸血癥是一種常見(jiàn)代謝性疾病,由嘌呤代謝失調(diào)引起[1］。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中,尿酸通過(guò)尿酸氧化酶轉(zhuǎn)化為更容易溶解的尿囊素排出體外。然而尿酸氧化酶基因在人類和類人猿的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了沉默突變,因此人類易患高尿酸血癥[2］。

人體尿酸主要通過(guò)腎臟途徑和腸道等腎外途徑進(jìn)行排泄,其中腎臟排泄約占70%,腸道排泄約占30%[3-4］。尿酸的腸道排泄依賴于完整的腸道屏障及其維持的腸道穩(wěn)態(tài)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高尿酸血癥模型小鼠糞便中短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量明顯降低,可能存在有腸道黏膜屏障的損傷[5-6］。SCFAs是由特定的厭氧菌發(fā)酵膳食纖維和抗性淀粉等產(chǎn)生,在調(diào)節(jié)能量代謝、免疫、腸道發(fā)育方面有重要作用[7］。SCFAs主要為乙酸、丙酸和丁酸,其中丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞最主要的能量來(lái)源,直接影響腸細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,對(duì)維持腸黏膜的健康和完整有重要意義[8］。研究表明丁酸鈉能夠調(diào)節(jié)脂肪性肝炎小鼠的腸道菌群,保護(hù)腸道屏障,從而減輕小鼠的脂肪性肝炎[9］。本研究旨在探討丁酸鈉對(duì)高尿酸血癥模型小鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用及機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

SPF級(jí)6周齡雄性C57BL/6小鼠24只,體質(zhì)量18～23 g,來(lái)自山東省痛風(fēng)實(shí)驗(yàn)室。氧嗪酸鉀(美國(guó)Sigma公司);丁酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);BCA蛋白濃度試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);ZO-1兔單克隆抗體(英國(guó)Abcom公司);Occludin兔單克隆抗體(Servicebio);GAPDH、Tublin鼠單克隆抗體(上海愛(ài)必信生物科技有限公司);ELISA試劑盒、超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)底物液(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組和處理C57BL/6小鼠于24 ℃、濕度50%、標(biāo)準(zhǔn)12-12 h晝夜節(jié)律環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、丁酸鈉組,每組8只。模型組每天腹腔注射氧嗪酸鉀250 mg/kg,并自由取食高酵母飼料,制備高尿酸血癥模型[10］,丁酸鈉組小鼠在模型組飼養(yǎng)基礎(chǔ)上每天灌胃丁酸鈉200 mg/kg,對(duì)照組每天腹腔注射和灌胃等劑量生理鹽水,共干預(yù)21 d。

1.2.2樣本采集和制作 在干預(yù)的第7天,所有小鼠腹腔均注射氧嗪酸鉀1 h以后,于內(nèi)眥靜脈取血0.5 mL,檢測(cè)血尿酸水平,以判斷高尿酸血癥小鼠模型是否成功。第21天時(shí),記錄所有小鼠體質(zhì)量,并收集小鼠新鮮糞便,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后CO2法處死,處死12 h前禁食,取所有小鼠小腸組織,置于液氮中,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取各組小鼠小腸組織0.5 cm,以40 g/L多聚甲醛固定后,經(jīng)脫水、包埋、透明、切片等步驟,制作成4 μm厚的病理切片。HE染色顯微鏡下觀察小腸組織病理改變。

1.2.3Western blot方法檢測(cè)各組小鼠腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá) 提取所有小鼠小腸組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%分離膠、5%濃縮膠,將玻璃板固定在電泳槽上,先80 V后120 V恒壓電泳,290 mA恒流濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。完成以后,用抗體稀釋液按說(shuō)明書(shū)稀釋一抗(ZO-1、Occludin 1∶1 000稀釋,Tublin、GAPDH 1∶5 000稀釋),將一抗完全浸潤(rùn)PVDF膜后置于4 ℃搖床孵育過(guò)夜,使用與一抗相對(duì)應(yīng)的稀釋過(guò)的二抗(1∶15 000稀釋)室溫孵育PVDF膜1.5 h,ECL化學(xué)顯影,暗室曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,用Image J軟件分析條帶灰度值,目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計(jì)算。

1.2.4免疫組化檢測(cè)小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá) 取所有小鼠小腸組織切片,烘烤2 h后二甲苯脫蠟,復(fù)水;用TRIS-EDTA修復(fù)抗原3 min;用體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2-甲醇溶液在暗匣中避光室溫孵育10 min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;以體積分?jǐn)?shù)0.10的羊血清37 ℃下孵育30 min,封閉非特異性抗原;滴加一抗(ZO-1 1∶100稀釋,Occludin 1∶500稀釋),濕盒內(nèi)4 ℃下孵育過(guò)夜;滴加二抗,37 ℃下孵育30 min,DAB顯色5～10 min;蘇木素復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)脂封片。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取不重疊的視野5個(gè),采用Image Pro-Plus 6.0進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果分析,免疫組化ZO-1和Occludin蛋白染色陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)棕黃色,分離色彩后選取黃色部分,測(cè)定陽(yáng)性顆粒積分吸光度和陽(yáng)性表達(dá)面積。

1.2.5RT-qPCR方法檢測(cè)小鼠腸組織中ZO-1和OccludinmRNA表達(dá) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用RNAiso Plus從所有小鼠小腸組織中提取總RNA。用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒,去除gDNA,將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin作為內(nèi)參照,進(jìn)行 RT-qPCR。每個(gè)樣品分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。RT-qPCR擴(kuò)增條件為,94 ℃預(yù)變性5 min;然后95 ℃變性3 s,60 ℃退火/延伸30 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,引物名稱及序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 引物名稱及其序列

2 結(jié) 果

2.1 模型組小鼠血清尿酸和糞便丁酸含量水平

當(dāng)灌胃至第7天時(shí),對(duì)照組和模型組小鼠的血清中尿酸水平分別為(110.35±18.33)、(353.18±57.32)μmol/L,兩組差異有顯著意義(t=9.95,P<0.05),提示高尿酸血癥小鼠模型建立成功。灌胃第21天時(shí),對(duì)照組和模型組小鼠糞便中丁酸含量分別為(217.90±78.15)、(29.75±9.24)μg/g,兩組小鼠比較差異顯著(t=4.78,P<0.05),表明高尿酸血癥小鼠糞便丁酸含量降低,小鼠可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量變化

干預(yù)期間3組小鼠均毛色黑亮,精神狀態(tài)、行動(dòng)力正常,整體狀態(tài)良好。干預(yù)結(jié)束時(shí),對(duì)照組、模型組和丁酸鈉組小鼠的體質(zhì)量分別為(21.56±0.83)、(20.33±0.36)、(21.66±0.95)g,3組小鼠體質(zhì)量比較差異有顯著性(F=4.70,P<0.05),其中模型組比對(duì)照組體質(zhì)量顯著降低(t=3.03,P<0.05),丁酸鈉組與模型組相比體質(zhì)量顯著升高(t=2.90,P<0.05)。

2.3 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA表達(dá)水平

3組小鼠小腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)量比較差異均具有顯著意義(F=13.65、51.42,P<0.05),其中模型組與對(duì)照組、丁酸鈉組2種mRNA表達(dá)量比較差異均具有顯著意義(t=2.55～11.04,P<0.05),見(jiàn)圖1。

3組小鼠小腸組織中ZO-1、OccludinmRNA表達(dá)量比較差異均有顯著性(F=6.07、10.63,P<0.05),其中模型組與對(duì)照組、丁酸鈉組2種mRNA表達(dá)量比較差異均具有顯著性(t=3.72～5.12,P<0.05),見(jiàn)表2。

免疫組化染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組小鼠相比,模型組小鼠小腸組織ZO-1以及Occludin蛋白陽(yáng)性染色面積和強(qiáng)度降低,丁酸鈉組小鼠小腸組織ZO-1和Occludin蛋白陽(yáng)性染色面積和強(qiáng)度均高于模型組,見(jiàn)圖2。

2.4 各組小鼠小腸組織病理改變比較

顯微鏡下觀察顯示,對(duì)照組小鼠小腸上皮結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)明顯病理?yè)p傷;模型組小鼠小腸局部上皮脫落、絨毛大量減少、斷裂;丁酸鈉組小腸上皮相對(duì)完整,絨毛輕度斷裂,見(jiàn)圖3。

圖1 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)情況

表2 各組小鼠的小腸組織中ZO-1和Occludin的蛋白和mRNA表達(dá)情況

圖2 各組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色,400倍)

圖3 各組小鼠小腸組織病理改變(HE染色,400倍)

2.5 各組小鼠小腸組織中TNF-α、IL-6水平比較

對(duì)照組、模型組、丁酸鈉組小鼠的小腸組織當(dāng)中TNF-α的水平分別為(62.40±13.33)、(190.56±53.02)、(57.40±9.88)ng/L,小腸組織當(dāng)中IL-6的水平分別為(309.80±40.03)、(801.39±113.88)、(310.54±45.92)ng/L。3組小鼠小腸組織TNF-α、IL-6水平比較差異均有顯著意義(F=80.15、26.29,P<0.05),其中模型組與對(duì)照組、丁酸鈉組,小鼠小腸組織中2種炎癥因子水平比較差異均具有顯著意義(t=5.74～9.79,P<0.05)。

3 討 論

高尿酸血癥可以促進(jìn)糖尿病、代謝綜合征、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和慢性腎臟病等疾病的發(fā)生和發(fā)展[11］。流行病學(xué)調(diào)查顯示,高尿酸血癥患病率逐年上升,如愛(ài)爾蘭男性高尿酸血癥發(fā)病率為19.7%～25.0%,女性發(fā)病率為20.5%～24.1%[12］;中國(guó)女性高尿酸血癥的發(fā)病率為7.9%,男性為19.4%,高尿酸血癥已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[13-14］。而高尿酸血癥患者是否存在腸道屏障損傷,目前還缺少明確研究報(bào)道,僅有少量研究表明高尿酸血癥可能會(huì)引起腸道炎癥和腸道生態(tài)失衡,從而影響腸道屏障的功能[15］。人體中的尿酸約有30%是通過(guò)腸道排泄的,腸道對(duì)尿酸的排泄發(fā)揮著重要作用,近年來(lái)尿酸的腸道排泄與腸道菌群的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)之一。促進(jìn)尿酸的腸道排泄,可減輕高尿酸血癥患者腎臟排泄負(fù)擔(dān),防止和減緩因高尿酸血癥導(dǎo)致的慢性腎功能不全。腸道屏障由腸上皮與細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成[16-18］,ZO-1和Occludin是2種重要的緊密連接蛋白,對(duì)于維持腸道屏障的完整性發(fā)揮著重要的作用[16,19］。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠小腸組織存在小腸絨毛斷裂、稀疏和腸上皮損傷,小腸組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組小鼠,同時(shí)模型組小鼠小腸炎癥因子TNF-α和IL-6水平明顯高于對(duì)照組,提示高尿酸血癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與腸道屏障功能受損有關(guān),高尿酸可增加腸道炎癥反應(yīng)及誘發(fā)腸道屏障功能損傷。

SCFAs是小腸內(nèi)難以消化的碳水化合物經(jīng)腸道微生物發(fā)酵的最終產(chǎn)物,丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量的底物,可促進(jìn)腸道緊密連接蛋白表達(dá),從而起到維護(hù)腸道屏障完整性的作用[20］。SCFAs可能通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng),加強(qiáng)腸道緊密連接,調(diào)節(jié)腸道菌群,維持腸道屏障功能發(fā)揮有益影響[20-21］。同時(shí)SCFAs對(duì)腸道微生物群具有調(diào)節(jié)和改善作用,可抑制有害菌增殖并增加有益菌的數(shù)量[22］。腸道絨毛的高度是衡量小腸結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)之一。本研究顯示模型組小鼠糞便中丁酸含量顯著降低,給予丁酸鈉干預(yù)后,丁酸鈉組小鼠小腸病理?yè)p傷較模型組明顯減輕,提示丁酸鈉可保護(hù)小腸上皮的完整性及維護(hù)腸道屏障。有研究表明腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白在腸黏膜屏障完整性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,當(dāng)緊密連接蛋白出現(xiàn)表達(dá)異常,會(huì)導(dǎo)致腸道通透性的增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生[23-24］。本研究顯示丁酸鈉組小鼠小腸組織中的ZO-1以及Occludin的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組小鼠,免疫組化結(jié)果顯示丁酸鈉組小鼠小腸組織中ZO-1和Occludin的陽(yáng)性染色面積和強(qiáng)度均高于模型組小鼠,提示丁酸鈉可能通過(guò)增加腸上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)保護(hù)高尿酸血癥引起的腸道屏障損害。

炎癥因子增加可導(dǎo)致上皮功能及腸道屏障損傷,細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致腸黏膜通透性增強(qiáng)、免疫功能障礙以及菌群失調(diào),引起腸屏障功能障礙[25-26］。有研究顯示高尿酸血癥患者的炎癥細(xì)胞因子水平升高[27］。本研究結(jié)果顯示,丁酸鈉組小鼠小腸組織中TNF-α和IL-6水平明顯低于模型組小鼠,提示炎癥因子水平與腸上皮緊密連接功能障礙相關(guān),丁酸鈉可能通過(guò)抑制腸道的炎癥反應(yīng)來(lái)維護(hù)腸道屏障。

綜上所述,通過(guò)腹腔注射氧嗪酸鉀聯(lián)合高酵母飼料可成功構(gòu)建小鼠高尿酸血癥模型,且高尿酸血癥模型小鼠小腸存在腸道屏障損傷;丁酸鈉灌胃治療可以上調(diào)小鼠小腸緊密連接蛋白表達(dá),減輕腸道炎癥,從而發(fā)揮對(duì)腸道屏障的保護(hù)作用。本研究為丁酸鈉治療高尿酸血癥及痛風(fēng)提供了理論依據(jù),但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(文件號(hào)AH-QU-MAL20210430)。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

作者聲明：田字彬、李宇鹍、劉欣、王榮參與了研究設(shè)計(jì);李宇鹍、沈茜、丁雪麗參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。