王雨 王鑫偉 劉洋 劉楚涵 錢怡云 宋萍萍 韋敏

摘要

為尋找環(huán)境友好型的農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，利用菌絲生長速率法研究了粉防己中漢防己甲素對常見植物病原真菌的抑制活性，結(jié)果表明，漢防己甲素對5種常見植物病原真菌均有抑制作用，對立枯絲核菌的抑制作用最強，EC50為33.49?mg/L;對串珠鐮孢和瓜類黑腐球殼菌的EC50分別為41.71?mg/L和43.97?mg/L，抑制活性優(yōu)于對照植物源藥劑蛇床子素;對灰葡萄孢的抑制活性與蛇床子素相當(dāng)。接種藍(lán)莓離體葉片的試驗結(jié)果表明，漢防己甲素對藍(lán)莓灰霉病具有治療和保護作用且作用效果與對照藥劑蛇床子素基本相當(dāng);激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)漢防己甲素可降低灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子濃度，漢防己甲素分別與CaCl2及鈣通道阻滯劑維拉帕米兩者相互作用可降低灰葡萄孢對各藥劑的敏感性，表明其作用機制與鈣離子及鈣離子通道有關(guān)。本文首次報道漢防己甲素對5種植物病原真菌的抑制作用及其作用機制，為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

漢防己甲素;?植物病原真菌;?灰葡萄孢;?鈣離子;?鈣離子通道

中圖分類號：

S?482.292

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?B

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022343

Inhibitory?effect?of?tetrandrine?on?five?plant?pathogens?and?its?mechanism?on?Botrytis?cinerea

WANG?Yu1，?WANG?Xinwei1，?LIU?Yang1，?LIU?Chuhan2，?QIAN?Yiyun1，?SONG?Pingping1*，?WEI?Min1*

（1.?Jiangsu?Key?Laboratory?for?the?Research?and?Utilization?of?Plant?Resources，?Institute?of?Botany，?Jiangsu?Province?and

Chinese?Academy?of?Sciences，?Nanjing?210014，?China;?2.?Nanjing?University?of?Chinese?Medicine，?Nanjing?210023，?China）

Abstract

In?order?to?search?for?more?effective?environmentfriendly?fungicide?lead?compounds，?sensitivity?of?tetrandrine?on?five?plant?pathogens?were?determined?by?mycelium?growth?rate?method.?The?results?showed?that?tetrandrine?had?antifungal?activity?against?all?tested?pathogens，?displayed?a?strong?antifungal?activity?against?Rhizoctonia?solani?isolate?（EC50=33.49?mg/L），?exhibited?a?higher?activity?against?Fusarium?moniliforme?isolate（EC50=41.71?mg/L）?and?Didymella?bryoniae?isolate（EC50=43.97?mg/L）?than?osthole，?and?showed?significant?activity?against?Botrytis?cinerea?equal?to?osthole.?The?results?of?inoculation?of?blueberry?leaves?in?vitro?showed?that?tetrandrine?had?both?therapeutic?and?protective?activities?against?gray?mold?infections，?equal?to?those?of?osthole.?Laser?confocal?microscopy?showed?that?tetrandrine?could?reduce?the?concentration?of?calcium?ions?in?the?mycelia?of?B.?cinerea，?and?the?interaction?of?tetrandrine?with?CaCl2?and?calcium?channel?blocker?verapamil?could?reduce?the?sensitivity?of?B.?cinerea?to?each?reagent，?indicating?that?the?mechanism?of?tetrandrine?against?B.?cinerea?was?related?to?Ca2+?and?Ca2+?channels.?Our?work?represents?the?first?report?of?the?antifungal?properties?of?tetrandrine?against?five?plant?pathogens?and?its?mechanism，?providing?a?theoretical?basis?for?its?further?development?and?application.

Key?words

tetrandrine;?plant?pathogens;?Botrytis?cinerea;?Ca2+;?Ca2+?channel

植物病原菌引起的植物病害嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，是農(nóng)業(yè)發(fā)展面臨的問題之一，多年來人們解決這一問題的主要方式是化學(xué)防治，但近年來化學(xué)防治帶來的食品安全、環(huán)境污染及抗藥性問題愈發(fā)突出［1］，因此亟須研發(fā)新型、安全、環(huán)保的防治藥劑及綠色防控技術(shù)。已有研究證實植物中多種天然化合物對植物病原菌具有較好的抑制作用［23］，這些化合物因作用方式特異、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境友好、對非靶標(biāo)生物相對安全等特點逐漸引起人們的關(guān)注［4］。

漢防己甲素又稱粉防己甲素，是從防己科千金藤屬植物粉防己Stephania?tetrandra?S.?Moore根莖中提取的一種生物堿，為中藥粉防己的主要活性成分之一［5］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)漢防己甲素具有心血管保護、神經(jīng)保護、抗肝纖維化、鎮(zhèn)痛、降壓、降血糖和抗自由基損傷等多種藥理作用，臨床上主要用于治療塵肺病、風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛等［56］。文獻(xiàn)報道漢防己甲素可抑制金黃色葡萄球菌Staphylococcus?aureus、大腸桿菌Escherichia?coli、白色念珠球菌Candida?albicans等細(xì)菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道?；诖耍狙芯窟x用粉防己為原料，從中提取分離得到漢防己甲素，采用菌絲生長速率法測試了其對常見植物病原真菌的抑制活性，初步探討了漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用機制，為基于天然產(chǎn)物的植物源抑菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

粉防己塊根：購自南京益豐大藥房，將塊根粉碎成粉末狀，過三號篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

供試真菌：立枯絲核菌Rhizoctonia?solani，分離自水稻紋枯病病葉;灰葡萄孢Botrytis?cinerea，分離自草莓灰霉病病株;禾谷鐮孢Fusarium?graminearum，分離自小麥赤霉病病株;串珠鐮孢Fusarium?moniliforme，分離自水稻惡苗病病株;瓜類黑腐球殼菌Didymella?bryoniae，分離自西瓜蔓枯病病株;供試菌株均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院饋贈。

供試植物：‘藍(lán)莓1號植株栽培于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所溫室中。

1.2?儀器與藥劑

儀器：METTLER?AE240電子天平，梅特勒托利多儀器公司;高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;SWCJIFD可調(diào)式垂直單向潔凈

工作臺，上海天恒醫(yī)療器械有限公司;SPX150BSHⅡ

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Agilent

1260?UPLCDAD6530?ESIQTOF?MS

液質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司;核磁共振譜儀，Bruker?Avance?300;X6顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司;搖床，上海智城分析儀器制造有限公司;

Zeiss?LSM?900

激光掃描共聚焦顯微鏡，蔡司公司。

試劑：98%漢防己甲素，陜西綠清生物工程有限公司;98%蛇床子素，四川省維克奇生物科技有限公司;

瓊脂、PBS，北京索萊寶科技有限公司;DMSO、葡萄糖，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;氯化鈣，廣東光華科技股份有限公司;

Fluo3?AM（鈣離子熒光探針，5?mmol/L），碧云天生物技術(shù)有限公司;薄層層析硅膠，青島海洋化工廠分廠;維拉帕米、色譜純甲醇、色譜純乙腈，阿拉丁公司;其他試劑均為分析純。

PDA固體培養(yǎng)基：?200?g去皮馬鈴薯切塊，煮沸10?min后，取汁，加入20?g瓊脂，加熱至融化，再加入20?g葡萄糖，用去離子水定容至1?L。

PD培養(yǎng)液：?200?g去皮馬鈴薯切塊，煮沸10?min?后，取汁，加入20?g葡萄糖，用去離子水定容至1?L。

含鈣PDA培養(yǎng)基：取剛做好的PDA培養(yǎng)基，稱取氯化鈣加入其中，制成氯化鈣終濃度分別為40?000?mg/L?和50?000?mg/L?的含鈣培養(yǎng)基。

1.3?試驗方法

1.3.1?粉防己根中漢防己甲素的提取分離純化與鑒定

準(zhǔn)確稱取粉防己塊根粉2.0?kg，75%乙醇熱回流提取，濾過，濾液濃縮成浸膏，加水溶解后二氯甲烷萃取3次，合并有機溶劑后濃縮成浸膏，浸膏溶解，粗硅膠拌樣，柱層析純化，用二氯甲烷∶甲醇?（20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，硅膠板檢測，將含有與漢防己甲素標(biāo)準(zhǔn)品化學(xué)位移值相同的溶液合并，反復(fù)硅膠柱層析制備得到漢防己甲素粗品，重結(jié)晶后制得的固體用丙酮溶解，加水沉析制備得到的晶體經(jīng)HPLCMS質(zhì)譜及氫譜數(shù)據(jù)并與標(biāo)準(zhǔn)品比對鑒定得到純度98%以上的漢防己甲素［911］，用制備得到的漢防己甲素作為供試品進行試驗。

1.3.2?菌絲生長速率法測定漢防己甲素的抑菌活性

采用菌絲生長速率法［12］測定漢防己甲素抑制植物病原菌的EC50。用二甲基亞砜（DMSO）將漢防己甲素配成母液（104mg/L）后加入PDA培養(yǎng)基中，制成含有5個濃度梯度的含藥平板（d=9?cm），以蛇床子素原藥為陽性對照，以加入相應(yīng)DMSO溶劑為空白對照。將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥PDA平板中央，每皿1塊菌餅，菌絲面向下。接種后將培養(yǎng)皿用保鮮膜密封后放置于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～12?d，待對照組菌絲長至超過平板直徑2/3時，用十字交叉法測量菌落直徑，利用DPS軟件計算抑制中濃度EC50及斜率，用GraphPad?Prism?8進行卡方檢驗。每處理重復(fù)3次，試驗重復(fù)3次。

1.3.3?采用離體葉片法測定漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用

保護作用測定［13］：采摘新鮮的藍(lán)莓葉片用水洗凈晾干，分別噴灑用含有0.1%?吐溫80的去離子水稀釋的濃度為0、20、40、60、80、100?mg/L的化合物，將葉片放置于底部有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。24?h后，挑取灰葡萄孢菌餅（直徑0.5?cm）接種于各試驗組長勢基本一致的藍(lán)莓葉片中央部位。將接種后的培養(yǎng)皿置于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3?d后，用十字交叉法測定病斑直徑，計算防治效果。每處理10個重復(fù)，試驗重復(fù)2次。

治療作用測定［13］：采摘新鮮的藍(lán)莓葉片用水洗凈晾干后，將灰葡萄孢菌餅（直徑0.5?cm）接種于各試驗組長勢基本一致的藍(lán)莓葉片中央部位，將葉片放置于底部有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。24?h后，分別噴灑用含有0.1%吐溫80的去離子水稀釋的濃度為0、20、40、60、80、100?mg/L的化合物，培養(yǎng)3?d后，用十字交叉法測定病斑直徑，計算防治效果。每處理10個重復(fù)，試驗重復(fù)2次。

防治效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/（對照組病斑直徑-0.5）×100%。

1.3.4?外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響

采用菌絲生長速率法測定外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響［12，14］。制備含不同濃度CaCl2（40?000、50?000?mg/L）、漢防己甲素（30?mg/L）及二者聯(lián)用的含藥培養(yǎng)基，以加入相應(yīng)DMSO溶劑為空白對照組，將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥平板上，保鮮膜密封后置于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～4?d，觀察菌絲生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對各病原菌的生長抑制率。

1.3.5?激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子濃度的影響

Fluo3?AM作為最常用的檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一，可穿透細(xì)胞膜被剪切成Fluo3，繼而與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生較強的熒光，且熒光在一定時間內(nèi)強度恒定［15］，因此可用來觀察藥劑對鈣離子濃度的影響。將5個灰葡萄孢菌餅（直徑為0.5?cm）接入150?mL?PD培養(yǎng)液中，于24℃、125?r/min搖培60?h，夾取灰葡萄孢菌絲于培養(yǎng)皿中，PBS洗3次，放置于含有3?μL?Fluo3?AM鈣離子探針的500?μL?PBS的EP管中避光冰水浴超聲30?min，激光共聚焦顯微鏡檢測后有熒光。放入含100?mg/L漢防己甲素的PBS溶液中，用激光共聚焦顯微鏡觀察藥劑處理過的菌絲體內(nèi)鈣離子濃度的變化［14］。設(shè)置激發(fā)波長488?nm，發(fā)射波長525?nm，分別在5、10?min時進行觀察。以相應(yīng)溶劑處理菌絲作為對照組，每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.6?鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響

采用菌絲生長速率法測定鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響［12］。制備含200?mg/L維拉帕米（去離子水為溶劑）、40?mg/L漢防己甲素及二者聯(lián)用的含藥培養(yǎng)基，以加入相應(yīng)DMSO溶劑為空白對照組，將供試病原菌菌餅（直徑為?0.5?cm）分別接種于含藥平板上，保鮮膜密封后置于24?℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～4?d，觀察菌絲生長情況，用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對各病原菌的生長抑制率。

2?結(jié)果與分析

2.1?漢防己甲素的鑒定

白色粉末，m.p.223～224.1?℃（文獻(xiàn)［911］：216～222℃）。ESIMS?（m/z）：623.38［M+H］+，分子式為C38H42N2O6。

1HNMR（400?MHz，?CDCl3）δ：2.34（s，?3H），2.38～2.40（m，?1H），2.48（d，?J=33.8，?13.8?Hz，?1H），2.63（s，?3H），2.67～3.12（m，?6H），3.19（s，?3H），3.27（dd，?J=12.3，5.2?Hz，?1H），3.37（s，?3H），3.38～3.40（m，?1H），3.46～3.48（m，?1H），3.75（s，?4H），3.88（dd，?J=10.8，5.6?Hz，?1H），3.93（s，?3H），6.00（s，?1H），6.29（s，?1H），6.30（s，?1H），6.53（d，?J=13.1?Hz，?2H），6.80（d，?J=8.3?Hz，?1H），6.86（d，?J=8.1?Hz，?1H），6.89（d，?J=8.2?Hz，?1H），7.15（d，?J=8.1，?2.5?Hz，?1H），7.35（d，?J=8.2，?2.0?Hz，?1H）。

1HNMR譜數(shù)據(jù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)、熔點數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［911］一致，故該化合物鑒定為漢防己甲素（tetrandrine）。經(jīng)HPLCMS測定標(biāo)準(zhǔn)品及提取分離純化的漢防己甲素純度均超過98%。

2.2?漢防己甲素的抑菌活性

2.2.1?漢防己甲素對5種常見病原菌的EC50

按照1.3.2抑菌活性測試方法測定漢防己甲素對5種植物病原菌的EC50結(jié)果如表1所示。在5種植物病原真菌中，漢防己甲素對禾谷鐮孢的抑制活性較低，對其他4種植物病原菌的抑制活性較好，對立枯絲核菌的抑制活性最強（EC50=33.49?mg/L）;對串珠鐮孢、瓜類黑腐球殼菌的EC50分別為41.71?mg/L和43.97?mg/L，抑制活性優(yōu)于對照藥劑蛇床子素;對灰葡萄孢的抑制活性與對照藥劑蛇床子素相當(dāng)。

2.2.2?離體條件下漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用

保護作用的防效測定結(jié)果顯示（表2），在用藥濃度為20、40、60?mg/L時，漢防己甲素與對照藥劑蛇床子素的作用效果無明顯差異，用藥濃度為80、100?mg/L時，蛇床子素的作用效果較好;保護作用的防治效果隨用藥濃度增加而增強，且本試驗用藥濃度的保護防效均在43%以上。

治療作用的防效測定結(jié)果顯示（表2），在用藥濃度為20?mg/L時，蛇床子素的作用效果較好，用藥濃度為40、60、80、100?mg/L時，漢防己甲素與對照藥劑蛇床子素之間的作用效果無顯著差異;治療作用的防治效果均隨用藥濃度增加而增強，且本試驗用藥濃度的治療效果均在41%以上。

2.3?漢防己甲素抑菌作用機制初探

2.3.1?外源性鈣離子對漢防己甲素抑菌作用的影響

由表3數(shù)據(jù)可知，漢防己甲素單獨使用時對灰葡萄孢的抑制率為26.46%，濃度為40?000?mg/L的CaCl2單獨使用時抑制率為40.54%，但二者混合使用時抑制率為40.27%，與CaCl2單獨使用時的抑制率相近;當(dāng)添加的CaCl2濃度為50?000?mg/L時抑制率為56.01%，聯(lián)合使用后抑制率變?yōu)?9.48%，較CaCl2單獨使用的抑制率沒有上升反而明顯下降。兩個結(jié)果都說明漢防己甲素的抑菌活性與CaCl2的抑菌活性沒有相加作用，漢防己甲素可降低灰葡萄孢對CaCl2的敏感性，因此推斷漢防己甲素的抑菌作用機制與鈣離子有關(guān)。

2.3.2?利用激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子濃度的影響

為進一步確定漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子的影響，通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。本試驗加入Fluo3?AM?后2?h內(nèi)用激光共聚焦顯微鏡觀察灰葡萄孢菌絲熒光強度未發(fā)現(xiàn)有變化，而加入漢防己甲素后熒光強度明顯減弱（如圖1所示），表明灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子濃度降低，且觀察時間越長，降低程度越明顯。此結(jié)果說明漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用與鈣離子有關(guān)。

2.3.3?鈣通道拮抗劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌作用的影響

由表4數(shù)據(jù)可知，漢防己甲素單獨使用時對灰葡萄孢的抑制率為37.19%，維拉帕米單獨使用時抑制率為44.79%，但二者混合使用時抑制率為51.86%。此結(jié)果說明漢防己甲素的抑菌活性與維拉帕米的抑菌活性并不是單純的相加作用，兩者相互作用可降低灰葡萄孢對各自的敏感性，因此可推斷出漢防己甲素的抑菌作用機制也與鈣通道有關(guān)。

3?結(jié)論與討論

漢防己甲素具有心血管保護、降壓、降血糖等多種藥理作用［56］，還可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等細(xì)菌和真菌［78］，但在抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道。本試驗以粉防己塊根為原料進行提取分離純化得到含量為98%以上的漢防己甲素，采用菌絲生長速率法對其抑菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)其對供試病原真菌均有抑制作用，且漢防己甲素對灰霉病的保護和治療作用效果與對照藥劑蛇床子素相當(dāng)，有進一步研究的價值。

漢防己甲素為一種非選擇性的鈣離子通道阻滯劑，動物細(xì)胞試驗表明，其可調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，平衡細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度，維持Ca2+在內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等［1619］。真菌中，Ca2+可調(diào)控很多內(nèi)在的代謝及外在環(huán)境刺激過程，如細(xì)胞周期、孢子萌發(fā)、菌絲頂端生長、生物鐘以及滲透脅迫、熱休克、機械刺激及氧化脅迫等［2023］。目前鈣/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路已被認(rèn)為是抗菌劑的潛在作用靶標(biāo)［24］，通路中有Ca2+通道蛋白、鈣調(diào)磷酸酶等重要蛋白。鈣離子通道阻滯劑作用于Ca2+通道蛋白，加入鈣通道阻滯劑可以影響真菌的正常生理過程，例如?Shaw?等報道鈣拮抗劑可降低葉點霉Phyllosticta?ampelicida分生孢子萌發(fā)率和附著胞的形成率［22］，鈣拮抗劑維拉帕米可使胃腸道定殖的白色念珠菌細(xì)胞顯著減少［25］。漢防己甲素已被證明為鈣離子通道阻滯劑，作用于鈣通道蛋白，故推測其抑菌作用機制可能與Ca2+和Ca2+通道蛋白有關(guān)?；诖?，本文研究了添加外源性Ca2+及鈣通道阻滯劑維拉帕米對漢防己甲素抑菌活性的影響，并通過激光共聚焦顯微鏡檢測漢防己甲素對灰葡萄孢菌絲內(nèi)鈣離子濃度的影響，結(jié)果證明漢防己甲素對灰葡萄孢的抑菌作用機制與鈣離子及鈣離子通道有關(guān)。

漢防己甲素是防己科千金藤屬植物粉防己中分離提取的雙芐基異喹啉類生物堿，已作為臨床藥物用于抗風(fēng)濕及陣痛、抗肺癌、抗矽肺等。雖然已開展了許多工作，但對于抑制植物病原真菌方面的研究未見有報道。本文首次發(fā)現(xiàn)漢防己甲素具有抑制植物病原真菌的作用，并對其抑菌作用機制進行了初步探索，為進一步開發(fā)高效低毒的新型殺菌劑提供理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田?喆）