劉曉慧 周連柱 孔繁芳 王忠躍 黃曉慶 張昊

摘要

為明確我國(guó)山西、山東、河北和云南省葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性以及田間病菌群體的適合度，本研究采用TaqmanMGB技術(shù)檢測(cè)了2020年－2021年采自上述4省份292株葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性頻率;采用葉盤(pán)法測(cè)定了田間抗性菌株與敏感菌株的適合度。結(jié)果表明，上述4個(gè)地區(qū)的平均烯酰嗎啉抗性頻率及抗性等位基因頻率分別為64.0%和74.7%，其中山東省蓬萊區(qū)最高（91.2%和96.3%），河北省廊坊市（73.8%和85.0%）和云南省賓川縣（75.0%和82.6%）次之，山西省清徐縣（16.7%和34.7%）最低。適合度分析發(fā)現(xiàn)，田間抗性菌株的產(chǎn)孢能力明顯高于敏感菌株，但二者的復(fù)合適合度指數(shù)無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明，4省份霜霉病菌群體均對(duì)烯酰嗎啉產(chǎn)生了不同程度的抗性，田間抗性菌株與敏感菌株相比無(wú)明顯適合度變化。

關(guān)鍵詞

葡萄霜霉病菌;?烯酰嗎啉;?抗藥性;?適合度

中圖分類號(hào)：

S?436.631.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022161

Resistance?of?Plasmopara?viticola?populations?to?dimethomorph?in?four?provinces，?China?and?their?fitness

LIU?Xiaohui，?ZHOU?Lianzhu，?KONG?Fanfang，?WANG?Zhongyue，?HUANG?Xiaoqing*，?ZHANG?Hao*

（State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

In?order?to?clarify?the?resistance?of?Plasmopara?viticola?field?populations?to?dimethomorph?in?Shanxi，?Shandong，?Hebei?and?Yunnan?provinces?of?China?and?their?fitness，?the?dimethomorphresistance?of?292?P.viticola?isolates?collected?from?2020?to?2021?was?determined?by?TaqmanMGB?realtime?PCR，?and?the?fitness?of?resistant?and?sensitive?isolates?was?determined?on?detached?leaves.?The?results?showed?that?the?average?resistance?frequency?and?resistance?allele?frequency?of?P.viticola?from?the?four?provinces?were?64.0%?and?74.7%，?respectively.?Among?them，?the?average?resistance?frequency?and?resistance?allele?frequency?in?the?populations?of?Penglai，?Shandong?province?were?the?highest?（91.2%?and?96.3%），?followed?by?those?in?Langfang?of?Hebei?province?（73.8%?and?85.0%）?and?Binchuan?of?Yunnan?province?（75.0%?and?82.6%），?and?the?lowest?was?detected?in?Qingxu?of?Shanxi?province?（16.7%?and?34.7%）.?The?sporulation?capacity?of?the?resistant?isolates?was?significantly?higher?than?that?of?the?sensitive?ones，?but?there?was?no?significant?difference?in?the?composite?fitness?index?between?them.?The?results?indicated?that?the?resistance?of?P.viticola?populations?to?dimethomorph?in?the?four?provinces?has?developed?to?various?degrees，?but?no?significant?difference?existed?in?the?fitness?between?sensitive?and?resistant?isolates.

Key?words

Plasmopara?viticola;?dimethomorph;?fungicide?resistance;?fitness

葡萄是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的水果，在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植［1］。葡萄霜霉病作為葡萄上危害最為嚴(yán)重的一種卵菌病害，具有很強(qiáng)的流行性［23］。由于主栽葡萄品種對(duì)霜霉病菌缺乏抗性，在環(huán)境條件適宜的情況下，葡萄霜霉病大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響葡萄品質(zhì)與產(chǎn)量［45］。目前葡萄霜霉病的防治仍以化學(xué)防治為主［6］，生產(chǎn)上使用較多的藥劑有甲霜靈、嘧菌酯、烯酰嗎啉和霜脲氰等。但藥劑的頻繁使用易導(dǎo)致病原菌抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，增加防治難度和成本。

烯酰嗎啉屬于羧酸酰胺類殺菌劑［5］，主要通過(guò)干擾纖維素的生物合成，影響細(xì)胞壁的沉積，阻礙病菌孢子囊壁的形成［7］，對(duì)單軸霉屬Plasmopara引起的霜霉病和疫霉菌Phytophthora引起的疫病具有很好的防治效果［8］。自1996年在我國(guó)注冊(cè)登記以來(lái)，廣泛用于葡萄霜霉病的防治［9］。2010年，Sun等［10］測(cè)定了我國(guó)7省11個(gè)地區(qū)葡萄霜霉病菌Plasmopara?viticola對(duì)烯酰嗎啉的敏感性，發(fā)現(xiàn)所有菌株均表現(xiàn)敏感。但隨著烯酰嗎啉的大量、頻繁使用，2014年首次在我國(guó)廣西資源縣檢測(cè)到了烯酰嗎啉抗性葡萄霜霉菌株［11］。2018年，周連柱［12］測(cè)定了我國(guó)18個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)的葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性，發(fā)現(xiàn)霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的整體抗性頻率較低（37.2%），但不同地區(qū)間差異較大，河北省廊坊市等部分地區(qū)抗性頻率較高，最高為97.8%。

病原菌在田間能否形成穩(wěn)定的抗性群體，受抗性菌株的生存適合度、殺菌劑選擇壓力以及環(huán)境條件等因素的影響［1314］。CorioCostet等［15］發(fā)現(xiàn)，對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（Quinone?outside?inhibitor，?QoI）敏感及抗性的葡萄霜霉病菌，在無(wú)藥劑選擇壓條件下，二者的適合度無(wú)顯著差異，具有相當(dāng)?shù)纳娓?jìng)爭(zhēng)力。王文橋等［14］發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室條件下經(jīng)紫外誘導(dǎo)獲得的烯酰嗎啉抗性突變體的適合度低于其原始敏感菌株，并且抗性菌株經(jīng)繼代培養(yǎng)后，其產(chǎn)孢量減少，適合度顯著下降，生存競(jìng)爭(zhēng)力下降。但目前田間葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性群體的適合度變化情況尚不明確。開(kāi)展田間抗性菌株適合度研究對(duì)明確田間病原菌群體抗藥性發(fā)展趨勢(shì)及制定合理的抗藥性治理策略具有重要意義。

我國(guó)不同地區(qū)氣候條件差異較大，葡萄霜霉病發(fā)生情況也不同，導(dǎo)致地區(qū)間用藥方案存在差異［16］。山西省清徐縣在葡萄成熟季節(jié)（7月－9月）降水集中，葡萄霜霉病發(fā)生較為嚴(yán)重，但當(dāng)?shù)卣w用藥水平較低，其中，烯酰嗎啉用藥歷史較短，用藥頻率低，每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)使用1～2次，病原菌抗藥性頻率較低［9，17］;山東煙臺(tái)地區(qū)葡萄種植歷史長(zhǎng)，葡萄霜霉病發(fā)生嚴(yán)重，每個(gè)生長(zhǎng)季需要進(jìn)行10多次的殺菌劑噴霧，其中烯酰嗎啉用藥頻次高達(dá)4～6次［6］，存在較高的藥劑選擇壓力［9，18］;河北廊坊、昌黎地區(qū)在葡萄霜霉病的防治過(guò)程中存在輕防重治的現(xiàn)象，每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)使用烯酰嗎啉3～5次，并存在縮短施藥間隔期和增大用藥量等現(xiàn)象，病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性較高［9，19］;云南賓川地區(qū)葡萄生長(zhǎng)期長(zhǎng)，防治霜霉病過(guò)程中存在連續(xù)單一使用烯酰嗎啉的情況，每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)使用次數(shù)2～4次，導(dǎo)致病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性日益嚴(yán)重［9，2022］。上述4省份是我國(guó)重要的葡萄種植區(qū)域，為進(jìn)一步明確上述地區(qū)葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性頻率以及田間抗性菌株適合度的變化，我們重點(diǎn)進(jìn)行了以下兩方面的研究：1）?測(cè)定不同葡萄產(chǎn)區(qū)霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性;2）?分別測(cè)定抗性菌株和敏感菌株的侵染率、病斑面積和產(chǎn)孢能力3個(gè)適合度參數(shù)，比較兩種病原菌群體的適合度差異。為殺菌劑的合理使用提供科學(xué)指導(dǎo)，為制定科學(xué)合理的葡萄霜霉病菌抗藥性治理策略提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試菌株分別來(lái)自2020年和2021年從河北省廊坊市廣陽(yáng)區(qū)、山東省煙臺(tái)市蓬萊區(qū)、山西省太原市清徐縣和云南省大理市賓川縣4個(gè)主要葡萄產(chǎn)區(qū)采集的霜霉病樣。采樣時(shí)盡量采集發(fā)病初期幼嫩葉片，確保霜霉病菌活力。每個(gè)產(chǎn)區(qū)選擇2～3個(gè)自然村，每個(gè)自然村采集50個(gè)樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)采集3～5片病葉，各取樣點(diǎn)之間至少間隔50?m以上。將采集的病樣進(jìn)行保濕培養(yǎng)及病原菌的分離和純化，共收集到292株葡萄霜霉病菌。

供試葡萄品種為‘里扎馬特，采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊中試基地葡萄園。

供試培養(yǎng)基為1%水瓊脂培養(yǎng)基（1%WA）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?葡萄霜霉病菌的純化與擴(kuò)繁

將采集的病葉用滅菌水淋洗3～4遍，去除表面雜質(zhì)，用剪刀剪去葉緣枯黃組織，將病葉背面向上放置于放有兩層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在病葉和培養(yǎng)皿內(nèi)噴水保濕，放于溫度21℃、相對(duì)濕度100%、L∥D=16?h∥8?h的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?d左右，待其長(zhǎng)出新鮮霉層。

采集‘里扎馬特當(dāng)年生副梢頂端第4～5片健康嫩葉作為葡萄霜霉病菌的接種材料。將上述葉片用清水沖凈表面塵土，使用1%次氯酸鈉消毒30?s后用無(wú)菌水浸泡2～3次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面液體后，使用滅菌打孔器打制成直徑1.5?cm的葉盤(pán)。將葉盤(pán)背面向上置于1%?WA培養(yǎng)基上，每皿10個(gè)葉盤(pán)。挑取培養(yǎng)出的單個(gè)霜霉病菌斑，配制成濃度為1?×?106個(gè)/mL孢子懸浮液，每葉盤(pán)接種20?μL，放于溫度21℃、相對(duì)濕度100%、L∥D=16?h∥8?h的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2?葡萄霜霉病菌的DNA提取

使用OMAGE公司生產(chǎn)的真菌DNA試劑盒（D339002）提取帶菌葉盤(pán)的DNA，首先向裝有帶菌葉盤(pán)的凍存管中加入800?μL?Buffer?FG1，放入液體研磨儀中研磨2?min，確保組織充分破碎，然后按照試劑盒步驟提取。

1.2.3?葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗藥性檢測(cè)

采用王喜娜［11］建立的TaqmanMGB分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性。利用核酸濃度測(cè)定儀（Nano?Vue?Plus）對(duì)所提取DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，選擇質(zhì)量較高的樣品。使用引物Cesa3F（5′GCACAAACACGACAATGTAGACAA3′）和Cesa3R?（5′CGGCTGCTACCTTTACGGCAAA3′），探針Cesa3pR（5′FAMAGCAACGAGCTGAAMGB3′）和Cesa3pS?（5′VICCAGCAACGAGCCGAMGB3′）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。試驗(yàn)選取抗性、敏感菌株的DNA和ddH2O分別作為陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照。由于葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性是由隱性等位基因控制，只有當(dāng)該基因位點(diǎn)的兩個(gè)等位基因均發(fā)生了純合突變時(shí)，病原菌才表現(xiàn)為抗性。因而，當(dāng)菌株僅具有敏感探針Cesa3pS擴(kuò)增曲線而無(wú)抗性探針Cesa3pR擴(kuò)增曲線時(shí)，則判定該菌株為敏感純合子;當(dāng)菌株同時(shí)具有敏感探針Cesa3pS和抗性探針Cesa3pR擴(kuò)增曲線時(shí)，則判定該菌株為敏感雜合子;當(dāng)菌株僅具有抗性探針Cesa3pR擴(kuò)增曲線時(shí)，則判定該菌株為抗性菌株。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)病原菌群體的抗性頻率和抗性等位基因頻率，進(jìn)而分析病原菌的抗性情況及抗性發(fā)展趨勢(shì)。其中，抗性頻率=抗性菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%;抗性等位基因頻率=（抗性菌株數(shù)×2+敏感雜合菌株數(shù)）/總菌株數(shù)×100%。

1.2.4?葡萄霜霉病菌抗烯酰嗎啉菌株適合度測(cè)定

采用葉盤(pán)法［2325］測(cè)定葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性菌株及敏感菌株的侵染率（infection?frequency）、病斑面積（lesion?area）和產(chǎn)孢能力（sporulation?capacity）3個(gè)參數(shù)，以評(píng)估其復(fù)合適合度指數(shù)（composite?fitness?index）［26］。將135個(gè)烯酰嗎啉抗性菌株及121個(gè)敏感菌株的孢子囊懸浮液（1×105個(gè)/mL）分別接種到離體葡萄葉盤(pán)背面，每個(gè)葉盤(pán)上接種20?μL菌液，每皿放置10個(gè)葉盤(pán)，每菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每菌株共接種30個(gè)葉盤(pán)。置于培養(yǎng)箱中黑暗處理24?h后，用滅菌濾紙條將葉盤(pán)表面殘余液滴吸去，將平板放于溫度21℃、L∥D=16?h∥8?h、相對(duì)濕度100%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7?d后調(diào)查。

侵染率（%）為發(fā)病葉盤(pán)數(shù)占總?cè)~盤(pán)數(shù)的比率;病斑面積（cm2/葉）為每菌株在葉盤(pán)上的發(fā)病面積;產(chǎn)孢能力（個(gè)/cm2·mL）為單位體積下每單位面積產(chǎn)生的孢子囊數(shù)量;復(fù)合適合度指數(shù)=侵染率×病斑面積×產(chǎn)孢能力。

1.2.5?數(shù)據(jù)分析

利用Excel?2019對(duì)抗性頻率、適合度數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，計(jì)算各產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌抗性頻率及抗性等位基因頻率，并結(jié)合Rstudio軟件中fifer、tidyverse、RColorBrewer等軟件包進(jìn)行葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性頻率及抗性等位基因頻率的精確檢驗(yàn)，利用GraphPad?5.0繪圖軟件對(duì)抗性頻率及抗性等位基因頻率數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖;利用SPSS?25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)適合度數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較是否存在顯著性差異，利用GraphPad?5.0繪圖軟件對(duì)抗性菌株、敏感菌株的侵染率、病斑面積和產(chǎn)孢能力數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖、利用R語(yǔ)言4.2.0中tidyverse等軟件包對(duì)復(fù)合適合度指數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性情況

2020年和2021年采自我國(guó)河北省廊坊市、山東省蓬萊區(qū)、山西省清徐縣和云南省賓川縣4個(gè)地區(qū)的292株葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的整體抗性頻率達(dá)到64.0%，2020年和2021年采集菌株的抗性頻率分別為62.6%和67.0%（表1）。其中，2020年河北省廊坊市葡萄霜霉病菌抗性頻率最高，達(dá)到93.9%，山西省清徐縣葡萄霜霉病菌抗性頻率顯著低于其他3個(gè)地區(qū)，僅為3.8%;2021年山東省蓬萊區(qū)葡萄霜霉病菌抗性頻率高達(dá)96.0%，山西省清徐縣（50%）和河北省廊坊市（41.9%）抗性頻率顯著低于其他2個(gè)地區(qū)（圖1）。

292株葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉整體抗性等位基因頻率為74.7%，2020年和2021年整體抗性等位基因頻率分別為70.5%和83.5%（表1），其中2020年山東省蓬萊區(qū)病菌抗性等位基因頻率高達(dá)95.3%，山西省清徐縣病菌抗性等位基因頻率為24.0%，顯著低于其他3個(gè)地區(qū)（圖2）;2021年山東省蓬萊區(qū)和云南省賓川縣抗性等位基因均超過(guò)95%，河北省廊坊市次之（77.4%），山西省清徐縣最低（62.5%）。

與2020年相比，2021年各地區(qū)的抗藥性發(fā)生情況不同。2021年山西省清徐縣葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性頻率明顯升高，河北省廊坊市顯著降低（P<0.05）;而對(duì)于抗性等位基因頻率，2021年山西省清徐縣及云南省賓川縣均明顯升高（P<0.05），其他無(wú)顯著變化（P>0.05）。

2.2?葡萄霜霉病菌抗烯酰嗎啉菌株的適合度

采用葉盤(pán)法測(cè)定292株葡萄霜霉病菌的侵染率、病斑面積和產(chǎn)孢能力3個(gè)適合度指標(biāo)過(guò)程中，36株葡萄霜霉病菌被污染，最終得到烯酰嗎啉抗性菌株135株和敏感菌株121株。

侵染率測(cè)定結(jié)果（圖3a）顯示，2020年和2021年抗性菌株的侵染率均值分別為（88±16）%和（88±14）%，敏感菌株的侵染率均值分別為（86±18）%和（85±19）%，抗性菌株與敏感菌株侵染率均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

病斑面積測(cè)定結(jié)果（圖3b）顯示，2020年和2021年的抗性菌株引起的病斑面積分別為（4.16±0.8）cm2/葉和（3.76±1.22）cm2/葉，而敏感菌株引起的病斑面積分別為（3.72±0.72）cm2/葉和（3.55±1.26）cm2/葉，抗性菌株和敏感菌株兩年的病斑面積相當(dāng)（P>0.05）。產(chǎn)孢能力測(cè)定結(jié)果（圖3c）顯示，培養(yǎng)7?d后，抗性菌

株和敏感菌株的孢子萌發(fā)率均達(dá)到100%，其中2020年和2021年抗性菌株的產(chǎn)孢能力分別為（7?819±4?821）個(gè)/（cm2·mL）和（6?906±5?107）個(gè)/（cm2·mL），敏感菌株的產(chǎn)孢能力（5?133±2?327）個(gè)/（cm2·mL）和（4?482±1?679）個(gè)/（cm2·mL），抗性菌株兩年的產(chǎn)孢量均顯著高于敏感菌株（P<0.05），表明抗性菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢能力。

根據(jù)以上3個(gè)參數(shù)，按照Tooley等［26］建立的公式分別計(jì)算出每個(gè)菌株的復(fù)合適合度指數(shù)（圖4）。結(jié)果顯示，2020年和2021年抗性菌株的復(fù)合適合度指數(shù)分別為（27?385±18?357）和（17?354±9?524），2020年和2021年敏感菌株的復(fù)合適合度指數(shù)分別為（18?000±9?803）和（11?131±7?737），兩年抗性菌株和敏感菌株的復(fù)合適合度指數(shù)均變化不大（P>0.05），表明烯酰嗎啉抗性菌株與敏感菌株之間沒(méi)有明顯的適合度差異。

3?結(jié)論與討論

葡萄霜霉病在世界主要葡萄產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生［27］。該病流行性極強(qiáng)，一旦暴發(fā)，所造成的損失慘重［16］，嚴(yán)重影響著葡萄質(zhì)量和產(chǎn)量的提升。化學(xué)防治因具見(jiàn)效快、效果好的優(yōu)點(diǎn)，成為病害防治過(guò)程中必不可少的防控手段。大量?jī)?nèi)吸性殺菌劑，如甲霜靈、嘧菌酯、烯酰嗎啉［2829］等雖具有較好的防治效果，但藥劑的大量頻繁使用加速了病原菌抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，使葡萄生產(chǎn)蒙受了重大損失［912］。烯酰嗎啉因?qū)ζ咸阉共【哂泻芎玫姆乐涡Ч?，且與甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑不存在交互抗性，近些年在生產(chǎn)上廣泛使用［5］，葡萄霜霉病菌對(duì)其抗性發(fā)展迅速［9，30］。

研究發(fā)現(xiàn)，葡萄霜霉病菌對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑的抗性與其纖維素合酶第1?105位的兩個(gè)SNP突變（G1105S和G1105V）有關(guān)［8，31］。但G1105V突變僅在世界上的少數(shù)幾個(gè)地點(diǎn)被檢測(cè)到，并且抗性頻率很低，歐洲大部分地區(qū)及日本等主要以G1105S為主，目前在我國(guó)也僅檢測(cè)到了G1105S突變［9，30］。基于這一原理，王喜娜等［11］建立了快速檢測(cè)葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性的TaqmanMGB分子檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)比葉盤(pán)法更為簡(jiǎn)便、精確，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)精度，為田間葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性的快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)保障。

本研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)山西、河北、山東、云南省4個(gè)地區(qū)均檢測(cè)到了葡萄霜霉病菌烯酰嗎啉抗性菌株。其中，山東省蓬萊區(qū)、河北省廊坊市和云南省賓川縣的菌株對(duì)烯酰嗎啉抗性較為嚴(yán)重（兩年的平均抗性頻率均在70%以上），而山西清徐縣的抗性頻率較低（16.7%），這可能與不同地區(qū)每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)烯酰嗎啉的用藥次數(shù)及用藥量等密切相關(guān)［9］。Huang等［9］調(diào)查發(fā)現(xiàn)2014年-2016年山西省清徐縣每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)用藥次數(shù)為1～2次，總用藥量為0.03～0.06?kg/hm2，用藥頻次和用藥量均較少;而山東省蓬萊區(qū)、河北省廊坊市和云南省賓川縣每個(gè)葡萄生長(zhǎng)季烯酰嗎啉用藥次數(shù)較高（3～5次），平均用藥量超過(guò)1?kg/hm2，高于烯酰嗎啉防治葡萄霜霉病的推薦劑量（0.3～0.5?kg/hm2），長(zhǎng)期大量、頻繁的藥劑使用可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生了抗性，并且伴隨著抗藥性的產(chǎn)生，種植戶為了達(dá)到良好的防治效果只得增加用藥量，從而加劇了上述地區(qū)霜霉病菌抗藥性的發(fā)展。與周連柱2018年對(duì)上述4個(gè)地區(qū)葡萄霜霉病菌烯酰嗎啉的抗性檢測(cè)結(jié)果相比，山東省蓬萊區(qū)、山西省清徐縣和云南省賓川縣三地區(qū)葡萄霜霉病菌的烯酰嗎啉抗性頻率和抗性等位基因頻率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是檢測(cè)地區(qū)近兩年葡萄生長(zhǎng)季節(jié)平均降雨量較常年偏多10.3%～35%［3233］，葡萄霜霉病發(fā)生較為嚴(yán)重，從而導(dǎo)致各產(chǎn)區(qū)殺菌劑的使用量隨之增加。雖然山西省清徐縣菌株抗性頻率較低，但抗性等位基因頻率呈逐年上升趨勢(shì)，表明病原菌具有一定的抗性發(fā)展趨勢(shì)，生產(chǎn)上應(yīng)注意藥劑的合理使用。另外，病原菌抗藥性的產(chǎn)生會(huì)引起藥效下降［34］，具體藥劑的防治效果需進(jìn)一步評(píng)估，從而為田間精準(zhǔn)用藥及制定更科學(xué)的抗性治理對(duì)策提供依據(jù)。

同時(shí)，明確無(wú)藥劑選擇壓力下葡萄霜霉病菌抗性菌株與敏感菌株適合度變化狀況，對(duì)制定科學(xué)的抗藥性治理方案也至關(guān)重要。本研究選擇測(cè)定了采自我國(guó)山西省清徐縣、云南省賓川縣、山東省蓬萊區(qū)及河北廊坊市4個(gè)不同葡萄產(chǎn)區(qū)的256個(gè)田間菌株中對(duì)烯酰嗎啉敏感菌株與抗性菌株在無(wú)藥條件下的侵染率、病斑面積和產(chǎn)孢能力，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的侵染率、病斑面積與敏感菌株不存在顯著差異（P>0.05），而產(chǎn)孢能力顯著高于敏感菌株（P<0.05），生存繁殖能力較強(qiáng)。此外，還發(fā)現(xiàn)抗性菌株的復(fù)合適合度指數(shù)高于敏感菌株，但兩者無(wú)顯著差異（P>0.05），該結(jié)果與Blum［35］的研究結(jié)果一致，原因可能是自然選擇導(dǎo)致適合度顯著下降的抗性菌株被淘汰，從而使兩類菌株表現(xiàn)出適合度相當(dāng)?shù)臓顩r。另外，通過(guò)連續(xù)兩年適合度分析，發(fā)現(xiàn)侵染率、病斑面積和產(chǎn)孢能力變化趨穩(wěn)，可能是由于只有當(dāng)葡萄霜霉病菌發(fā)生隱性純合突變時(shí)才表現(xiàn)對(duì)烯酰嗎啉的抗性，延緩了病菌對(duì)烯酰嗎啉抗性的發(fā)展，導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)病原菌群體抗藥性及適合度無(wú)太大變化。但上述試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，給予了病原菌較為適宜的溫度、濕度等生長(zhǎng)環(huán)境，與田間自然條件下病菌的適合度反應(yīng)有所差異，一定程度上該方法仍存在缺陷［36］。為此，尚需進(jìn)一步研究抗性菌株適合度的穩(wěn)定性以及其與敏感菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力等，以制定更為科學(xué)、精準(zhǔn)的抗藥性治理策略。

綜上所述，本研究明確了我國(guó)河北省廊坊市、山東省蓬萊區(qū)、山西省清徐縣和云南省賓川縣4個(gè)葡萄產(chǎn)區(qū)霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性情況和適合度現(xiàn)狀，為葡萄霜霉病的田間防治以及病原菌的抗藥性治理提供了理論依據(jù)。結(jié)合國(guó)際殺菌劑抗性委員會(huì)CAA工作組的相關(guān)建議，對(duì)于山東省蓬萊區(qū)等抗性較嚴(yán)重的產(chǎn)區(qū)，應(yīng)避免烯酰嗎啉等羧酸酰胺類藥劑單獨(dú)使用，建議與霜脲氰、氰霜唑、氟吡菌胺·霜霉威等其他不同作用機(jī)制的藥劑桶混使用［37］;在山西省清徐縣等抗性較低的產(chǎn)區(qū)，應(yīng)將羧酸酰胺類殺菌劑與不同作用機(jī)理的殺菌劑交替或混合使用，禁止羧酸酰胺類殺菌劑作鏟除性使用，限制每個(gè)生長(zhǎng)季使用羧酸酰胺類殺菌劑不超過(guò)3次，以避免抗藥性發(fā)展和擴(kuò)散［12，37］。

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