鄧 麗，楊寶強(qiáng)，謝 天

(國(guó)藥集團(tuán)川抗制藥有限公司，四川 成都 611730)

嗎啉，又稱嗎啡啉、1,4-氧氮雜環(huán)環(huán)己烷，具吸濕性和特殊氨味的無(wú)色油狀液體，易溶于水、芳烴、醇、酮、醚和有機(jī)溶劑中。嗎啉含有仲胺基團(tuán)，具有仲胺基團(tuán)的所有典型反應(yīng)特征，如與無(wú)機(jī)酸生成鹽、與有機(jī)酸生成鹽或酰胺、烷基化反應(yīng)、與環(huán)氧乙烷或酮進(jìn)行willgerodt反應(yīng)等等，羥乙基嗎啉正是以嗎啉和環(huán)氧乙烷反應(yīng)合成而得[1-3]。

羥乙基嗎啉與麥考酚酸反應(yīng)可合成嗎替麥考酚酯(一種免疫抑制藥)，是生產(chǎn)嗎替麥考酚酯的關(guān)鍵中間體。我司在研究嗎替麥考酚酯課題中發(fā)現(xiàn)，羥乙基嗎啉殘留的嗎啉(合成過(guò)程殘留或儲(chǔ)存過(guò)久緩慢分解產(chǎn)生)，極易與麥考酚酸反應(yīng)生成酯類或酰胺類副產(chǎn)物，增加嗎替麥考酚酯分離純化的工藝難度，影響嗎替麥考酚酯的質(zhì)量，且存在潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。故嗎替麥考酚酯合成工藝需嚴(yán)格控制羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，盡可能減少副產(chǎn)物產(chǎn)生。但尚未見(jiàn)羥乙基嗎啉中嗎啉檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道。

目前，嗎啉的檢測(cè)方法主要有氣相色譜(質(zhì)譜)法[6-11]、液相色譜(質(zhì)譜)法[12-13]、離子色譜法[14-15]。嗎啉的分子結(jié)構(gòu)決定其為幾乎無(wú)紫外吸收，故液相色譜法(紫外檢測(cè)器)的靈敏度和準(zhǔn)確度效果不佳，需與質(zhì)譜聯(lián)用；離子色譜法尚還在探索中；氣相色譜法較成熟，靈敏度高，對(duì)含嗎啉的微量雜質(zhì)檢測(cè)比較適宜。本文首次采用氣相色譜法測(cè)定羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，旨在為含嗎啉雜質(zhì)的產(chǎn)品或中間體(如羥乙基嗎啉)的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

7890B型氣相色譜儀，(配置FID檢測(cè)器)，美國(guó)美國(guó) Agilent公司；BP211D型Sartorius電子分析天平(感量0.01mg)，上海精科儀器廠。

1.2 試 藥

羥乙基嗎啉(分析級(jí))，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；嗎啉(分析級(jí))，成都市科龍化工試劑廠；甲醇(色譜級(jí)，F(xiàn)isher)，羥乙基嗎啉(自制，批號(hào)：Z0107、Z0501、Z0502、Z0601)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定相(30 m×0.53 mm×3.0 μm)；載氣：氮?dú)?；流速?.0 mL/min；柱溫條件：起始溫度為150 ℃，維持3 min，以20 ℃/min速率升溫至240 ℃，維持10 min；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；檢測(cè)器溫度：260 ℃；分流方式：分流進(jìn)樣，分流比為15:1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取羥乙基嗎啉(自制)適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含100 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取嗎啉、羥乙基嗎啉各適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中分別約含嗎啉1 mg、羥乙基嗎啉100 mg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。取嗎啉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含嗎啉1 mg的溶液，作為嗎啉對(duì)照品溶液；取羥乙基嗎啉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含羥乙基嗎啉100 mg的溶液，作為羥乙基嗎啉對(duì)照品溶液。以甲醇溶液為陰性對(duì)照溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，甲醇對(duì)與嗎啉、羥乙基嗎啉測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好；嗎啉與羥乙基嗎啉峰分離度>1.5，理論塔板數(shù)>10000，滿足檢測(cè)要求，系統(tǒng)適用性良好。陰性對(duì)照、對(duì)照品和供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 嗎啉和羥乙基嗎啉GC圖譜

2.4.2 檢測(cè)限和定量限測(cè)定

吸取嗎啉對(duì)照品溶液加甲醇逐級(jí)稀釋后，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖。按信噪比(S/N)約為2時(shí)作為檢測(cè)限、S/N約為10時(shí)作為定量限來(lái)處理，嗎啉的檢測(cè)限為2.01 ng，定量限為 10.06 ng。

2.4.3 線性關(guān)系考察

取嗎啉對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋2、10、20、50和100倍濃度的對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣，記錄峰面積，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，在嗎啉在10.06～500.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為：y=453.39x-4.475，R2=0.9995。

2.4.4 精密度試驗(yàn)

吸取嗎啉對(duì)照品溶液，依法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄嗎啉的峰面積。結(jié)果，嗎啉峰面積的RSD=1.67%。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取羥乙基嗎啉樣品(批號(hào)：Z0107)，按“2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)平行制備供試品溶液6份。依法進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中嗎啉的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取嗎啉42.15 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；再?gòu)闹形?mL置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為嗎啉對(duì)照品儲(chǔ)備液。取已知含量樣品(批號(hào)：Z0107)9份，每份約0.5 g，分別置10 mL量瓶中，將9份樣品分成3個(gè)組，每組3個(gè)平行，吸取嗎啉對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL各3份置9個(gè)樣品中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為加樣回收率供試品溶液。依法進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中嗎啉的測(cè)得量，并計(jì)算回收率。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.7 耐用性試驗(yàn)

取羥乙基嗎啉樣品(批號(hào)：Z0107)的供試品溶液，將“2.1色譜條件”作微調(diào)，調(diào)整色譜柱初始溫度、進(jìn)樣口與檢測(cè)器溫度、分流比，記錄峰面積，計(jì)算樣品中嗎啉含量。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 樣品測(cè)定

取三批樣品(Z0501、Z0502、Z0601)各約1 g，按“2.2供試品溶液的制備”項(xiàng)制備供試品溶液，依法進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中嗎啉的含量，見(jiàn)表4。

表4 三批羥乙基嗎啉樣品中嗎啉含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

羥乙基嗎啉是由適量的環(huán)氧乙烷和過(guò)量的嗎啉合成制得，由于嗎啉和羥乙基嗎啉結(jié)構(gòu)相似，嗎啉極有可能殘留在羥乙基嗎啉中，兩者化學(xué)性質(zhì)也存在相似之處，檢測(cè)過(guò)程中分離度難以符合要求。

以羥乙基嗎啉作為藥物組成部分或者作為中間體反應(yīng)合成嗎替麥考酚酯，都有必要對(duì)雜質(zhì)嗎啉進(jìn)行研究。本研究首次采用氣相色譜法測(cè)定羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，方法學(xué)考察結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，嗎啉與羥乙基嗎啉能夠完全分離，空白溶劑無(wú)干擾、系統(tǒng)適用性良好、靈敏度高、在10.06～500.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、重復(fù)性良好和準(zhǔn)確度高，可有效控制極微量嗎啉的含量。

本研究所建立的氣相色譜法測(cè)定羥乙基嗎啉中嗎啉含量的方法切實(shí)可行，操作簡(jiǎn)單，將會(huì)為含有嗎啉的雜質(zhì)的產(chǎn)品或中間體質(zhì)量研究提供依據(jù)。