楊馥韓 余兆耀 尹世欣 龍友華 王勇 陳相儒

摘要

獼猴桃種傳潛隱病毒?（actinidia?seed?borne?latent?virus，?ASbLV），屬于乙型線狀病毒科Betaflexiviridae李屬病毒屬Prunevirus，是一種在我國獼猴桃上廣泛發(fā)生的病毒。本研究通過RTPCR方法克隆ASbLV的外殼蛋白基因，并連接到原核表達載體?pET28a（+）上，轉化大腸桿菌Rosetta?（DE3），經IPTG誘導后可表達分子量約為28?kD的融合蛋白。經過?Ni2+NTA樹脂純化融合蛋白，然后以其為抗原制備多克隆抗體。Western?blot結果表明，多克隆抗體的效價為1∶4?000。該多克隆抗體只與ASbLV發(fā)生特異性反應，而不與獼猴桃病毒1、獼猴桃病毒A、蘋果莖溝病毒、柑橘葉斑駁病毒、黃瓜花葉病毒和馬鈴薯X病毒發(fā)生反應，說明該多克隆抗體特異性良好。利用間接ELISA對36份獼猴桃田間樣品進行了ASbLV檢測，檢測結果表明其中20份樣品被ASbLV侵染，且間接ELISA檢測結果與RTPCR檢測結果一致。本研究建立的間接ELISA方法能夠有效地應用于獼猴桃田間樣品中的ASbLV檢測。

關鍵詞

獼猴桃種傳潛隱病毒;?外殼蛋白;?原核表達;?多克隆抗體

中圖分類號：

S?436.634.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022135

Prokaryotic?expression?and?polyclonal?antibody?preparation?of?the?coat?protein?of?actinidia?seedborne?latent?virus

YANG?Fuhan，?YU?Zhaoyao，?YIN?Shixin，?LONG?Youhua，?WANG?Yong，?CHEN?Xiangru*

（College?of?Agriculture，?Guizhou?University，?Guiyang?550025，?China）

Abstract

Actinidia?seedborne?latent?virus?（ASbLV），?which?belongs?to?the?genus?Prunevirus?in?the?family?Betaflexiviridae，?is?a?common?virus?on?kiwifruit?in?China.?In?this?study，?the?coat?protein?（CP）?gene?of?ASbLV?was?amplified?from?ASbLVinfected?leaves?of?kiwifruit?by?RTPCR，?fused?to?the?prokaryotic?vector?pET28a（+）?and?transformed?into?Escherichia?coli?Rosetta?（DE3）.?After?induced?with?IPTG，?the?fusion?protein?with?a?molecular?weight?of?28?kD?was?expressed.?The?fusion?protein?purified?by?Ni2+NTA?resin?was?used?for?preparation?of?polyclonal?antibody.?Western?blot?result?showed?that?the?polyclonal?antibody?titer?was?1∶4?000.?This?polyclonal?antibody?reacted?specifically?with?ASbLV，?but?did?not?react?with?the?other?six?viruses?infecting?kiwifruit，?including?actinidia?virus?1，?actinidia?virus?A，?apple?stem?grooving?virus，?citrus?leaf?blotch?virus，?cucumber?mosaic?virus?and?potato?virus?X.?Indirect?ELISA?（IDELISA）?result?showed?that?20?of?the?36?samples?were?positive.?The?IDELISA?result?was?consistent?with?those?of?RTPCR.?In?this?study，?we?successfully?established?an?IDELISA?method?based?on?the?specific?antibody?of?ASbLV.?This?method?can?be?efficiently?applied?to?detecting?ASbLV?from?field?samples.

Key?words

actinidia?seed?borne?latent?virus?（ASbLV）;?coat?protein?（CP）;?prokaryotic?expression;?polyclonal?antibody

中華獼猴桃Actinidia?chinensis屬獼猴桃科Actinidiaceae獼猴桃屬Actinidia，原產于中國，已有130多年的栽培歷史［1］。獼猴桃營養(yǎng)豐富，具有很高的食用價值和經濟價值，深受人們喜愛［2］。據(jù)統(tǒng)計，目前能夠侵染獼猴桃的病毒共有24種［36］，我國獼猴桃上發(fā)現(xiàn)并報道的獼猴桃病毒共有17種［37］，其中獼猴桃病毒?A?（actinidia?virus?A，?AcVA）、獼猴桃病毒?1?（actinidia?virus?1，?AcV1）、柑橘葉斑駁病毒?（citrus?leaf?blotch?virus，?CLBV）、獼猴桃褪綠環(huán)斑相關病毒（actinidia?chlorotic?ringspotassociated?virus，?AcCRaV）?和獼猴桃種傳潛隱病毒（actinidia?seed?borne?latent?virus，ASbLV）發(fā)生率較高。

獼猴桃種傳潛隱病毒由Veerakone等［8］于2018年在新西蘭的中華獼猴桃上首次發(fā)現(xiàn)并報道。ASbLV能夠通過種子自然傳播，也能夠通過機械傳播，廣泛分布于全球各獼猴桃種植主產區(qū)，新西蘭［8］、韓國以及中國陜西［45］、貴州、江西［9］、重慶［9］、湖北［9］均有發(fā)生。ASbLV侵染獼猴桃后葉片癥狀表現(xiàn)為葉脈褪綠和斑駁。

ASbLV屬乙型線狀病毒科Betaflexiviridae李屬病毒屬Prunevirus。該病毒基因組由一條長8?192?nt的正義單鏈?RNA?組成，共編碼4個開放閱讀框，分別編碼1個與復制相關的蛋白、1個運動蛋白、1個外殼蛋白（coat?protein，?CP）及1個核酸結合蛋白。

本文通過RTPCR克隆ASbLV?CP基因，構建其原核表達載體，獲得原核表達蛋白，制備ASbLV?CP多克隆抗體，利用多克隆抗體建立了ASbLV的間接ELISA檢測方法，為該病毒的田間檢測提供技術支持，為進一步深入研究ASbLV?CP的功能及ASbLV的致病機理奠定了基礎。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

感染了ASbLV、AcVA、AcV1、CLBV、蘋果莖溝病毒（apple?stem?grooving?virus，ASGV）、黃瓜花葉病毒（cucumber?mosaic?virus，CMV）、馬鈴薯?X?病毒（potato?virus?X，PVX）的獼猴桃葉片采自貴州省息烽縣和貴州省六盤水市?？焖偻ㄓ弥参颮NA提取試劑盒購自華越洋（北京）公司，大腸桿菌DH5α、Rosetta?（DE3）購自通用生物（安徽）公司，限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。pUC19T克隆載體購自擎科生物公司，pGD系列載體由中國農業(yè)大學韓成貴教授惠贈，pET28a（+）原核表達載體由中國農業(yè)大學劉俊峰教授惠贈。

1.2?ASbLV?CP?基因克隆及原核表達載體的構建

根據(jù)GenBank中登錄的ASbLV?（NC_040800.1）基因序列，用Primer?Premier?5.0設計引物，PCPF：?5′GGATCCATGTCAGCGAAGTTGGCAAAGA

AGAGG3′?（下劃線為BamHⅠ酶切位點），PCPR：

5′CTCGAGCACTATTAGATTAACTGCTGAC

TCC3′?（下劃線為XhoⅠ酶切位點），通過RTPCR擴增ASbLV?CP基因。PCR反應程序：94℃預變性5?min;94℃變性30?s，55℃退火30?s，72℃延伸1?min，32個循環(huán);72℃延伸10?min。用1.2%?瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，產物經純化后，連接到?pUC19T載體并轉化大腸桿菌?DH5α，篩選出的陽性克隆送擎科生物（重慶）公司測序。重組質粒?pUC19TASbLVCP?測序驗證無誤后用BamH?Ⅰ和?Xho?Ⅰ酶切，并將回收的目的條帶連接到經同樣雙酶切的pET28a（+）載體上，轉化大腸桿菌DH5α提取質粒，經雙酶切鑒定成功構建原核表達載體pET28aASbLVCP。

1.3?ASbLV?CP?蛋白原核表達、純化及多克隆抗體的制備

將pET28aASbLVCP和pET28a（+）質粒分別轉化大腸桿菌?Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞。培養(yǎng)過夜的菌液按1∶100比例接種于LB?（含50?μg/mL?Kan）液體培養(yǎng)基中，37℃?220?r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8時加入終濃度為1?mmol/L?IPTG，置于不同溫度（16、25、30、37℃）誘導培養(yǎng)6～8?h。12?000?r/min離心1?min收集菌體，加入200?μL?PBS?緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎細胞，4℃?12?000?r/min離心10?min，將上清轉移至新的離心管中，加入SDS上樣緩沖液，100℃?變性?10?min，立即置于冰上5?min，取10?μL變性后的蛋白樣品進行SDSPAGE分析，判斷ASbLV?CP蛋白最佳表達溫度。

根據(jù)SDSPAGE分析結果選擇37℃進行ASbLV?CP蛋白大量誘導表達，培養(yǎng)過夜的菌液按1∶100比例接種于500?mL?LB?（含50?μg/mL?Kan）液體培養(yǎng)基中，37℃?220?r/min培養(yǎng)2～4?h，OD600達到0.5～0.8?時加入終濃度為1?mmol/L?IPTG，37℃?220?r/min誘導培養(yǎng)6?h。12?000?r/min離心1?min收集菌體，加入30?mL?PBS緩沖液（含8?mol/L脲）重懸菌體，冰上超聲破碎細胞，使用Ni2+NTA?Agarose親和層析柱純化融合蛋白，用含有不同濃度咪唑（10、50、100、200、400?mmol/L）的PBS緩沖液進行洗脫［10］，用SDSPAGE對不同咪唑濃度的洗脫液進行檢測，根據(jù)檢測結果選擇相應的洗脫液進行蛋白的脫鹽和濃縮。將純化好的目的蛋白送至艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）公司制備多克隆抗體。

1.4?多克隆抗體效價檢測

將ASbLV?CP多克隆抗體分別稀釋1?000、2?000、4?000、8?000、16?000倍作為一抗反應液，利用Western?blot檢測多克隆抗體的效價。用攜帶pGDCPASbLV3flag植物瞬時表達載體的農桿菌浸潤接種本氏煙Nicotiana?benthamiana，3?d后取0.1?g接種葉于液氮中研磨，參照劉玉姿等［11］的方法提取本氏煙葉片總蛋白，以接種含pGDGFP載體的農桿菌的本氏煙葉片總蛋白作為陰性對照。

1.5?抗血清特異性檢測

采用間接酶聯(lián)檢測法（indirect?enzymelinked?immunosorbent?assay，?IDELISA）檢測多克隆抗體的特異性。提取感染AcV1、AcVA、ASbLV、ASGV、CLBV、CMV、PVX的獼猴桃葉片蛋白以及健康獼猴桃葉片蛋白，按1∶20的比例將蛋白與包被緩沖液（0.05?mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH?9.6）進行稀釋，每孔中加100?μL樣品混合液?（每個樣品2個重復），37℃孵育2?h;每孔加350?μL?PBST洗滌4次后，每孔加200?μL?5%脫脂奶粉溶液，37℃封閉2?h;每孔加350?μL?PBST洗滌4次后，加ASbLV?CP多克隆抗體反應液（ASbLV?CP多克隆抗體∶PBST=1∶1?000），37℃孵育2?h;每孔加350?μL?PBST?洗滌4次，加HRP標記的羊抗兔二抗反應液（二抗∶PBST=1∶10?000）

，37℃孵育1?h;每孔加350?μL?PBST洗滌4次，加TMB顯色液100?μL，室溫避光顯色15～20?min，顯藍色，若顏色偏淺，可放在37℃?顯色，顯色時間不超過30?min;每孔加終止溶液100?μL，此時藍色變?yōu)辄S色;加入終止液后5?min內進行讀數(shù)，以630?nm為校正波長，用酶標儀測量各孔在450?nm的OD值，并用OD450進行分析。

1.6?ASbLV?CP多克隆抗體的田間應用

利用所制備的ASbLV?CP多克隆抗體，通過間接ELISA法對采自貴陽市修文縣、息烽縣和六盤水市獼猴桃果園的36份獼猴桃葉片樣品進行ASbLV檢測，其中表現(xiàn)為黃化的葉片樣品12份，皺縮的葉片樣品5份，葉斑駁的葉片樣品7份，無明顯癥狀的樣品12份，并利用RTPCR方法進行驗證。獼猴桃葉片的總蛋白使用Sigma公司的Plant?Total?Protein?Extraction?Kit進行提取。

2?結果與分析

2.1?ASbLV?CP基因克隆及原核表達載體的構建

通過RTPCR從感染?ASbLV的獼猴桃葉片總RNA中擴增得到ASbLV?CP基因，長度為?666?bp（圖1a）。將PCR產物純化后連接pUC19T載體，測序驗證無誤后，使用限制性內切酶BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ酶切重組質粒pUC19TASbLVCP和pET28a（+）空載體，回收相應條帶并連接，轉化大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆質粒。雙酶切鑒定重組質粒pET28aASbLVCP，結果得到與預期大小相符的插入片段，說明pET28aASbLVCP重組質粒構建成功（圖1b）。

2.2?ASbLV?CP蛋白的表達、純化及多克隆抗體制備

SDSPAGE?結果表明，與含pET28a（+）空載體的菌株相比，含重組質粒pET28aASbLVCP的菌株可表達大小約28?kD的融合蛋白，與預期結果一致。此外，在16、25、30、37℃條件下，絕大多數(shù)ASbLV?CP蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，上清中ASbLV?CP蛋白表達量較少（圖2a）。利用6×HisTag抗體為一抗進行Western?blot檢測，結果表明含pET28aASbLVCP重組質粒的大腸桿菌總蛋白在分子量約28?kD處有一條特異條帶，而與含pET28a（+）空載體的大腸桿菌總蛋白無特異性反應，說明融合蛋白表達成功（圖2b）。

對用含有不同濃度咪唑的PBS?緩沖液洗脫的重組蛋白進行SDSPAGE檢測，結果表明含濃度為200?mmol/L咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白效果較好，因此選擇其進行蛋白的脫鹽和濃縮。將純化好的蛋白免疫新西蘭大白兔以獲得多克隆抗體。

2.3?ASbLV?CP多克隆抗體效價評價

將多克隆抗體稀釋到不同濃度進行Western?blot?檢測，結果表明1∶1?000、1∶2?000和?1∶4?000都能夠檢測到特異性條帶，1∶8?000和1∶16?000則檢測不到，因此ASbLV?CP?多克隆抗體效價為1∶4?000（圖3）。

2.4?ASbLV?CP多克隆抗體特異性檢測

將多克隆抗體以1∶1?000倍稀釋，利用間接ELISA方法檢測多克隆抗體特異性，結果表明（表1），

感染ASbLV樣品的OD450為0.773，健康樣品的OD450為0.099，OD450是健康樣品OD450的2倍以上，具有良好的陽性反應，而被AcV1、AcVA、ASGV、CLBV、CMV、PVX侵染的獼猴桃葉片的OD450與健康樣品OD450的比值均小于2，說明制備的ASbLV?CP多克隆抗體只對ASbLV有血清學反應，與被AcV1、AcVA、ASGV、CLBV、CMV、PVX侵染的獼猴桃葉片無特異性反應，因此ASbLV?CP多克隆抗體的特異性較好，可應用于田間獼猴桃樣品中的ASbLV檢測。

2.5?ASbLV?CP多克隆抗體的田間應用

使用間接ELISA法對36份獼猴桃田間樣品進行檢測，間接ELISA檢測結果（圖4a）顯示20份樣品被ASbLV侵染，陽性率為55.6%。經RTPCR?（圖4b）方法驗證，間接ELISA與RTPCR檢測結果一致率為100%，說明本研究制備的ASbLV?CP多克隆抗體能夠應用于田間樣品的檢測。

3?結論與討論

目前植物病毒的檢測技術主要有生物學檢測法［12］、血清學檢測法［1314］、電子顯微鏡技術［15］、RTPCR等。血清學檢測方法具有操作簡單、反應快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點，被廣泛應用于植物病毒的檢測，是一種重要的病毒檢測技術［16］?？焖佟蚀_、靈敏的檢測手段對于病毒的檢測和防控至關重要。

本研究克隆了ASbLV貴州分離物的CP基因，構建了pET28aASbLVCP的原核表達載體，pET28aASbLVCP重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta?（DE3）后，經IPTG誘導表達、純化、透析、脫鹽等步驟獲得純化的ASbLV?CP蛋白，并以此為抗原制備了ASbLV?CP的多克隆抗體，使用Western?blot進行了多克隆抗體的效價檢測，使用間接ELISA方法檢測多克隆抗體特異性，結果表明該抗體的效價為1∶4?000且特異性良好。鑒于ASbLV在我國各獼猴桃種植區(qū)廣泛發(fā)生，嚴重制約我國獼猴桃產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此有必要對該病毒的發(fā)生情況進行監(jiān)測和預警。目前，ASbLV的檢測方法主要是RTPCR，未見血清學檢測的相關報道，因此建立快速可靠的血清學檢測技術對ASbLV的檢測和防治十分重要。本研究通過制備ASbLV外殼蛋白的多克隆抗體，建立了ASbLV的間接EILSA檢測方法，該方法能夠有效應用于大批量田間樣品的ASbLV檢測，為今后開展該病毒的檢測和致病分子機理研究奠定基礎。

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（責任編輯：田?喆）