馮柃杰 張玲玉 王曉東 翟彤 甘鵬飛 湯春蕾 康振生 王曉杰

摘要

由條形柄銹菌小麥專化型Puccinia?striiformis?f.?sp.?tritici?（Pst）引起的條銹病，長期嚴重威脅小麥安全生產(chǎn)。Pst通過毒性變異產(chǎn)生新毒性小種或致病類型，能克服生產(chǎn)上已應(yīng)用的抗病基因，導(dǎo)致抗病品種感病。因此，挖掘抗條銹病基因資源對小麥抗病遺傳改良和加快抗病新品種培育具有重要意義。蛋白激酶在應(yīng)答病原菌侵染，傳遞植物免疫信號中發(fā)揮重要作用。本研究通過小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選到參與應(yīng)答Pst、小麥白粉菌Blumeria?graminis?f.?sp.?tritici和赤霉病菌Fusarium?graminearum侵染的蛋白激酶基因TaPiPK1。該蛋白激酶基因編碼551個氨基酸，C末端含有一個STK激酶結(jié)構(gòu)域。利用RTqPCR檢測發(fā)現(xiàn)，TaPiPK1在小麥與條銹菌非親和互作的前期上調(diào)表達;TaPiPK1主要定位于細胞質(zhì)與細胞膜。利用大麥條紋花葉病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（BSMVVIGS）瞬時沉默TaPiPK1，顯著降低小麥‘水源11對條銹菌非親和小種CYR23的抗性，表明TaPiPK1參與小麥抗條銹病反應(yīng)并發(fā)揮重要作用。因此，TaPiPK1有可能作為潛在的基因資源用于小麥抗條銹病育種。

關(guān)鍵詞

小麥;?條銹病;?蛋白激酶;?病毒誘導(dǎo)的基因沉默;?廣譜抗性

中圖分類號：

S?435.121.42

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022172

Functional?analysis?of?protein?kinase?TaPiPK1?in?wheat?resistance?response?to?stripe?rust

FENG?Lingjie#，?ZHANG?Lingyu#，?WANG?Xiaodong，?ZHAI?Tong，?GAN?Pengfei，

TANG?Chunlei，?KANG?Zhensheng，?WANG?Xiaojie*

（Sate?Key?Laboratory?of?Crop?Stress?Biology?in?Arid?Areas，College?of?Plant?Protection，?Northwest?A?&?F?University，?Yangling?712100，?China）

Abstract

Wheat?stripe?rust，?caused?by?Puccinia?striiformis?f.?sp.?tritici?（Pst），?is?a?serious?threat?to?wheat?production.?Pst?frequently?produces?new?virulent?races?or?pathogenic?types?overcoming?the?diseaseresistant?genes?applied?in?wheat?production?through?frequent?virulence?variation，?subsequently?leading?to?the?susceptibility?of?resistant?varieties?to?diseases.?Therefore，?excavating?genetic?resources?of?resistance?is?of?great?significance?for?the?genetic?improvement?of?wheat?disease?resistance?and?accelerating?diseaseresistance?breeding.?Protein?kinases?play?an?important?role?in?the?transmission?of?plant?immune?signals?in?response?to?pathogen?infection.?In?this?study，?a?protein?kinase?gene?TaPiPK1?involved?in?response?to?Pst，?Blumeria?graminis?f.?sp.?tritici?and?Fusarium?graminearum?was?identified?by?analyzing?wheat?transcriptome?data.?TaPiPK1?encoded?551?amino?acids，?and?contained?a?serinethreonine?kinase?domain?at?Cterminal.?RTqPCR?results?showed?that?the?expression?of?TaPiPK1?was?upregulated?in?the?early?stage?of?incompatible?interaction?between?wheat?and?Pst.?Subcellular?localization?revealed?that?TaPiPK1?was?mainly?localized?in?cytoplasm?and?cell?membrane.?Transient?silencing?of?TaPiPK1?by?barley?stripe?mosaic?virusmediated?gene?silencing?technique?（BSMVVIGS）?significantly?reduced?the?resistance?of?wheat?‘Suwon?11?to?Pst?CYR23，?indicating?that?TaPiPK1?plays?an?important?role?in?wheat?stripe?rust?resistance.?Therefore，?TaPiPK1?may?be?a?potentially?important?gene?resource?for?breeding?for?stripe?rust?resistance?in?wheat.

Key?words

wheat;?stripe?rust;?protein?kinase;?VIGS;?broadspectrum?resistance

條銹病是我國小麥生產(chǎn)上的主要病害之一，其病原菌是條形柄銹菌小麥專化型Puccinia?striiformis?f.?sp.?tritici?（Pst）［1］。病原菌夏孢子能夠隨氣流遠距離傳播，危害范圍廣，造成小麥5%～25%產(chǎn)量損失，對我國糧食安全構(gòu)成嚴重威脅［2］。種植抗條銹病品種是最經(jīng)濟有效的病害防控策略。然而，條銹菌群體頻繁發(fā)生毒性變異導(dǎo)致小麥品種喪失抗病性［23］。挖掘抗病新基因資源對于小麥條銹病的可持續(xù)防控具有重要意義。

蛋白激酶超家族主要由絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶和酪氨酸特異性蛋白激酶組成，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是生物體中重要的蛋白激酶家族，參與植物體內(nèi)蛋白磷酸化，在信號傳遞中起著重要作用［4］。據(jù)研究，玉米［56］、水稻［7］、大豆［8］以及小麥［910］等多種植物的蛋白激酶參與干旱、鹽及生物脅迫反應(yīng)等多種信號傳遞途徑。小麥基因組編碼超過4?000個蛋白激酶基因，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、類受體激酶（RLK）、細胞質(zhì)受體類激酶（RLCK）等多種類型，在調(diào)控小麥生長發(fā)育及應(yīng)答各種環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用［11］。MAPK含有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其級聯(lián)反應(yīng)是高度保守的信號傳導(dǎo)模塊，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及應(yīng)對生物及非生物脅迫［12］。另外，一些抗病基因如水稻抗白葉枯病基因Xa21［13］、小麥抗葉銹病基因Lr10［14］、大麥抗桿銹病基因Rpg1［15］和番茄抗細菌性斑點病基因Pto［16］編碼的抗病蛋白都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，屬于類受體激酶，在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究通過分析小麥與條銹菌互作過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到受條銹菌侵染誘導(dǎo)上調(diào)表達的蛋白激酶基因TaPiPK1。利用RTqPCR分析了TaPiPK1在小麥條銹菌互作過程中的表達特征，并利用VIGS技術(shù)分析了TaPiPK1在小麥抗條銹菌反應(yīng)中的功能，以期為小麥抗病遺傳改良提供新基因資源。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

植物材料及培養(yǎng)條件：小麥品種‘水源11，培養(yǎng)溫度為16～20℃;本氏煙Nicotiana?benthamiana，培養(yǎng)溫度為25～28℃。光周期L∥D=16?h∥8?h。

菌株材料：小麥條銹菌小種條中23號（CYR23），工程菌株大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101。

質(zhì)粒載體：?pCAMBIA1302用于亞細胞定位表達載體構(gòu)建;課題組保存的大麥條紋花葉病毒（barley?stripe?mosaic?virus，?BSMV）BSMV∶α、BSMV∶β、BSMV∶γ載體，用于VIGS瞬時沉默試驗。

1.2?試驗方法

1.2.1?TaPiPK1克隆及序列分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLAST工具比對得到TaPiPK1全長序列。利用Primer?Premier?5.0設(shè)計TaPiPK1擴增引物（TaPiPK1F和TaPiPK1R，序列見表1）并由北京擎科生物公司合成，以‘水源11總cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增程序為：98℃?5?min;98℃?30?s，58℃?30?s，72℃?1?min，35個循環(huán);72℃?10?min?；厥漳康钠尾y序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫和Ensembl（https：∥plants.ensembl.org/Multi/Tools/Blast）在線數(shù)據(jù)庫對測序序列進行比對進行分析。使用WheatOmics?1.0（http：∥wheatomics.sdau.edu.cn/expression/index.html）

的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了

TaPiPK1在病原菌誘導(dǎo)和高溫等脅迫下的基因表達情況。利用DeePLoc?2.0、CBSTMHMM和CBSsignal等在線工具預(yù)測TaPiPK1的亞細胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽等信息。

1.2.2?TaPiPK1表達模式分析

分析TaPiPK1特異性序列，設(shè)計引物（TaPiPK1qRTF和TaPiPK1qRTR）;以小麥延伸因子TaEF1α基因為內(nèi)參基因［17］，以接種條銹菌CYR23后不同時間點制備的小麥葉片cDNA為模板，使用Vazyme公司的染料法熒光定量Mix，進行qPCR擴增。反應(yīng)體系為：2×ChamQ?SYBR?qPCR?Master?Mix?10?μL，TaPiPK1qRTF（10?μmol/L）0.4?μL，TaPiPK1qRTR（10?μmol/L）0.4?μL，小麥各時間點cDNA?2?μL，ddH2O補足至20?μL。反應(yīng)程序為：95℃?30?s;90℃?10?s，60℃?30?s，40個循環(huán);95℃?10?s，60℃?60?s，95℃?15?s。每個處理樣本進行３次重復(fù)，確定溶解曲線和熒光變化曲線正常，利用2-ΔΔCt法計算不同時間點目的基因的相對表達量［18］。

1.2.3?TaPiPK1亞細胞定位

根據(jù)TaPiPK1的CDS序列（去終止子）設(shè)計引物（TaPiPK1pCAMBIA1302F和TaPiPK1pCAMBIA1302R），PCR擴增獲得的基因片段連接到攜帶GFP標簽的pCAMBIA1302載體上，構(gòu)建TaPiPK1∶GFP融合表達載體。將融合表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，擴大培養(yǎng)陽性克隆，4?000?r/min離心收集菌體，利用10?mmol/L的MgCl2溶液清洗3次，用乙酰丁香酮緩沖液［含10?mmol/L?MgCl2，10?μmol/L?乙酰丁香酮（AS），10?mmol/L?2（N嗎啡啉）乙磺酸（MES），pH?5.6］重懸菌體并稀釋至OD600=0.3，置于黑暗條件下1?h，用于煙草注射。選取生長3～4周的本生煙葉片進行農(nóng)桿菌注射。注射48?h后，在激光共聚焦顯微鏡（Olympus?FV3000）下觀察融合蛋白表達情況及其在細胞內(nèi)的分布。用液氮將觀察到熒光的煙草葉片研磨成粉狀，使用Beyotime公司的植物Western及IP細胞裂解液試劑盒提取煙草葉片蛋白，進行Western?blot檢測。

1.2.4?大麥條形花葉病毒介導(dǎo)的TaPiPK1基因沉默

大麥條形花葉病毒（BSMV）介導(dǎo)的VIGS技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于小麥基因功能研究，該技術(shù)體系包含BSMV∶α、BSMV∶β和BSMV∶γ?3個載體。將100～300?bp的靶標片段連接到BSMV∶γ載體上，通過與BSMV∶α、BSMV∶β進行病毒重組可以有效地將靶標基因瞬時沉默［19］。本研究利用NCBI的?Blastn工具分析TaPiPK1的同源序列并選取TaPiPK1特有的300?bp?核苷酸片段，設(shè)計引物（TaPiPK1γF和TaPiPK1γR，序列見表1）擴增并回收擴增片段。利用一步克隆法將目的片段構(gòu)建至經(jīng)PacⅠ和NotⅠ雙酶切的BSMV∶γ載體上，得到BSMV∶γTaPiPK1質(zhì)粒。利用BssHⅡ?qū)SMV∶γTaPiPK1、BSMV∶γPDS質(zhì)粒進行酶切線性化;利用Mlu?I對BSMV∶α、BSMV∶γ質(zhì)粒進行酶切線性化;利用SpeI對BSMV∶β質(zhì)粒進行酶切線性化。以相同濃度的線性化產(chǎn)物為模板，利用RiboMAXTM?Large?Scale?RNA?Production?SystemsT7試劑盒（Promega，美國）進行體外轉(zhuǎn)錄，凝膠電泳檢測后，剩余產(chǎn)物用DEPC水稀釋備用。

取體外轉(zhuǎn)錄好的BSMV∶α、BSMV∶β各0.5?μL分別與0.5?μL的BSMV∶γPDS、BSMV∶γ和BSMV∶γTaPiPK1按1∶1∶1的體積比混合，再加入FES?buffer（2.613?g磷酸氫二鉀，1.877?g甘氨酸，0.5?g焦磷酸鈉，0.5?g硅藻土，0.5?g?斑脫土，定容至50?mL高溫蒸汽滅菌后使用）混勻。將小麥品種‘水源11在16℃條件下培養(yǎng)至兩葉一心期。通過涂抹的方式將重組病毒接種到小麥的第二葉。八氫番茄紅素脫氫酶基因PDS是葉綠素合成中的重要基因，缺失后會導(dǎo)致植物出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，試驗中將單獨涂抹FES?buffer的植物作為陰性對照，將接種BSMV∶γPDS的植株作為病毒接種的陽性對照，以判斷病毒接種是否成功［20］。接種2周后觀察到接種BSMV∶γPDS的小麥植株第3葉出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象后，將接種BSMV∶γTaPiPK1和空載體對照（BSMV∶γ）的植株第4葉分別接種條銹菌CYR23，在0、24、48、120?h后分別取接種條銹菌的葉片作為樣本，用于組織學(xué)觀察和基因表達分析。接種14?d后觀察表型，統(tǒng)計發(fā)病情況。利用WGAAlex?488熒光染料對葉片中的條銹菌菌絲進行染色，在熒光顯微鏡下觀察、統(tǒng)計菌絲的發(fā)育情況［17］。

2?結(jié)果與分析

2.1?TaPiPK基因的克隆和序列分析

TaPiPK1的CDS序列包含1?656個堿基，編碼551個氨基酸，含有保守的STK激酶結(jié)構(gòu)域，無信號肽和跨膜區(qū)域，預(yù)測TaPiPK1定位于細胞質(zhì)中。利用WheatOmics?1.0對TaPiPK1在多種脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析［2124］，結(jié)果表明TaPiPK1（Ensemble?plant中的登錄號為TraesCS7B02G255500）的表達受Pst、赤霉菌Fusarium?graminearum和白粉菌Blumeria?graminis?f.?sp.?tritici等病菌的誘導(dǎo)，同時也受干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)（圖1）。

2.2?TaPiPK1在條銹菌侵染過程中的表達特征

RTqPCR結(jié)果顯示，在條銹菌與小麥的非親和互作中，TaPiPK1主要在病原菌侵染后12、24?h和48?h表達，在接種后12?h相對表達量約為0?h的5倍，達到表達量的峰值（圖2）。推測TaPiPK1可能在小麥應(yīng)答條銹菌侵染早期發(fā)揮作用。

2.3?瞬時沉默TaPiPK1減弱了小麥對條銹菌的抗性

接種病毒后10～12?d，接種BSMV∶γPDS的小麥植株出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，接種BSMV∶γTaPiPK1、BSMV∶γ的植株均出現(xiàn)明顯的病毒癥狀，表明病毒接種成功?（圖3a）。接種條銹菌CYR23后14?d，發(fā)現(xiàn)接種BSMV∶γ的葉片出現(xiàn)典型的

過敏性壞死反應(yīng)，無夏孢子堆，而沉默TaPiPK1的植株產(chǎn)生了少量夏孢子堆（圖3b）。

利用RTqPCR技術(shù)分別對條銹菌侵染24、48?h和120?h后

TaPiPK1的表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)，與接種BSMV∶γ植株相比，接種BSMV∶γTaPiPK1植株中TaPiPK1的表達量顯著降低，在24、48?h和120?h分別減少58.1%、61.4%、45.3%，表明TaPiPK1被有效沉默（圖3c）。以上結(jié)果表明沉默TaPiPK1減弱了小麥的抗病性，正調(diào)控小麥抗條銹菌反應(yīng)。

2.4?沉默TaPiPK1促進了條銹菌在小麥葉片中的發(fā)育

利用組織學(xué)觀察條銹菌菌絲生長發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)在24?h和48?h，TaPiPK1沉默葉片中條銹菌侵染菌絲長度顯著大于對照，菌絲擴展面積也顯著大于對照葉片（圖4）。沉默TaPiPK1促進了小麥葉片中條銹菌的生長發(fā)育（圖4）。

2.4?TaPiPK1亞細胞定位分析

為了探究TaPiPK1發(fā)揮作用的部位，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達技術(shù)將TaPiPK1∶GFP融合載體在煙草中瞬時表達，以只表達GFP的葉片為對照，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TaPiPK1∶GFP綠色熒光主要分布于煙草細胞的細胞膜和細胞質(zhì)（圖5a）。?為了確定TaPiPK1∶GFP和GFP是否正確表達，提取對應(yīng)煙草葉片總蛋白進行Western?blot分析，結(jié)果分別檢測到75?kD及25?kD的條帶，與目的蛋白分子量一致，證明蛋白在煙草中正確表達（圖5b）。

3?結(jié)論與討論

在條銹菌侵染小麥過程中，夏孢子萌發(fā)形成的芽管侵入氣孔，形成氣孔下囊和初生菌絲，初生菌絲向葉肉細胞侵染形成吸器母細胞，在侵染12～24?h產(chǎn)生大量吸器［2526］。吸器是條銹菌從寄主吸取營養(yǎng)的特化結(jié)構(gòu)，也是條銹菌向小麥分泌效應(yīng)蛋白抑制小麥免疫的重要結(jié)構(gòu)。因此，吸器形成的時期是決定條銹菌能否成功定殖的關(guān)鍵時期，也是小麥防衛(wèi)反應(yīng)最強烈的時期。在非親和互作中，TaPiPK1在條銹菌侵入小麥12?h和24?h顯著上調(diào)表達，表明TaPiPK1可能在這一關(guān)鍵時期發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)一些抗病基因具有激酶結(jié)構(gòu)域，小麥抗條銹基因Yr36編碼的抗病蛋白含有激酶結(jié)構(gòu)域，在高溫下介導(dǎo)對多個條銹菌系的廣譜抗性［27］;小麥抗赤霉病基因WAK2編碼一類細胞壁受體激酶，可以有效調(diào)控對于赤霉病的抗性［28］;小麥葉枯病抗病基因STB6?編碼一個富含半胱氨酸的受體激酶，對攜帶AvrStb6基因的菌株具有基因?qū)蝾愋偷目剐裕?9］。另外，一些類受體激酶或胞內(nèi)蛋白激酶在調(diào)控小麥的抗病中也發(fā)揮重要作用［30］。TaCRK3是富含半胱氨酸類受體蛋白激

酶，通過基因沉默發(fā)現(xiàn)其具有抗真菌活性，并能夠調(diào)控乙烯信號通路中防御相關(guān)基因表達從而介導(dǎo)小麥對禾谷鐮孢Fusarium?graminearum的抗性［31］。在小麥中TaRLCK1B屬于第Ⅶ亞家族的類受體胞質(zhì)激酶，正調(diào)控小麥對小麥紋枯病的抗性，在抗性品種中的表達水平顯著高于感病品種［32］。在簇毛麥Dasypyrum?villosum中鑒定到的RLKV蛋白激酶能夠調(diào)節(jié)小麥對白粉病的基礎(chǔ)抗性［33］。本研究通過基因沉默試驗發(fā)現(xiàn)TaPiPK1正調(diào)控小麥對條銹病的抗性。小麥抗病基因STB6在葉枯病菌Zymoseptoria?tritici誘導(dǎo)后24?h上調(diào)表達［29］，TaRLCK1B受小麥紋枯病菌Rhizoctonia?cerealis誘導(dǎo)后24?h和48?h上調(diào)表達［32］，與這兩個基因類似，TaPiPK1在條銹菌侵染前期上調(diào)表達。另外，TaPiPK1與STB6、TaCRK3等抗病相關(guān)蛋白激酶均定位于細胞質(zhì)和細胞膜，表明其發(fā)揮作用的位置是類似的。不同的是，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)TaPiPK1響應(yīng)條銹病、白粉病、赤霉病等多種病害以及干旱、高溫、高鹽等非生物脅迫，推測TaPiPK1可能在小麥應(yīng)對生物脅迫、非生物脅迫中發(fā)揮一定的作用，有可能作為小麥遺傳改良中兼具廣譜抗病性及抗逆性的候選基因。

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