鄧振山 李買平 郝雷 陳凱凱 柳曉東 姜影影 賀曉龍

摘 要 為進(jìn)一步開發(fā)蘋果根際促生菌資源，以陜北蘋果樹根際土壤為材料進(jìn)行根際促生細(xì)菌的篩選。以溶磷、解鉀和產(chǎn)鐵載體作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定初篩菌株的多種促生能力，并通過(guò)16S rDNA序列同源分析，對(duì)篩選出的促生效果最好的菌株進(jìn)行分類鑒定，并采用單菌單獨(dú)接種和多菌混合接種的小麥盆栽試驗(yàn)，測(cè)定其促生效應(yīng)。結(jié)果表明：從陜北不同產(chǎn)地蘋果根際土壤中篩選獲得131株細(xì)菌，具有溶磷能力的菌株共17株，占總分離菌株的10.68%，其中11株細(xì)菌能夠溶解無(wú)機(jī)磷，6株細(xì)菌能夠溶解有機(jī)磷；可產(chǎn)鐵載體的有24株，占總分離菌株的18.32%，YS-28和YC-31具有解鉀能力。基于16S rDNA序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析將其中的24株歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、白色桿菌屬（Leucobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）。從中篩選出屬于芽孢桿菌屬（LC-22、YC-31、LC-19）和假單胞菌屬（LC-2）的高活性菌株的小麥盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)LC-22、YC-31和LC-19混合菌液處理，小麥幼苗鮮質(zhì)量增加96.12%；經(jīng)LC-22、LC-19和LC-2混合菌液處理，小麥葉綠素含量增加41.31%。可見：從蘋果根際土壤中所篩選的促生菌株，可以作為微生物肥料儲(chǔ)備菌種。

關(guān)鍵詞 蘋果；根際促生菌；促生效應(yīng)：盆栽試驗(yàn)

蘋果（Malus? domestica），屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus? Mill）的植物，為落葉喬木。目前，中國(guó)蘋果種植在空間分布上呈現(xiàn)出以陜西省和山東省為中心的“雙中心”分布特征，且陜西逐漸成為中國(guó)重要的蘋果生產(chǎn)大省[1]。近年來(lái)，由于果農(nóng)片面依靠肥料養(yǎng)分投入和過(guò)分追求產(chǎn)量而施用大量化肥，破壞了土壤中微生態(tài)的平衡，導(dǎo)致土壤板結(jié)、養(yǎng)分失調(diào)等諸多嚴(yán)重的資源環(huán)境問題。植物根系與微生物互作對(duì)于植物養(yǎng)分吸收，耐受脅迫及抗病等方面具有重要作用，生物菌肥是一種新型的環(huán)境友好型肥料，其內(nèi)所含的植物根際促生菌等有益微生物不僅能給植物提供營(yíng)養(yǎng)、降低病蟲害發(fā)生，對(duì)植物起到增產(chǎn)的作用，而且還能改善土壤質(zhì)量，防止其二次污染[2]。因此，對(duì)進(jìn)一步揭示其生態(tài)學(xué)意義及功能菌株的開發(fā)和利用具有重要意義。

根際是指受植物根系及其植物根部活動(dòng)直接影響的根系周圍1～2 mm內(nèi)的土壤微域[3-4]。該生態(tài)位包含有大量微生物如真菌、細(xì)菌、放線菌等，其中細(xì)菌在該區(qū)域的種類和數(shù)量最為豐富，通常將這些細(xì)菌稱之為根際細(xì)菌[5]。植物促生細(xì)菌是指在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中能直接或間接地促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育或?qū)Σ≡修卓棺饔玫挠幸婕?xì)菌的統(tǒng)稱[6-7]。它們可以自由生活在植物根際土壤周圍，也可以定殖在植物根系表皮或內(nèi)部，通過(guò)活化植物根系周圍土壤中的養(yǎng)分，來(lái)提高植物對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用，有利于植物的健康生長(zhǎng)。

近年來(lái)，由于根際土壤微生物豐富的物種多樣性，使其越來(lái)越成為微生物研究的前沿和熱點(diǎn)。張偉等[8]以豌豆根際土壤為研究對(duì)象，確定了根際土壤細(xì)菌的植物促生活性。楊光柱等[9]基于高通量測(cè)序的蘋果根際土壤細(xì)菌組成與多樣性分析，結(jié)果表明蘋果根際土壤中，存在Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Erwinia、Flavobacterium、Rhizobium、Serratia和Microbacterium等促生微生物。這說(shuō)明蘋果根際土壤細(xì)菌具有豐富的多樣性，是寶貴的功能微生物種質(zhì)資源庫(kù)，對(duì)其挖掘有重要的理論和實(shí)踐意義。但陜北地區(qū)蘋果根際土壤微生物多樣性以及與植物互作增效的分子機(jī)制的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，如何充分發(fā)揮蘋果與根際微生物良性互作、提高蘋果對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用效率仍然是急需解決的瓶頸問題。

本試驗(yàn)以陜北地區(qū)蘋果根際土壤為研究對(duì)象，采用梯度稀釋法和平板分離法，對(duì)篩選到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其促生功能進(jìn)行研究，旨在挖掘陜北地區(qū)蘋果根際促生菌種質(zhì)資源，為微生物肥料和微生物菌劑方面的研發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 樣品的采集與處理 于2020年9月從陜西延安市寶塔區(qū)、延長(zhǎng)縣、洛川縣和宜川縣4個(gè)區(qū)縣（表1），每個(gè)區(qū)縣選3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選擇3個(gè)以上的健康果園，15 a樹齡，砧木為昭通海棠，品種為‘紅富士。每個(gè)果園采樣點(diǎn)按照五點(diǎn)取樣的方法，每個(gè)取樣點(diǎn)隨機(jī)選取相隔一定距離且長(zhǎng)勢(shì)良好的紅富士蘋果樹6棵，以每棵果樹樹干為中心，分別在東南西北4個(gè)方向上距離樹干1～2 m范圍內(nèi)用鐵鍬垂直下挖30～50 cm左右將根暴露出來(lái)，釆集根際土壤樣品，包裝帶回實(shí)驗(yàn)室，暫時(shí)存放于4 ℃冰箱中，2 d內(nèi)處理完成。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，馬鈴薯200 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，牛肉膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH?7.2～7.4。R2A培養(yǎng)基：酸性酪蛋白水解物0.5 g，蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，酵母粉 0.5 g，淀粉0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，丙酮酸鈉 0.3 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。pH 7.2～7.5。PYG培養(yǎng)基：酵母粉0.2 g，葡萄糖5 g，牛肉膏3 g，細(xì)菌蛋白胨5? g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5。PKO培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.3 g，NaCl?0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4 ·7H2O?0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25 g，酵母提取物0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 ·7H2O 0.03 g，MnSO4 ·4H2O 0.03 g，酵母提取物0.5 g，卵磷脂 1 g，瓊脂15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。解鉀培養(yǎng)基：NH4NO3 3.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·7H2O 0.1 g，蔗糖15 g，鉀長(zhǎng)石粉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。CAS檢測(cè)培養(yǎng)基：20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪蛋白3 mL，1 mmol·L-1 CaCl2 100 μL，0.1 mo·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=6.8） 0.5 mL，CAS染液（a液：將0.012 g CAS溶于10 mL去離子水中，與2 mL?1 mmol·L-1FeCl3混合；b液：將0.015 g CTAB溶于8 mL去離子水中；將a液與b液混合）5 mL。

1.2 方 法

1.2.1 蘋果根際土壤細(xì)菌的分離純化 采用稀釋梯度法[10]對(duì)蘋果根際土壤細(xì)菌進(jìn)行篩選。將收集到的根際土壤稱取10 g，加入盛有90 mL無(wú)菌水和玻璃珠的250 mL滅菌三角瓶中，置于搖床上160 r·min-1振蕩30 min，將根際土壤充分溶解，使土壤中的微生物完全釋放出來(lái)，既得10-1濃度的土壤懸濁液，靜置30 s。在超凈工作臺(tái)里，用1 mL無(wú)菌吸管吸取10-1濃度的土壤懸濁液于裝有9 mL無(wú)菌水試管中，吹吸3次混勻，既得10-2濃度的土壤懸濁液。依次從10-2 連續(xù)稀釋到10-5 ，即得一系列土壤稀釋液，用移液槍分別吸取10-3到10-5土壤懸液50 μL，分別接種于已制好的R2A、NA和PYG培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的涂布器涂抹均勻。每個(gè)濃度梯度分別接種3個(gè)平板，于28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)3～5 d。待培養(yǎng)基中有可見菌落時(shí)，將菌落挑取移入相應(yīng)培養(yǎng)基純化，并進(jìn)行菌落形態(tài)描述、編號(hào)后，置于4? ?℃冰箱中，備用。

1.2.2 菌株促生能力的測(cè)定 溶磷能力的測(cè)定：將供試菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行活化后分別接種在無(wú)機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，倒置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈出現(xiàn)，若出現(xiàn)透明圈，則初步說(shuō)明該菌株具有溶磷能力[11]。用測(cè)微尺分別測(cè)量菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D）[12-13]，并計(jì)算可溶性指數(shù)（D/d）值，可溶性指數(shù)越大，則說(shuō)明該菌株溶磷能力越強(qiáng)。

解鉀能力檢測(cè)：將待測(cè)菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h，然后點(diǎn)接在解鉀培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落四周透明的解鉀圈。若存在透明圈，說(shuō)明該菌株具有解鉀能力。分別測(cè)量菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），可溶性指數(shù)（D/d）值，可溶性指數(shù)越大，則說(shuō)明該菌株解鉀能力越強(qiáng)[14]。

產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接種于CAS培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，如果平板上生長(zhǎng)的菌株能夠產(chǎn)生鐵載體，檢測(cè)平板中的藍(lán)色便會(huì)褪去，從而證明該菌株具有產(chǎn)鐵載體的能力[15]。

1.2.3 促生菌株16S rDNA序列測(cè)定及分子鑒定 16S rDNA 序列的PCR擴(kuò)增：將待測(cè)的供試菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征。按照菌落PCR[15]方法擴(kuò)增促生菌株的16S? rDNA，采用細(xì)菌通用引物，序列為：P1（5′-CGGGATCCA-GAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和P6（5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）[16]。所用引物由擎科生物合成。

試驗(yàn)擴(kuò)增目的基因所用的PCR反應(yīng)體系為2×Es Taq Masterase 25 μL，上游引物P1（10 μmo·L-1）1 μL，下游引物P6（10 μmo·L-1）1 μL，模板DNA? 1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55? ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)，72 ℃，5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，條件為90 V、30 min，在紫外分析儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。

16S rDNA序列測(cè)定、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析：將16S rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，所用引物與PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物相同。將獲得的16S rDNA序列提交到NCBI的GenBank基因庫(kù)，獲得GenBank號(hào)。同時(shí)進(jìn)行序列比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性分析，選用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征[17]。

1.2.4 菌株促生長(zhǎng)試驗(yàn) 促生菌株間親和性測(cè)試：使用兩兩交叉劃線法測(cè)試各菌株之間的拮抗作用[15]。將促生特性良好的供試菌株每?jī)蓚€(gè)交叉，通過(guò)平板劃線接種至牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d，每隔24 h觀察交叉點(diǎn)的菌株生長(zhǎng)狀況，判斷兩細(xì)菌間有無(wú)抑制作用[18]。如果交叉處菌株可以正常生長(zhǎng)，則說(shuō)明菌株間不存在拮抗作用，即可共同培養(yǎng)[15]。

促生菌株接種劑的制備：選擇上述促生特性最好的4株供試菌株LC-22、YC-31、LC-19和LC-2作為代表菌株，分別接種于PYG液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r·min-1培養(yǎng)1～2 d。待菌株充分生長(zhǎng)后，分別將4株供試菌株發(fā)酵液8 000?r·min-1離心5 min，去上清并用無(wú)菌水重懸至菌懸液濃度為1×109 cfu·mL-1（OD660≈1）。在每個(gè)250 mL的三角瓶?jī)?nèi)裝入100 mL PYG液體培養(yǎng)基，高溫滅菌后按照表2中的處理要求分別接種20 mL上述各菌懸液（2株：V∶V=1∶1；3株：V∶V ∶V=1∶1 ∶1；4株：V∶V ∶V ∶V=1∶1 ∶1 ∶1），于37 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)2～3 d，8 000?r·min-1離心5 min，去上清并用無(wú)菌水重懸至菌懸液濃度為1×109 cfu·mL-1（OD660≈1），即得菌株接種劑[19]。

接種處理：挑取飽滿、無(wú)霉變、無(wú)破損的小麥種子（無(wú)包衣），用75%的酒精浸泡30 s進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水清洗5～8次后，分別置于裝有20 mL上述各處理菌株接種劑的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。裝接種劑之前，每個(gè)皿中放兩層無(wú)菌濾紙，以保持浸泡過(guò)程中培養(yǎng)皿內(nèi)的濕度。種子露白后，將露白的種子播種在裝有滅菌珍珠巖和蛭石（V∶V=1∶1）的花盆中，每盆播種30粒小麥種子，深度約1 cm左右，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并以無(wú)菌水保持其水分充足。待小麥苗出齊后，每盆定苗20株，每周接種菌劑100 mL 1次，共4次，對(duì)照同樣澆滅菌水100 mL，每2 d澆1次無(wú)菌水。40 d后測(cè)定小麥苗的株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量（整個(gè)植株）、葉綠素含量等生物量指標(biāo)[20]。用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果根際土壤促生菌菌株的篩選

從陜北蘋果根際土壤中分離、純化共獲得131株細(xì)菌菌株，其中，洛川縣29株，編號(hào)為L(zhǎng)C；寶塔區(qū)33株，編號(hào)為BT；延長(zhǎng)縣39株，編號(hào)為YS；宜川縣30株，編號(hào)為YC，占總分離菌株數(shù)的比例分別為22.14%、25.19%、29.77%、22.91%。其中17株具有溶磷能力，2株具有解鉀能力，24株具有產(chǎn)鐵載體的能力。

2.1.1 溶磷能力 各菌株溶解磷能力的檢測(cè)結(jié)果表明：從蘋果根際土壤共篩出11株溶無(wú)機(jī)磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌，占全部分離菌株的8.4%?？扇苄灾笖?shù)大于4的有4株，分別為L(zhǎng)C-22、LC-1、?LC-2、LC-7，其中LC-22最高（見表3和圖1）；從蘋果根際土壤共篩出6株溶有機(jī)磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌，可溶性指數(shù)大于3的有3株，分別為BT-23、LC-7、LC-2，其中LC-2最高（見表4），4株同時(shí)對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷都表現(xiàn)出溶解能力，其中LC-2均對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷有較好的溶解能力。

2.1.2 產(chǎn)鐵載體能力 根據(jù)各菌株在CAS檢測(cè)培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生橘黃色或無(wú)色的暈圈，篩選具有產(chǎn)鐵載體能力的細(xì)菌菌株。由表5可知，從分離到的131株細(xì)菌中共篩到24株產(chǎn)鐵載體能力較好的細(xì)菌，占全部分離菌株的18.4%。其中，D/d值大于2的有4株細(xì)菌，分別為L(zhǎng)C-19、YC-18、LC-7、YC-17，且LC-19的D/d值最大，LC-19產(chǎn)鐵載體的能力最強(qiáng)。此外，從溶磷特性結(jié)果來(lái)看，LC-7菌株還具有較強(qiáng)的溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷能力，是一株既能溶磷又能產(chǎn)鐵載體的功能菌株。

2.1.3 解鉀能力 由表6可知，從分離到的131株細(xì)菌中共篩到2株解鉀效果較好的細(xì)菌。分別為YS-28和YC-31，其中YC-31的可溶性指數(shù)最高，表明其解鉀能力較強(qiáng)。

2.2 促生菌株間親和性測(cè)試

選擇上述促生效果好的菌株YC-31、LC-19、LC-22和 LC-2間兩兩劃線交叉處均有菌株生長(zhǎng)，表明這些菌株間無(wú)拮抗作用，可以用作混合菌劑的制備。

2.3 菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)菌株促生活性測(cè)定結(jié)果，選擇具有較高的單一促生活性或多種促生活性的24個(gè)代表菌株，對(duì)分離的各類群代表菌株進(jìn)行16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析和鑒定，采用MEGA? 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示：這24株具促生特性的蘋果根際細(xì)菌16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的相關(guān)菌株16S rDNA序列的相似性均達(dá)到99.01%以上，其GenBank序列號(hào)分別是MF988701～MF988725。這24株促生菌分別歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、白色桿菌屬（Leucobacter）、紅球菌屬（Rhodococcus）的系統(tǒng)發(fā)育分支上，說(shuō)明蘋果樹根際和根內(nèi)具促生特性的細(xì)菌存在豐富的種屬多樣性。分支Ⅰ為芽孢桿菌屬，共有13株菌，菌株LC-22和YC-21的最相似菌株分別為Terribacillus sp.和Bacillus thuringiensis；BT-4、BT-6、YC-31、YS-2、LC-19的最相似菌株均為Bacillus subtilis；菌株YS-30、YS-17、YC-2、LC-15、BT-11、BT-10的最相似菌株均為Bacillus sp.。分支Ⅱ由菌株YC-12和其他參比菌株組成。菌株YC-12的最相似菌株為Pseudochrobactrum saccharolyticum。分支Ⅲ為假單胞菌屬，有10株菌。菌株LC-7、LC-2、YC-4、YS-14、YS-4的最相似菌株分別為Pseudomona smandelii和Pseudomonas silesiensis；LC-8、YC-18、BT-23最相似菌株均為Pseudomonas sp.；LC-1的最相似菌株為Pseudomonas? oryzihabitans。分支Ⅳ由菌株YS-28和其他參比菌株組成。菌株YS-28的最相似菌株為L(zhǎng)eucobacter sp.。分支Ⅴ為紅球菌屬，由菌株YC-3和其他參比菌株組成。菌株YC-3的最相似菌株為Rhodococcus erythropolis。

2.4 盆栽試驗(yàn)

由表7可知， 對(duì)小麥的促生效應(yīng)的表現(xiàn)結(jié)果上看，單菌接種與多菌混合接種各處理組均高于對(duì)照組（圖3），差異顯著（P<0.05）。除少數(shù)例外，總體上，多菌混合接種明顯優(yōu)于單菌接種。在株高上，與對(duì)照組相比較，小麥增加幅度為8.57%～28.5%，其中WXY多菌混合接種處理組對(duì)小麥株高的促生影響最為明顯（增幅為28.5%），而WYZ處理對(duì)小麥株高的影響最小，比對(duì)照僅增加8.57%。根際促生菌各處理之間對(duì)小麥根長(zhǎng)的影響有差異，單菌接種W組、X組、Y組與對(duì)照組相比較分別增加56.98%、32.79%、22.37%，單株菌Z組處理下的小麥根長(zhǎng)增加幅度最高，達(dá)到71.32%，差異顯著（P<0.05）?？傮w上，混合菌液接種處理效果均高于對(duì)照（圖4），小麥根長(zhǎng)增加幅度為5.38%～70.19%，其中根長(zhǎng)增幅最少的是WXYZ處理組，僅為5.38%，遠(yuǎn)低于單菌接種的效果，差異顯著（P<0.05）。此結(jié)果說(shuō)明并不是所有多菌接種處理組對(duì)小麥的促生效果都優(yōu)于單菌接種。在小麥的鮮質(zhì)量上，與對(duì)照組相比，無(wú)論是單株菌接種組還是混菌接種組，其對(duì)小麥幼苗鮮質(zhì)量均有不同程度的促生效果。單菌接種X組、Z組、W組及Y組與對(duì)照組相比較分別增加29.62%、34.62%、60%和70%，差異不顯著。與對(duì)照組相比較，多菌混合接種各處理組的小麥鮮質(zhì)量增加幅度為10.38%～96.15%。在葉綠素含量上，除XZ處理組外，其他多菌接種處理組對(duì)小麥葉綠素含量的促生影響均優(yōu)于單菌接種處理組。與對(duì)照組相比，XYZ處理組的葉綠素含量增幅最大（37.73），其次是WZ處理組（37.70），其增幅分別為42.31%和33.21%，差異顯著（P<0.05）。而小麥幼苗葉綠素含量增幅最小的是W處理組，其與對(duì)照組小麥幼苗的葉綠素含量相近。

3 討? 論

王秀呈等[21]對(duì)水稻內(nèi)生菌Herbaspirillum seropedicae溶磷特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值為1.5，屬于中等溶磷能力的菌株。劉麗輝等[22]研究表明菌株JH50（Herbaspirillum seropedicae）溶磷D/d值為1.87，比參比菌株溶解無(wú)機(jī)磷能力高出24.6%；菌株JH40檸檬酸菌（Citrobacter bitternis）解鉀D/d值達(dá)3.63。本研究從蘋果根際土壤中篩選到一批具有溶磷解鉀功能的根際菌，其中11株溶無(wú)機(jī)磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌，占全部分離菌株的8.4%。

菌株LC-22、LC-1、LC-2、LC-7和LC-22溶磷圈直徑與菌落直徑的比值即可溶性指數(shù)均大于4，其中菌株LC-22可溶性指數(shù)最高，為8.86。同時(shí)篩出6株溶解有機(jī)磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌，其中菌株BT-23、LC-7和LC-2的有機(jī)磷可溶性指數(shù)均大于3，菌株LC-2溶有機(jī)磷能力最強(qiáng)，達(dá)到3.99；且4株同時(shí)對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷都表現(xiàn)出溶解能力，其中LC-2均對(duì)無(wú)機(jī)和有機(jī)磷的溶解能力均較強(qiáng)（5.25和3.99）。菌株YS-28和YC-31具有解鉀功能，其中YC-31的解鉀能力最強(qiáng)，可溶性指數(shù)最高，為5.5。本研究中所篩選的根際促生細(xì)菌的溶磷解鉀能力均遠(yuǎn)高于上述菌株，說(shuō)明這些菌株可使難溶的無(wú)效態(tài)的磷和鉀轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿挠行B(tài)磷和鉀，可為選育微生物肥料菌種儲(chǔ)備庫(kù)與菌肥菌種擴(kuò)充種質(zhì)資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)小麥幼苗株高促生效果最好的單株菌為YC-31（W）、對(duì)鮮質(zhì)量促生效果最好的單株菌為L(zhǎng)C-22（Y）、對(duì)根長(zhǎng)和葉綠素含量促生效果最好的單株菌LC-2（Z），與對(duì)照組相比較，分別增加21.02%、70.01%、71.32%和17.22%；混菌接種對(duì)小麥幼苗的株高促生效果最好的組合為WXY、對(duì)鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)促生效果最好的組合為WXZ，葉綠素含量促生效果最好的組合為XYZ，較對(duì)照組分別增加28.55%、96.15%、70.19%和41.31%。除個(gè)別處理組外（WXYZ），總體上多株菌接種的促生效果更好，此結(jié)果與韓文星等[20]的研究結(jié)果一致。

但通過(guò)比對(duì)各處理組間的促生效果差異發(fā)現(xiàn)，并不是所有混菌接種處理組對(duì)小麥幼苗的促生效果最好，有的單菌接種的促生效果較混菌接種更為明顯，此結(jié)果與鄧振山等[14]的研究相同。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于多株菌混合后產(chǎn)生了某種物質(zhì)，從而抑制了菌株產(chǎn)生的促生長(zhǎng)因子發(fā)生效應(yīng)。結(jié)合以上分析以及各組處理對(duì)小麥幼苗的促生效果，結(jié)果表明小麥幼苗在混菌接種接種劑WZ、YZ、WXZ、WYZ后，對(duì)小麥幼苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)參數(shù)均表現(xiàn)出較好的促進(jìn)效果。近年來(lái)，隨著植物根際促生菌與植物間互作機(jī)理研究的深入，植物根際促生菌的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，其中，有很多研究已經(jīng)報(bào)道了植物根際促生菌對(duì)各種作物具有增產(chǎn)、增效的多重促生效果[23]。目前，一些植物根際促生菌被開發(fā)成生物菌肥或活體制劑，在農(nóng)作物上具有防病害、促生長(zhǎng)以及改善土壤質(zhì)量等作用，具有十分廣闊的研究和產(chǎn)業(yè)化前景。因此，可以將其作為微生物復(fù)合菌肥的材料，但還需在田間對(duì)各菌株的定殖能力、促生能力和復(fù)合菌株中的優(yōu)勢(shì)促生菌進(jìn)一步驗(yàn)證與探究。這還需對(duì)其在大田應(yīng)用中進(jìn)行菌種活性檢測(cè)及實(shí)際的促生效果等做進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而應(yīng)用于實(shí)際大田農(nóng)作物上，并發(fā)揮最大的促生效應(yīng)。

4 結(jié)? 論

本研究從陜北不同產(chǎn)地蘋果根際土壤中分離到131株促生細(xì)菌。其中具有溶磷能力的菌株共11株，占總分離菌株的10.68%；可產(chǎn)鐵載體的有24株，占總分離菌株的18.32%。在26株具有促生作用的菌株中，13株屬于芽孢桿菌屬和10株屬于假單胞菌屬。對(duì)初篩菌株進(jìn)行促生能力的測(cè)定，其中4株菌株同時(shí)具有多種促生作用。采用16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示菌株LC-22、YC-31、LC-19屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），菌株LC-2屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。對(duì)促生菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果顯示：芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的占比最大，這與目前報(bào)道的大部分芽孢桿菌屬（Bacillus）的菌株具有促生特性的結(jié)果一致[22]。通過(guò)小麥盆栽試驗(yàn)對(duì)各促生菌株促生效果的驗(yàn)證結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，單菌接種與混菌接種的各組處理組對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用。

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Abstract The rhizosphere soil of apple tree in northern Shaanxi area was used as a separation material to screen? growth-promoting bacteria. Based on the analysis of 16S rDNA sequences，the phylogenetic relationships of representative strains were determined，the activity of phosphorus and potassium dissolution and siderophore production were tested，and a pot experiment with a single inoculation and multi-microbe mixed inoculation was conducted to determine their growth-promoting effect. The results showed that a total of 131 strains of bacteria were isolated from apple rhizosphere soil in four different counties and districts in northern Shaanxi，and the growth-promoting ability were measured.?Among? them，17 strains had phosphorus-soluble ability，accounting for 10.68% of the total isolates，11 strains could dissolve organic phosphorus and 6 strains could dissolve inorganic phosphorus. 24 strains could produce siderophores，accounting for 18.32%. In addition，strains YS-28 and YC-31 could dissolve potassium. Subsequent 16S rDNA sequence alignments and phylogenetic analyses revealed that these strains could be categorized into 4 genera（Bacillus，Pseudomonas，Leucobacter and Rhodococcus）. 4 highly active strains were screened out，in which LC-22，YC-31，LC-19 belonged to Bacillu，and LC-2 belonged to Pseudomonas. Compared with the control，under mixed treatment of LC-22，YC-31 and LC-19，the fresh mass of wheat seedlings increased by 96.12%; under mixed treatment of LC-22，LC-19 and LC-2，the chlorophyll content in wheat seedlings increased by 41.31%.In conclusion，the growth-promoting bacteria screened out from rhizosphere soil of apple tree have a strong potential to promote rice growth，and can be used as a microbial fertilizer reserve for bacteria. This study laid a solid foundation for the further development of microbial fertilizer.

Key words Apple; Promoting growth rhizosphere bacteria; Promoting effect; Pot experiment