王莉，陸俊宏，林琦峻，谷美霖，屠文展，李盛村

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325027；2.浙江省針灸康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫州市康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027

腦卒中是全球第二大死亡原因，僅次于缺血性心臟病[1-3]。即使沒有原發(fā)性心臟病，缺血性卒中后也可發(fā)生心肌損傷[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腦卒中28 d后，表現(xiàn)出心臟射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction, EF）顯著降低，心肌肥大、纖維化嚴(yán)重，以及心臟炎癥、浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞和氧化應(yīng)激增加[6]。然而，另一研究指出，在腦卒中后短期內(nèi)心臟出現(xiàn)萎縮而非肥大，并且心肌萎縮持續(xù)到14 d與正常組比較仍存在顯著差異[7]。

耐力運(yùn)動(dòng)可引起心肌生理性肥厚，但不損害心臟功能，且研究發(fā)現(xiàn)堅(jiān)持耐力運(yùn)動(dòng)的老年男性比無(wú)耐力運(yùn)動(dòng)習(xí)慣的同齡對(duì)照組有更好的心臟功能[8]。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是指在急性心腦血管事件發(fā)生之前開展的運(yùn)動(dòng)干預(yù)活動(dòng)。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理被證明能夠預(yù)防和緩解腦卒中、心肌梗死的嚴(yán)重程度[9-11]。腦卒中患者長(zhǎng)期臥床導(dǎo)致心肌萎縮[12]，而運(yùn)動(dòng)預(yù)處理產(chǎn)生的生理性心肌肥厚有利于對(duì)抗病理性骨骼肌和心肌萎縮[13-14]。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的相關(guān)機(jī)制研究有助于開發(fā)“模擬運(yùn)動(dòng)保護(hù)效益”的藥物，有利于運(yùn)動(dòng)困難的腦卒中患者的康復(fù)。然而，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理如何預(yù)防腦卒中后心肌損傷的機(jī)制仍不清楚。

Apelin是一種多肽類分子，能夠改善心肌梗死、血管緊張素誘導(dǎo)的心肌肥厚[15]，在肌少癥患者骨骼肌[16]和失重小鼠心肌[17]中表達(dá)降低。相反，運(yùn)動(dòng)能夠增加高血壓大鼠血管和心肌中Aplein和APJ mRNA表達(dá)[18]。類似的，有氧運(yùn)動(dòng)預(yù)處理也可能通過上調(diào)心肌APJ而改善心梗大鼠心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡[19]。然而，Aplein及APJ參與運(yùn)動(dòng)保護(hù)腦卒中后心肌萎縮的作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究擬探討運(yùn)動(dòng)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)控Aplein及其受體APJ在預(yù)防腦卒中所致心肌萎縮和心功能降低中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001]，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。保持恒溫20～22 ℃，每天接受12 h光照。所有小鼠自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 試劑與儀器：雙目體式顯微鏡購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司，用于大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）大腦中動(dòng)脈梗死腦卒中模型。Vevo2100小動(dòng)物超聲儀購(gòu)自加拿大Visualsonics公司。TTC購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司。TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司。APJ一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理干預(yù)和造模及分組：實(shí)驗(yàn)1：假手術(shù)對(duì)照組（Sham組）、腦梗死模型組（MCAO組），每組6只。實(shí)驗(yàn)2：分為4組，每組6只，①假手術(shù)對(duì)照組（Sham組），靜養(yǎng)小鼠，進(jìn)行沒有插入栓子的假手術(shù)操作；②運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（Control組），小鼠執(zhí)行30 d運(yùn)動(dòng)方案并開展假手術(shù)操作；③腦梗死模型組（MCAO組），小鼠靜養(yǎng)，并按大腦中動(dòng)脈栓塞手術(shù)執(zhí)行造模；④運(yùn)動(dòng)腦梗死模型組（Exercise組），小鼠執(zhí)行30 d運(yùn)動(dòng)方案，并按大腦中動(dòng)脈栓塞手術(shù)執(zhí)行造模。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的小鼠按常規(guī)有氧運(yùn)動(dòng)方案執(zhí)行。具體而言，采用游泳運(yùn)動(dòng)進(jìn)行預(yù)處理，將約30 ℃的水灌入塑料水箱中，水深15 cm迫使小鼠自愿游泳時(shí)后肢不能觸碰水箱底部，從而讓運(yùn)動(dòng)有效進(jìn)行。第1周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，從第2周開始游泳時(shí)間從10 min逐漸增加至40 min，保持40 min游泳30 d。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度參考文獻(xiàn)[20]并做修改，安排有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為單次持續(xù)游泳達(dá)40 min[21]。運(yùn)動(dòng)方案結(jié)束1 d后，各組分別開展假手術(shù)和腦梗死造模手術(shù)。大腦中動(dòng)脈閉塞腦梗死手術(shù)，栓子停留40 min，然后再灌注，4 d后取材。

1.2.2 腦梗死后神經(jīng)行為學(xué)測(cè)定：小鼠造模3 d后，清醒狀態(tài)下，對(duì)其進(jìn)行Zea Longa 5分制評(píng)分。評(píng)分越高，小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，按2～3分為模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 小鼠心臟功能評(píng)價(jià)：模型組造模3 d后，將其用異氟烷麻醉并脫毛，超聲探頭獲取心尖四腔位，M模式下獲取心臟超聲影像，并計(jì)算心臟EF，短軸縮短率（fractional shortening, FS）和左心室舒張?jiān)缤砥诹魉俜逯当龋‥/A ratio, E/A比值）。

1.2.4 腦梗死面積評(píng)估：取小鼠腦組織后，將其放入-20 ℃冷凍20 min后切片2 mm厚度，放入預(yù)先加入TTC染液的6孔板中，37 ℃避光孵育20 min，每5 min翻動(dòng)一下。正常腦組織呈鮮紅色，腦梗死部位呈白色。染色完畢加入4%多聚甲醛固定4～6 h。吸干腦組織表面液體后置于黑色背景板上，攝取圖片，并對(duì)白色區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 心重脛骨長(zhǎng)度比（HW/TL比值）和心肌細(xì)胞橫截面積評(píng)估：取出心臟后擠壓心腔內(nèi)血液并稱重，用尺子測(cè)量小鼠左腿脛骨長(zhǎng)度，以心臟重量比脛骨長(zhǎng)度獲得HW/TL比值。組織用4%多聚甲醛固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，用WGA熒光染料染色1 h，含DAPI的防熒光猝滅封片劑封片。在奧林巴斯熒光顯微鏡下，攝取圖片，用ImageJ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 心臟組織mRNA表達(dá)檢測(cè)：用TRIzol等提取和分離總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，評(píng)定RNA純度，利用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后對(duì)樣本cDNA進(jìn)行PCR定量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)心臟組織蛋白表達(dá)：用適量裂解液、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑等裂解組織，剪刀剪碎組織后勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度，配好蛋白體系后，利用SDSPAGE凝膠電泳法使蛋白分離，再用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，APJ（1:1 000，Proteintech,20341-1-AP）和GAPDH（1:5 000，Proteintech,10494-1-AP）一抗過夜，二抗孵育等步驟后，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（Biorad）中利用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液使蛋白顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死導(dǎo)致神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分增加及心臟功能障礙 TTC染色結(jié)果顯示，腦梗死手術(shù)后，腦梗死引起大腦組織缺血，腦梗死面積顯著高于假手術(shù)對(duì)照組。在腦梗死小鼠模型成功且神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分達(dá)到2～3分時(shí)，進(jìn)行心臟超聲測(cè)定評(píng)估心臟功能，結(jié)果顯示，與Sham組相比，MCAO組小鼠腦梗死4 d后心臟收縮功能相關(guān)指標(biāo)EF、FS及舒張功能指標(biāo)E/A比值均明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 腦梗死手術(shù)對(duì)小鼠腦梗死面積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及心臟功能影響

2.2 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理改善腦梗死小鼠心肌萎縮 與Sham組相比，MCAO組小鼠HW/TL比值顯著降低（P＜0.05），心肌細(xì)胞橫截面積也明顯減少（P＜0.05）。此外，與Sham組比，兩個(gè)萎縮的基因標(biāo)志物Atrogin-1及MuRF-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在MCAO組中表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而運(yùn)動(dòng)預(yù)處理干預(yù)可顯著降低上述心肌萎縮指標(biāo)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

A：HW/TL比值；B：WGA染色后統(tǒng)計(jì)平均心肌細(xì)胞橫截面積；C：Atrogin-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；D：MuRF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。與Sham組比：aP＜0.05；與MCAO組比：bP ＜0.05。n=6

2.3 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理改善腦梗死小鼠心臟功能 腦梗死可引起心臟收縮和舒張功能障礙。與Sham組比，MCAO組EF、FS以及E/A比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與MCAO組比，Exercise組EF、FS和E/A比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)腦梗死小鼠心臟功能的影響

2.4 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理上調(diào)腦梗死小鼠心肌中Apelin/APJ表達(dá) 與Sham組比較，MCAO組小鼠心臟中APJ蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。與MCAO組比，Exercise組APJ蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）。同樣的，MCAO組心肌中Apelin、APJ mRNA表達(dá)與Sham組比降低（P＜0.05），而運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可以提高其表達(dá)（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 運(yùn)動(dòng)對(duì)腦梗死小鼠心肌中Apelin/APJ表達(dá)的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)性腦卒中小鼠出現(xiàn)心臟功能降低和異常心肌重構(gòu)，其中最顯著的變化為急性心肌萎縮。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理能夠促進(jìn)心肌生長(zhǎng)，形成生理性心肌肥厚，可以對(duì)抗病理性心肌重構(gòu)[22]。本研究采用運(yùn)動(dòng)預(yù)處理干預(yù)方式對(duì)抗腦卒中后心肌萎縮和心功能降低，并初步研究相關(guān)分子機(jī)制，為腦卒中患者精準(zhǔn)靶向治療提供理論依據(jù)。

腦卒中28 d后，小鼠表現(xiàn)出心臟EF顯著降低、心肌肥大、纖維化嚴(yán)重、心臟炎癥、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激增加[23]。然而，本研究結(jié)果表明MCAO 40 min再灌注模型建立4 d后小鼠表現(xiàn)出心肌萎縮和心功能降低。與本研究結(jié)果一致，VELTKAMP等[7]指出，與假手術(shù)組比較，腦梗后小鼠心臟表現(xiàn)為萎縮而非肥大，并且心肌萎縮持續(xù)到14 d。

臨床上存在急性缺血性卒中患者出現(xiàn)腦心綜合征的現(xiàn)象[24]。針對(duì)腦卒中后心肌損傷的治療，BIEBER等[23]發(fā)現(xiàn)采用美托洛爾處理可以抑制交感神經(jīng)信號(hào)而防止腦卒中后慢性心功能障礙的發(fā)展。此外，還有研究指出miR-126可以減少心肌纖維化而參與心-腦功能調(diào)節(jié)[25]，脾臟摘除術(shù)減少系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)也能夠改善腦卒中后心肌損傷[26]。然而，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理形成心臟保護(hù)效益是加強(qiáng)生理性保護(hù)的途徑，可以減少藥物不良反應(yīng)，但目前對(duì)運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的研究仍不充分。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理除了預(yù)防腦卒中心肌病的發(fā)生外，其機(jī)制研究可能為腦卒中的整體后期康復(fù)和“模擬運(yùn)動(dòng)效益”的靶向藥物開發(fā)提供重要價(jià)值，特別適用于腦卒中、腦出血等運(yùn)動(dòng)困難患者的康復(fù)。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是無(wú)創(chuàng)的非藥理學(xué)康復(fù)手段，可以抵御心肌梗死、膿毒癥心肌病的發(fā)生和發(fā)展[27-28]，也可以減緩缺血性腦卒中的癥狀[29]。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理確實(shí)很好地阻止了腦卒中心肌萎縮和心肌功能降低，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌肥大或生理性心肌生長(zhǎng)是對(duì)抗腦卒中后病理性心肌萎縮的重要手段。

在機(jī)制上，本研究結(jié)果還表明運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可能通過上調(diào)Apelin及其受體APJ而發(fā)揮對(duì)抗腦卒中心肌病的作用。Apelin和APJ存在于多種組織中，在心臟、肺和腫瘤中具有特殊地位，其中調(diào)節(jié)肽Apelin是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體[30]。心衰大鼠心臟中表現(xiàn)出Apelin/APJ表達(dá)減少[31]。在微重力環(huán)境下，小鼠心肌中Apelin/APJ表達(dá)也下降[17]。這些結(jié)果表明，減少心臟中的力學(xué)刺激可以引起Apelin/APJ表達(dá)減少。相反，我們的結(jié)果證實(shí)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是可以增加Apelin/APJ表達(dá)，而阻止腦卒中后心肌萎縮的發(fā)生。重要的是，模擬運(yùn)動(dòng)效益同樣可以發(fā)揮保護(hù)心臟的作用，例如LI等[31]研究表明外源性補(bǔ)充Apelin-13可以增加Apelin/APJ表達(dá)，改善糖尿病心肌病大鼠的心臟功能障礙和重塑。

本研究的不足之處為未能進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是否依賴心肌細(xì)胞APJ而發(fā)揮阻止腦卒中后心肌萎縮的作用。在未來(lái)仍需要采用心肌細(xì)胞特異性敲除APJ而開展對(duì)應(yīng)研究。

綜上所述，在腦卒中小鼠中，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可能通過上調(diào)Aplein/APJ表達(dá)，減少其心肌萎縮而改善心臟功能。Aplein和APJ可能是運(yùn)動(dòng)防治腦卒中心肌病重要的分子靶點(diǎn)。