程博，屠文展，樓新法，楊觀虎，蔣松鶴，3，吳巧云，3

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)中美針灸康復(fù)研究所 整合優(yōu)化醫(yī)學(xué)研究中心，浙江 溫州 325035；3.溫州市康復(fù)重點實驗室 浙江省針灸康復(fù)重點實驗室，浙江 溫州 325027

神經(jīng)病理性疼痛現(xiàn)今還難以完全治愈[1]。目前對神經(jīng)性疼痛的治療包括藥物療法、神經(jīng)調(diào)節(jié)療法及手術(shù)治療等[2]。盡管有多種治療選擇，由于其病因的復(fù)雜性，目前治療效果并不十分滿意。電針因其不良反應(yīng)小，在神經(jīng)病理性疼痛治療方面得到廣泛應(yīng)用[3]，但其作用機制還有待進一步研究。線粒體自噬在保護受損細胞方面起著重要的作用[4]。線粒體自噬的誘導(dǎo)可緩解周圍神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛[5]。同時有研究表明，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1, Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-related factor 2, Nrf2）信號通路的激活可促進線粒體自噬并緩解神經(jīng)病理性疼痛[6-7]，但電針是否通過調(diào)控線粒體自噬改善神經(jīng)病理性疼痛尚不明確。本研究通過檢測電針對L5脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation, SNL）大鼠疼痛閾值、脊髓背角線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及自噬相關(guān)蛋白表達量的影響，研究電針治療神經(jīng)性疼痛疾病的部分機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［SYXK（浙）2020-0014］。大鼠飼養(yǎng)于22～24 ℃、50%～70%相對濕度、晝夜交替規(guī)律變化的房間中，自由飲水及飲食。39只大鼠通過抽簽隨機平均分為3組：假模組、模型組及電針組。

1.2 SNL模型制作 對模型組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，后背部去毛備皮，以L5棘突為中心縱向切開皮膚及肌肉組織約1 cm，暴露右側(cè)L5橫突。將L5橫突去除后對右側(cè)L5脊神經(jīng)進行結(jié)扎。對造模大鼠進行單籠飼養(yǎng)，正常飲水及飲食。對假模組大鼠進行相同操作但不進行神經(jīng)結(jié)扎。

1.3 干預(yù)方法 將大鼠固定于本實驗室設(shè)計的專用大鼠固定器（專利申請?zhí)枺?01110021482.5，國家知識產(chǎn)權(quán)局）上，采用韓氏電針儀對大鼠右側(cè)“足三里”及“昆侖”穴進行電刺激，針刺深度為2～3 mm，頻率2/100 Hz，強度1.5 mA，時間30 min，從術(shù)后第8天開始每天治療1次，連續(xù)治療7 d。

1.4 檢測方法

1.4.1 熱閾檢測：于造模前（0）及造模后第3、5、7、10、12、14 天（同一時間段：14:00—17:00）對大鼠進行熱閾檢測。檢測儀器為37370型爪熱覺測試儀（意大利UGO公司）。大鼠于儀器內(nèi)安靜狀態(tài)下適應(yīng)30 min，紅外光對準(zhǔn)右側(cè)足底中心，足部因熱感出現(xiàn)疼痛反應(yīng)時引起足部上抬，儀器熱源自動切斷，記錄此時熱閾值。檢測方法每隔5 min進行1次，連續(xù)進行5次，結(jié)果為去掉最大和最小值后的平均值。

1.4.2 機械痛閾檢測：于造模前（0）及造模后第3、5、7、10、12、14天（同一時間段：14:00—17:00）對大鼠進行痛閾檢測。檢測儀器為2450型爪痛覺測試儀（美國IITC LifeScience公司）。大鼠于儀器內(nèi)安靜狀態(tài)下適應(yīng)30 min，探針頭部對準(zhǔn)大鼠患側(cè)足底中心并緩慢加壓，當(dāng)大鼠足部出現(xiàn)逃避性反應(yīng)偏離探針頭部時，記錄此時痛閾數(shù)值。檢測方法每隔5 min進行1次，連續(xù)進行5次，結(jié)果為去掉最大和最小值后的平均值。

1.4.3 HE染色：電針治療后第7天對各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）使其深度麻醉。用0.9%氯化鈉溶液經(jīng)主動脈對大鼠進行灌注，直至大鼠肝肺變白，后轉(zhuǎn)為4%多聚甲醛對大鼠進行灌注使其身體僵硬。取大鼠L4-6脊髓節(jié)段于4%多聚甲醛中固定24 h。取出組織置于不同濃度乙醇中進行梯度脫水，之后將組織用石蠟進行包埋，冠狀切面切下系列切片。每連續(xù)4張切片取一張行HE染色。切片先用蘇木素對其進行染色，之后經(jīng)伊紅染液染色，之后配置不同濃度的乙醇進行梯度脫水，從二甲苯中取出后進行封片處理，最后在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.4.4 透射電鏡觀察：術(shù)后第14天腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行深度麻醉，取L4-6脊髓節(jié)段（約1 cm），沿脊髓背角縱向?qū)?biāo)本切成1 mm×1 mm×2 mm的長條若干，迅速放入戊二醛內(nèi)保存于4 ℃冰箱進行固定。經(jīng)PBS漂洗后于1%鋨酸內(nèi)震蕩處理5 min，后將組織浸于1%醋酸鈾內(nèi)震蕩5 min，梯度脫水后將組織進行包埋。經(jīng)半薄切片觀察組織的固定效果后進行超薄切片，線粒體結(jié)構(gòu)通過透射電鏡進行觀察，并拍攝采集圖片。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測：術(shù)后第14天腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）對大鼠進行深度麻醉，取L4-6脊髓節(jié)段（約1 cm），將脊髓置于蛋白裂解液中進行勻漿，充分裂解后取上清進行BCA蛋白濃度檢測。對蛋白進行電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，之后將條帶放入一抗中4 ℃孵育16 h：兔源性Keap1一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性Nrf2 一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性BCL2和腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3類似體（NIX）一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性BCL2和腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）一抗（1:1 000；美國Affinity公司）；兔源性GAPDH一抗（1:5 000；美國Bioworld公司）。之后將條帶轉(zhuǎn)入山羊抗兔IgG二抗（1:5 000；上海碧云天生物技術(shù)有限公司）中1 h。化學(xué)發(fā)光儀曝光后，AlphaEaseFC 4.0軟件分析獲取條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以±s表示，疼痛閾值檢測采用雙因素方差分析，Bonferroni's進行事后檢驗。其余多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者予Tukey進行組間兩兩比較，方差不齊者予Dunnett'sT3進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

2.1.1 大鼠患側(cè)熱縮足反射潛伏期：與假模組相比，模型組大鼠在造模后患側(cè)后肢的熱閾明顯降低（P＜0.01），并在后期保持在較低水平；電針治療組大鼠患側(cè)后肢熱閾逐漸升高，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 熱縮足反射潛伏期結(jié)果

2.1.2 大鼠患側(cè)機械縮足反應(yīng)閾值：與假模組相比，模型組大鼠在造模后患側(cè)后肢的機械痛閾明顯降低（P＜0.01），并在后期保持在較低水平；電針治療組大鼠患側(cè)后肢機械痛閾逐漸升高，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 機械縮足反應(yīng)閾值

2.2 HE染色 假模組大鼠脊髓背角神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，組織致密。模型組大鼠脊髓背角神經(jīng)元核固縮明顯，細胞變性，組織疏松。電針治療后，大鼠脊髓背角神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，核固縮減少。見圖3。

圖3 HE染色結(jié)果

2.3 透射電鏡觀察 假模組可見正常形態(tài)的線粒體，細胞內(nèi)未見自噬體及溶酶體；模型組脊髓背角線粒體數(shù)目增多，腫脹變形，可見自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，細胞出現(xiàn)壞死及凋亡；與模型組相比，電針治療組大鼠脊髓背角細胞結(jié)構(gòu)較完整，腫脹減輕，細胞內(nèi)可見明顯的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，細胞壞死及凋亡現(xiàn)象減少。見圖4。

圖4 透射電鏡結(jié)果

2.4 Western blot檢測 與假模組相比，模型組大鼠Keap1、Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；電針治療后Keap1蛋白表達降低，Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠Keap1、Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達結(jié)果

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛以痛覺超敏、痛覺過敏及自發(fā)性疼痛等為特征，臨床上治療效果有限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。線粒體自噬是一種選擇性自噬，能夠在一定程度上清除受損的線粒體，在細胞形態(tài)及功能維持方面起著重要作用[8]。同時有研究表明，線粒體自噬與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)[7]。目前研究線粒體自噬的方法主要為透射電鏡下觀察線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況及細胞自噬溶酶體的形成情況。同時NIX、BNIP3都是線粒體膜蛋白，NIX及BNIP3 的表達量變化可以反映線粒體自噬的情況[9-11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNL造模后，大鼠隨即出現(xiàn)患側(cè)疼痛癥狀，脊髓背角線粒體數(shù)目增多，周圍出現(xiàn)自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，細胞破壞嚴(yán)重，伴隨著NIX、BNIP3蛋白表達量的升高。以上結(jié)果表明線粒體自噬在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

Nrf2 是堿性亮氨酸拉鏈家族轉(zhuǎn)錄因子的一份子，正常情況下，胞漿中的Nrf2與Keap1結(jié)合，受Keap1泛素化修飾，進而被蛋白酶體系統(tǒng)降解[12]。在細胞受刺激時，ROS可對Keap的半胱氨酸殘基進行修飾，從而使Nrf2進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子組成異二聚體，從而與抗氧化還原反應(yīng)元件結(jié)合，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄[13]。Keap1的自噬降解可激活抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2并保護細胞免受ROS的侵害[14]。同時有研究表明Keap1/Nrf2與疼痛密切相關(guān)。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型中，Keap1 過表達伴隨著Nrf2 水平上升以及疼痛閾值的降低，Keap1基因沉默減輕了CCI大鼠的神經(jīng)性疼痛。LAN等[16]研究表明Nrf2 基因敲除阻斷了Keap1/Nrf2/HO-1信號傳導(dǎo)，并部分減弱了右美托咪定的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。本研究通過Western blot觀察到SNL大鼠損傷14 d后，脊髓背角Keap1、Nrf2表達升高，表明Keap1、Nrf2可能參與了周圍神經(jīng)損傷引起的疼痛反應(yīng)。

電針已在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療各種慢性疼痛性疾病。針灸（包括普通針刺、電針等）具有多途徑傳導(dǎo)的反饋調(diào)節(jié)作用（多元針灸反饋規(guī)律）[17]。不同穴位不同強度電針刺激所產(chǎn)生的效果可能不同。本研究選取的“足三里”和“昆侖”穴為治療下肢疼痛的常用有效穴[18-19]?！白闳铩焙汀袄觥毖ǚ謩e屬于足陽明胃經(jīng)及太陽膀胱經(jīng)，有強筋骨、調(diào)氣血、舒筋活絡(luò)、鎮(zhèn)痛等功效。同時作為坐骨神經(jīng)分支的腓深神經(jīng)及腓腸神經(jīng)分別從“足三里”和“昆侖”穴深層經(jīng)過，電針可對其產(chǎn)生刺激，同時作用于鄰近血管，將刺激信號上傳到脊髓直至大腦，調(diào)節(jié)機體的疼痛反應(yīng)[20]。有研究表明，電針可通過調(diào)節(jié)miR-206-3p/BDNF通路發(fā)揮抗炎和抗凋亡作用，從而緩解神經(jīng)性疼痛[21]。ZHAO等[22]研究表明電針治療可通過抑制脊髓膠質(zhì)細胞和TLR4/NF-κB通路減輕紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)性疼痛。然而，脊髓背角線粒體自噬變化與電針鎮(zhèn)痛效果的關(guān)系尚未得到充分的驗證。本研究結(jié)果表明，電針提高了SNL大鼠的疼痛閾值，脊髓背角神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯改善，線粒體腫脹減輕，周圍可見自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，無明顯壞死或凋亡現(xiàn)象。同時電針治療抑制了SNL大鼠Keap1的蛋白表達量，促進了Nrf2、NIX、BNIP3蛋白表達量。這些結(jié)果提示電針的鎮(zhèn)痛作用可能部分是通過Keap1/Nrf2信號通路促進線粒體自噬達到的。

綜上所述，電針的鎮(zhèn)痛作用可能與Keap1/Nrf2信號通路參與的線粒體自噬有關(guān)。但其具體機制有待于后續(xù)應(yīng)用Keap1/Nrf2抑制劑或基因敲除技術(shù)進行進一步研究。