王曉歐，王錦院，舒曠怡，游暢，胡榕，王錦樂，林素珍，李姍姍，江明華

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 臨床檢驗中心，浙江 溫州 325027

纖維蛋白原（fibrinogen, Fg）在止血中起核心作用，它是血小板聚集的支持物，纖維蛋白轉(zhuǎn)化的底物，纖維蛋白溶解和傷口愈合的支架[1]。遺傳性異常纖維蛋白原血癥（congenital dysfibrinogenemia, CD）是編碼Fg的基因（FGA、FGB和FGG）缺陷引起的一種臨床上可表現(xiàn)為自發(fā)性出血或血栓形成的罕見遺傳性血液病[2-3]，部分患者有肺動脈高壓等癥狀。有研究[3]顯示，CD患者中42%的人有出血現(xiàn)象，在外傷或合并其他相關(guān)凝血系統(tǒng)異常的患者中，出血情況尤為嚴(yán)重。因大多數(shù)無癥狀的CD患者被漏診或未被報道，該病在人群中發(fā)病率尚無具體統(tǒng)計資料[4]。大約一半的CD病例中，偶然發(fā)現(xiàn)是最常見的診斷方式[5-7]。筆者對1個CD家系進行了臨床特征和遺傳學(xué)分析，現(xiàn)報告如下。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，20歲，因“機器碾壓傷致右手2-4掌骨多發(fā)粉碎性開放性骨折伴活動受限3 h”入院進行手術(shù)治療，術(shù)前凝血檢查發(fā)現(xiàn)凝血酶時間（thrombin time, TT）（22.0 s）延長，F(xiàn)g（0.91 g/L）活性下降?；颊呒韧鶡o自發(fā)出血史或血栓傾向史，無肝腎病史及臨床藥物過敏史。家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)先證者母親月經(jīng)量多、時間長，輕傷后出血難止，其父親和弟弟表現(xiàn)無殊，父母非近親結(jié)婚，系譜圖見圖1。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批（批準(zhǔn)號LW2018-11），所有家系成員均簽署知情同意書。

圖1 CD家系圖

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)出凝血指標(biāo)和生化功能檢測：用枸櫞酸鈉抗凝管采集先證者及家系成員外周血各2.7 mL，供凝血指標(biāo)及基因檢測用；生化促凝管采集各2 mL，用于血清肝功能及腎功能檢測。法國Stago STA-R全自動血凝儀檢測Fg活性（Clauss法）、TT、部分活化凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time, APTT）、血漿凝血酶原時間（prothrombin time, PT）、纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物[fibrin（ogen） degradation products, FDPs]、D二聚體（D-dimer, D-D），采用配套試劑盒進行檢測；德國Siemens ADVIA2400型生化分析儀檢測Fg抗原（試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司）和肝、腎功能。

1.2.2 Fg基因檢測：用基因組DNA提取試劑盒（購自美國Axygen公司）對4個家系成員外周血進行基因組DNA的提?。灰镉缮虾Ｉど锕こ逃邢薰緟⒄瘴墨I[8]進行設(shè)計合成，涵蓋Fg 3個編碼基因（FGA、FGB、FGG）所有外顯子及側(cè)翼序列，引物序列見表1。用DNA擴增試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司）將待檢標(biāo)本在ECT-811 PCR擴增儀（購自廣州合眾生物科技股份有限公司）進行擴增。PCR產(chǎn)物送杭州擎科生物技術(shù)有限公司進行純化、測序，將測序結(jié)果通過Mutation Surveyor軟件與參考序列進行比對，發(fā)現(xiàn)基因變異位點后再次進行正、反向測序確認(rèn)并家系驗證。

表1 FGA、FGB和FGG三個基因的引物序列

1.2.3 生物信息學(xué)軟件分析：用PolyPhen-2、Mutation Taster和PROVEAN 3個變異位點有害性預(yù)測軟件評估變異位點對Fg功能的影響程度，當(dāng)3種軟件均預(yù)測同一遺傳變異對Fg的功能影響較大時，認(rèn)定該遺傳變異具有高危害性。用PyMol軟件建模分析變異前后Fg的分子三維結(jié)構(gòu)，推測此變異對Fg功能的影響；用同源性分析軟件Clustal X對Fg γ鏈氨基酸序列進行保守性比對；用I-Mutant Suite軟件分析單點變異對Fg穩(wěn)定性的影響。

1.2.4 血栓彈力圖評估Fg功能：按照血栓彈力圖凝血分析儀（美國血液技術(shù)公司, Hemostasis Analyzer TEG 5000）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，模擬人體內(nèi)凝血過程，檢測家系成員相關(guān)參數(shù)，監(jiān)測凝血和纖維蛋白溶解整個過程中血凝塊的動態(tài)變化，反映全血的凝血和纖溶能力，其中凝塊形成時間（K）和凝固角（Angle）主要反映Fg的功能和水平，綜合凝血指數(shù)（CI）反映機體處于低凝或高凝狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 臨床表型檢測 在先證者Fg:C 顯著降低（0.91 g/L）而Fg:Ag正常（3.20 g/L），F(xiàn)g:C/Fg:Ag＜0.7，TT（22.0 s）延長且不能被硫酸魚精蛋白校正；PT、APTT、FDPs、D-D均在正常范圍內(nèi)，肝腎功能無異常，排除了抗凝系統(tǒng)和繼發(fā)因素的影響。其母、弟弟與先證者檢測結(jié)果相似，其父各項指標(biāo)均未見異常，見表2。

表2 家系各成員表型檢測結(jié)果

2.2 Fg基因變異分析結(jié)果 先證者編碼Fg γ鏈的FGG基因第9外顯子c.1133G＞A雜合變異，導(dǎo)致γ鏈p.Gly378Asp，見圖2A；其母和弟弟攜帶相同變異，父親則為野生型，見圖2B，通過ExAC、千人基因組、gnomAD數(shù)據(jù)庫檢索，未發(fā)現(xiàn)正常人群攜帶該變異，排除此變異為多態(tài)性的可能。

圖2 FGG 基因第9號外顯子部分測序圖

2.3 生信軟件預(yù)測結(jié)果 3款預(yù)測軟件均提示FGGc.1133G＞A可能為有害致病的變異，PolyPhen-2評分結(jié)果為1.0分（可能有害的）；Mutation Taster預(yù)測結(jié)果提示c.1133G＞A變異致病，不僅使氨基酸序列發(fā)生變化，還有可能改變剪切位點；PROVEAN預(yù)測結(jié)果為-11.03分（有害的）。

2.4 變異蛋白模型分析FGG基因c.1133G＞A變異，導(dǎo)致p.Gly378Asp，用PyMol軟件建模分析發(fā)現(xiàn)，Gly378位于γ鏈D結(jié)構(gòu)域，Gly378的主鏈與Ser404形成一個氫鍵；當(dāng)Gly378變異為Asp378，側(cè)鏈變長，且與Ser404的側(cè)鏈增加了一個氫鍵，同時與Thr379增加了兩個氫鍵，見圖3。

圖3 p.γ Gly378Asp變異模型圖

2.5 同源比對保守性分析 用Clustal X軟件對Fg γ鏈氨基酸序列進行同源保守性比對發(fā)現(xiàn)，γ鏈第378位氨基酸在不同物種間（人、小鼠、牛、蛙和七鰓鰻）為高度保守性序列，均為甘氨酸，見圖4。

圖4 Fg γ鏈同源序列比對

2.6 變異蛋白質(zhì)穩(wěn)定性預(yù)測 用I-Mutant Suite軟件分析單點變異對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，其DDG值為-0.99 kcal/mol，提示蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降（DDG值＞0.5：增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；DDG值＜-0.5：降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；-0.5≤DDG值≤0.5：中性），見圖5A，其提供的PhD-SNP預(yù)測結(jié)果為致病性變異，見圖5B。

圖5 p.Gly378Asp穩(wěn)定性預(yù)測圖

2.7 血栓彈力圖功能試驗結(jié)果 先證者、其母親和弟弟K值均延長，Angle值變小，提示三位c.1133G＞A變異攜帶者Fg功能降低；先證者與其母親CI值變小，提示血液可能處于低凝狀態(tài)，先證者弟弟CI值接近正常水平，提示無凝血功能障礙表現(xiàn)；先證者父親K值、Angle值和CI值均在正常范圍內(nèi)。見表3。

表3 家系各成員血栓彈力圖檢測結(jié)果

3 討論

Fg是人體內(nèi)含量最高的凝血因子，每個Fg分子由一個中央E區(qū)和兩個外圍D區(qū)組成，D區(qū)由Bβ鏈和γ鏈的羧基端構(gòu)成[9]。γ鏈的D區(qū)羧基端有多個功能位點：如D-D的結(jié)合位點、形成E-D連接的“a”聚合位點和血小板結(jié)合位點等[10]，所以當(dāng)該羧基端的氨基酸發(fā)生改變時，可能影響到這些功能位點而導(dǎo)致Fg功能異常。

本文報道的1例CD家系先證者行右手骨折復(fù)位內(nèi)固定、皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)術(shù)，術(shù)中無大出血，術(shù)后傷口愈合不良；先證者母親月經(jīng)量多、時間長，輕傷后出血難止；先證者弟弟無明顯癥狀，三者的臨床表現(xiàn)具異質(zhì)性，但都符合CD的臨床表現(xiàn)，與文獻[3-4]報道一致。實驗室檢查中，先證者及其母親、弟弟的Fg:C明顯降低而Fg:Ag正常，F(xiàn)g:C/Fg:Ag＜0.7，TT延長且硫酸魚精蛋白無法將其糾正，符合CD的實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)。

基因分析證實先證者及其母親、弟弟均攜帶FGG基因c.1133G＞A變異，先證者的變異遺傳自其母親，父親為野生型。本例突變p.Gly378Asp，由原來等電點為5.97 的中性氨基酸（Gly）變成了等電點為2.77酸性氨基酸（Asp），所帶電荷及疏水性的改變使這個位點所處的高度保守的D區(qū)羧基端結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。為了進一步研究p.Gly378Asp對Fg蛋白結(jié)構(gòu)的影響，本研究進行了蛋白模型分析，發(fā)現(xiàn)Gly378位于Fg γ鏈D結(jié)構(gòu)域，D結(jié)構(gòu)域含多個功能位點，其中γ400-411附近的氨基酸殘基是血小板膜糖蛋白IIb/IIIa的作用位點，當(dāng)Gly378變異為Asp378，導(dǎo)致側(cè)鏈變長，且與Ser404、Thr379增加了三個氫鍵，改變了空間作用力，影響了血小板膜糖蛋白IIb/IIIa與Fg的結(jié)合，阻礙了血小板的聚集，使凝塊形成變慢。本研究還應(yīng)用I-Mutant Suite軟件分析p.Gly378Asp變異對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改變，其DDG值為-0.99 kcal/mol，再次證實蛋白質(zhì)穩(wěn)定性存在下降。

血栓彈力圖的三個參數(shù)K值、Angle值和CI值可以作為CD診斷的參考指標(biāo)，K值和Angle值具有較高的特異性和敏感性，可以評估CD患者的整體止凝血狀態(tài)，甚至預(yù)測出血或血栓形成的風(fēng)險。本研究利用血栓彈力圖試驗發(fā)現(xiàn)，先證者及其母親、弟弟的血凝塊聚合的速率減低，提示三位家系成員Fg功能低下，先證者及其母親CI值降低，提示兩者處于低凝狀態(tài)，可能有出血風(fēng)險，需長期監(jiān)測，避免出血風(fēng)險；先證者弟弟CI值接近正常水平，提示無凝血功能障礙表現(xiàn)，這與其弟弟無癥狀的臨床表型一致。通過血栓彈力圖試驗，驗證了c.1133G＞A導(dǎo)致Fg多功能位點的D結(jié)構(gòu)域改變而使其功能下降的分子發(fā)病機制。

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）制定的臨床變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南，對FGG基因c.1133G＞A變異的致病性進行分析，檢索千人基因組、gnomAD、ExAC數(shù)據(jù)庫未見正常人攜帶該變異（PM2）；變異在家系中共分離（PP1）；經(jīng)HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫查詢，F(xiàn)GG基因c.1133G＞A變異（p.Gly378Asp）未見報道，γ鏈的Gly378在不同物種間同源序列比對具有高度的保守性（PP2），見圖4；3個生信軟件預(yù)測c.1133G＞A變異均為有害的（PP3）；先證者及家系成員的表型符合CD臨床表型（PP4）。支持證據(jù)組合為：PM2+PP1+PP2+PP3+PP4，根據(jù)ACMG指南，判定c.1133G＞A（p.Gly378Asp）變異為可能致病性變異。

此外，在先證者及其父親和弟弟FGB基因第8號外顯子存在c.1433G＞A（p.Arg478Lys）雜合改變，BβArg478Lys是一個常見的多態(tài)性，位于Bβ分子的C-端，在分子水平上具有顯著的表型效應(yīng)。研究表明，它與冠狀動脈疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，也與腦卒中的發(fā)育狀況有關(guān)，攜帶這個多態(tài)性位點將可能增加血栓風(fēng)險事件。

國外一項研究[11]表明，在CD診斷后平均隨訪8.8年中，CD患者有大出血（包括產(chǎn)后出血）的高風(fēng)險，還有血栓事件的高風(fēng)險。與血栓相關(guān)的Fg變異的患者尤其危險，在這種患者中，應(yīng)考慮長期抗凝[12]。在某些特定的臨床環(huán)境下，抗纖溶藥物也是CD治療的一部分[12]。

本研究報道了一例FGG基因新變異（c.1133G＞A）致CD家系，拓寬了FGG基因突變譜；同時還發(fā)現(xiàn)該家系中3位成員存在BβArg478Lys多態(tài)性改變，故應(yīng)長期觀察先證者及其家系成員在不同狀態(tài)下Fg功能的動態(tài)變化，有助于指導(dǎo)CD患者的治療，也有助于為進一步闡明基因型和臨床表現(xiàn)的關(guān)系提供依據(jù)。