周 彬 熊 聰 黃 河 祝 滔

據(jù)統(tǒng)計，結直腸癌的病死率僅次于肺癌、肝細胞癌和胃癌，且其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。約50%的結直腸癌患者確診時疾病已進展至中晚期，目前治療方式以手術切除病變?yōu)橹?，輔以放射治療、化學治療和免疫治療等，但術后患者仍有較高的復發(fā)率及轉移風險[2]。因此，探究結直腸癌相關基因突變并尋找有效的靶向治療方法對于改善患者的預后具有重要意義。miR-885 是miRNA 家族成員，在肝細胞癌、胃癌、腎細胞癌等惡性腫瘤中異常表達，其作用機制因腫瘤類型不同而存在較大差異，在腫瘤進程中起著抑癌或促癌作用[3-5]。目前關于miR-885 在結直腸癌細胞中作用的報道較少，且缺少相關機制的研究。本研究通過比較人正常結腸上皮細胞與結直腸癌細胞中的miR-885 表達水平，并探討沉默miR-885 對結直腸癌SW620 細胞的影響及相關機制，以期為尋找新的結直腸癌生物靶向治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

人正常結腸上皮細胞（NCM460 細胞）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；結直腸癌SW620 細胞購自上海研謹生物科技有限公司；miR-885 沉默質粒[miR-885 小干擾RNA（siRNA）]和陰性對照質粒（miR-NC）均由濟南華維醫(yī)藥科技有限公司合成。實時熒光定量PCR 試劑盒購自美國Sigma 公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所；兔抗人β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、磷酸化β-catenin（p-β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和p-GSK-3β 一抗均購自美國Abcam 公司。MPR-A100 酶標儀購自日本ASONE 株式會社；Transwell 小室購自北京冬璞泰和科技有限責任公司；ChemiDocTMTouch 化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-rad 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

NCM460 細胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基，SW620細胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中補充100 mg/L 鏈霉素、100 U/mL 青霉素和10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃及飽和濕度。細胞融合度＞80%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 NCM460 和SW620 細 胞 中miR-885 表 達 水 平檢測

采用實時熒光定量PCR 法檢測NCM460 和SW620 細胞中miR-885 的表達水平。取對數(shù)生長期的NCM460 和SW620 細胞，采用TRIzol 法提取細胞中的總RNA，測定純度及濃度后，反轉錄成cDNA 并定量，按照試劑盒說明書操作。PCR 反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 11.5 μL，10.0 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1.5 μL，加入ddH2O 補充至25.0 μL。PCR 反應條件：90 ℃預變性5 min；之后95 ℃變性12 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共42 個循環(huán)。以U6 作為內參，采用2-△△Ct法計算miR-885 的相對表達量。實驗重復3 次取均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞轉染

取對數(shù)生長期的SW620 細胞接種至6 孔板（密度為1×105個/孔），待細胞融合度＞70%時，將細胞隨機分為4 組：（1）空白組，只含SW620 細胞且未作處理；（2）miR-NC 組，使用轉染試劑（LipofactamineTM2000）將陰性對照質粒miR-NC 轉染至SW620 細胞；（3）miR-885 siRNA 組，使用轉染試劑將miR-885 沉默質粒miR-885 siRNA 轉染至SW620 細胞；（4）miR-885 siRNA＋氯化鋰（LiCl）組，使用轉染試劑將miR-885 沉默質粒miR-885 siRNA轉染至SW620 細胞，加入Wnt 信號通路的激動劑LiCl 并使其濃度為40 mmol/L。每組設置5 個復孔，培養(yǎng)48 h，然后采用實時熒光定量PCR 法檢測4 組細胞中miR-885 的表達水平，以驗證轉染效果。

1.5 細胞增殖能力檢測

采用CCK-8 法檢測各組細胞的增殖能力。取1.4 小節(jié)中的各組細胞，接種至96 孔板（密度為1×103個/孔），加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h 時，加入CCK-8試劑（每孔20 μL），在保溫箱中繼續(xù)孵育4 h，以未添加細胞的空白孔作為對照，使用酶標儀檢測490 nm 處的吸光度值（A 值），以A 值評估細胞的增殖能力。

1.6 細胞侵襲能力檢測

采用Transwell 法檢測各組細胞的侵襲能力。冰浴融化Matrigel 膠，使用PBS 將其稀釋至質量濃度為1 mg/mL，以每孔50 μL 預先鋪設于Transwell小室濾膜上，調整細胞密度為5.0×105個/mL 后加入Transwell 小室的上室，在下室中加入200 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h，取出杯底濾膜，使用無菌棉簽擦去未穿膜細胞，PBS 沖洗，0.25%戊二醛固定25 min，0.1%結晶紫染色，洗滌后晾干。在濾膜中央及周圍隨機選取5 個不相鄰的視野，計算每個視野內的侵襲細胞數(shù)。實驗重復3次取平均值。

1.7 細胞中β-catenin 和GSK-3β 的蛋白表達水平檢測

采用蛋白質印跡法檢測各組細胞中β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 的蛋白表達水平。取1.4 小節(jié)中的各組細胞，預冷PBS 洗滌，加入蛋白裂解液450 μL（含1%蛋白酶抑制劑），冰浴裂解，離心取上清，備用。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取40 μg 待測樣本上樣，加入緩沖液，混合均勻后沸水浴中加熱5 min 至蛋白充分變性，12% SDS 聚丙烯酰氨凝膠電泳后濕轉至膜，室溫下加入封閉液封閉2 h，加入工作濃度為1∶500的兔抗人β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 一抗，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌，之后加入工作濃度為1 ∶2 000 的山羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，暗室中顯影、定影，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH 條帶灰度值表示蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NCM460 和SW620 細 胞 中miR-885 的 表 達 水平比較

實時熒光定量PCR 法檢測結果顯示，NCM460細胞中miR-885 的相對表達量為0.58±0.07，顯著低于SW620 細胞（1.43±0.19），2 組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 轉染后各組細胞中miR-885 的表達水平比較

轉 染48 h 后，空 白 組、miR-NC 組、miR-885 siRNA 組 和miR-885 siRNA＋LiCl 組 細 胞 中miR-885 的相對表達量分別為1.42±0.19、1.44±0.21、0.30±0.04 和0.75±0.09。與空白組、miR-NC 組比較，miR-885 siRNA 組細胞中miR-885 的相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與miR-885 siRNA 組比較，miR-885 siRNA＋LiCl 組細胞中miR-885 的相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與miR-NC 組細胞中miR-885 的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 轉染后各組細胞的增殖能力比較

CCK-8 法檢測結果顯示，與空白組、miR-NC組 比 較，miR-885 siRNA 組 轉 染24、48、72 h 時A值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與miR-885 siRNA 組比較，miR-885 siRNA＋LiCl 組轉染24、48、72 h 時A 值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；空白組與miR-NC 組在24、48、72 h 時的A 值差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 轉染后各組24、48、72 h 時A 值比較

2.4 轉染后各組細胞的侵襲能力比較

Transwell 法檢測結果顯示，空白組、miR-NC 組、miR-885 siRNA 組和miR-885 siRNA＋LiCl 組的侵襲細胞數(shù)分別為（126.40±19.87）個、（128.20±21.33）個、（32.60±5.48）個和（86.00±14.74）個。與空白組、miR-NC 組比較，miR-885 siRNA 組的侵襲細胞數(shù)均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與miR-885 siRNA 組比較，miR-885 siRNA＋LiCl 組的侵襲細胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；空白組與miR-NC 組的侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 各 組 細 胞 中p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的比較

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與空白組、miRNC 組 比 較，miR-885 siRNA 組 細 胞 中p-β-catenin/β-catenin 均顯著降低，p-GSK-3β/GSK-3β 均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與miR-885 siRNA 組 比 較，miR-885 siRNA＋LiCl 組 細 胞中p-β-catenin/β-catenin 顯 著 升 高，p-GSK-3β/GSK-3β 顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；空 白 組 與miR-NC 組 細 胞 中p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表3、圖1。

圖1 蛋白質印跡法檢測各組細胞中p-β-catenin、β-catenin、p-GSK-3β 和GSK-3β 蛋白的表達水平

表3 各組細胞p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的比較

3 討論

結直腸癌的發(fā)生是由多個因素、多個機制綜合作用而引起的，與抑癌基因、促癌基因及DNA修復機制相關基因發(fā)生突變有關[6-7]。除基因突變外，miRNA 表達改變也參與了結直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程。研究表明，miRNA 可作為預測結直腸癌患者預后的生物標志物[8-9]。miRNA 在進化上高度保守，可通過結合特定的信使RNA（mRNA），在轉錄水平上對基因表達進行負調節(jié)。目前研究表明，miRNA 在多種惡性腫瘤中作為促癌基因或者抑癌基因調控腫瘤進程，并可作為惡性腫瘤的潛在干預靶點[10-11]。

miRNA 可能通過調控細胞增殖、分化、凋亡等直接參與腫瘤進程，也可通過靶向調節(jié)促癌基因或抑癌基因間接調控腫瘤發(fā)生。研究表明，miR-885 在膠質母細胞瘤中異常高表達，其可通過海綿化發(fā)揮競爭性內源性RNA 的作用；抑制miR-885-3p 表達可促進膠質母細胞瘤細胞的增殖和遷移，其可作為預后預測的潛在生物標志物[12]。本研究結果顯示，結直腸癌SW620 細胞中miR-885 的表達水平顯著高于NCM460 細胞；且與空白組、miRNC 組比較，miR-885 siRNA 組轉染24、48、72 h 時A 值均顯著降低，侵襲細胞數(shù)均顯著減少，這提示miR-885 在結直腸癌細胞中異常高表達，沉默其表達可減弱結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力。Su 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-885-5p 表達可通過靶向SOCS5、SOCS6 和SOCS7 基因，抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移及上皮間質轉化（EMT），與本研究結果相符。

Wnt/β-catenin 信號通路在正常成熟細胞中處于關閉狀態(tài)，細胞質中β-catenin 通過與GSK-3β 形成蛋白復合體發(fā)生磷酸化，最終被蛋白酶水解；當Wnt/β-catenin 信號通路被異常激活時，Wnt 蛋白在蓬亂蛋白的作用下導致GSK-3β 失活，使β-catenin不能發(fā)生磷酸化而大量累積在細胞質中并轉移至細胞核，在T 細胞因子/淋巴樣增強因子的作用下激活下游轉錄過程及促癌基因表達，從而促進腫瘤發(fā)生[14-15]。Cho 等[16]的研究表明，5-氟尿嘧啶與Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑聯(lián)合應用可作為改善結直腸癌預后的重要策略，這提示該信號通路可能是結直腸癌的潛在治療靶點。本研究結果顯示，與空白組、miR-NC 組比較，miR-885 siRNA 組細胞中p-β-catenin/β-catenin 降低，p-GSK-3β/GSK-3β 升高，且加入LiCl 可減弱miR-885 siRNA 對結直腸癌細胞增殖、侵襲能力的抑制作用，這提示siRNA 沉默miR-885 的作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關。

綜上所述，siRNA 沉默miR-885 可減弱結直腸癌SW620 細胞的增殖、侵襲能力，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin 信號通路有關。miR-885 對結直腸癌細胞的影響可能通過多種機制發(fā)揮作用，今后仍需進一步探討。