單陽陽 張健鋒 毛振彪

盡管在消化道腫瘤治療方面的研究已取得了較大進(jìn)展，但在全球范圍內(nèi)消化道腫瘤的病死率仍較高，結(jié)直腸癌（CRC）、胃癌、原發(fā)性肝癌的病死率分別為9.2%、8.2%、8.2%[1]。因此，應(yīng)用非侵入性方法檢測(cè)早期腫瘤標(biāo)志物十分重要，而DNA 甲基化是被研究得較多的表觀遺傳修飾，DNA 甲基化水平和模式的改變，可以導(dǎo)致抑癌基因沉默，或原癌基因激活，進(jìn)而增高腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。矮小同源盒基因2（SHOX2）和Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族1A（RASSF1A）基因是多種腫瘤信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑，已被證明可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展；SHOX2 和RASSF1A基因甲基化檢測(cè)的敏感度較高，尤其在疾病早期階段[2]。本文就SHOX2 和RASSF1A基因功能及其作用機(jī)制，以及DNA 甲基化修飾在消化道腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中價(jià)值的研究進(jìn)展作一綜述。

1 SHOX2 和RASSF1A 基因功能及其作用機(jī)制

1.1 SHOX2 基因

SHOX2 是一種促癌基因，其是細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)劑及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的誘導(dǎo)劑，除了促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用外，SHOX2 在骨骼發(fā)育、胚胎發(fā)育和心血管系統(tǒng)分化中也起著重要的促進(jìn)作用[3]。SHOX2 同源基因位于3 號(hào)染色體上，其CpG 島高甲基化頻發(fā)，并在肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）和肝細(xì)胞癌（HCC）等腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)升高[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在早期非小細(xì)胞肺癌患者中，SHOX2 基因啟動(dòng)子甲基化與不良預(yù)后相關(guān)，其通過下游靶基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、EMT 和骨轉(zhuǎn)移，并與耐藥有關(guān)[5]。在乳腺癌細(xì)胞中，SHOX2 是EMT 的新型誘導(dǎo)因子，其表達(dá)水平與乳腺癌患者的生存率密切相關(guān)；SHOX2 可在轉(zhuǎn)錄水平直接激活促轉(zhuǎn)移基因WASF3 的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移潛能顯著增強(qiáng)，并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）招募至WASF3 基因啟動(dòng)子，STAT3與SHOX2 形成功能性免疫復(fù)合物，增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞中WASF3 的轉(zhuǎn)錄活性，這提示SHOX2/STAT3/WASF3 信號(hào)通路可能可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[6]。此外，SHOX2 還能通過上調(diào)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）的表達(dá)以抑制抑癌基因p53 的活性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[7]。

1.2 RASSF1A 基因

RASSF1A是被研究得較為深入的抑癌基因，在機(jī)體正常組織中廣泛表達(dá)，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、參與細(xì)胞凋亡和穩(wěn)定微管，并參與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)；此外，RASSF1A還參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，其編碼的支架蛋白能通過正反饋或負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。RASSF1A位于3p21.3 染色體區(qū)域，對(duì)多種腫瘤的遺傳和表觀遺傳變化敏感，可調(diào)節(jié)多條腫瘤相關(guān)信號(hào)通路并干擾多種細(xì)胞過程。在多種腫瘤（如乳腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、前列腺癌等）中均能檢測(cè)到異常的RASSF1A基因甲基化[9]。RASSF1A還與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及化學(xué)治療藥物耐藥有關(guān)。腫瘤組織中RASSF1A 缺乏的主要原因是RASSF1A等位基因雜合缺失和啟動(dòng)子中CpG 島超甲基化而失活，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）能介導(dǎo)該類CpG 島甲基化，因此腫瘤細(xì)胞中DNMT 活性增強(qiáng)可導(dǎo)致RASSF1A基因高甲基化，進(jìn)而使蛋白質(zhì)表達(dá)降低。研究表明，RASSF1A 的Sarah 結(jié)構(gòu)域可使RASSF1A 與RASSF異構(gòu)體結(jié)合以形成同源二聚體或異源二聚體，并與巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（MST）蛋白的Sarah 結(jié)構(gòu)域相互作用，以激活Hippo 信號(hào)通路，該通路是重要的促凋亡信號(hào)通路[10]。Schmidt 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，RASSF1A 敲除細(xì)胞中IL-6 表達(dá)升高且炎性反應(yīng)增強(qiáng)，IL-6 可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的DNMT1 表達(dá)以促進(jìn)RASSF1A基因高甲基化并抑制RASSF1A轉(zhuǎn)錄。可見，RASSF1A甲基化和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有協(xié)同作用。

2 SHOX2 基因甲基化在消化道腫瘤中的作用

2.1 SHOX2 基因與食管癌

ESCC 是中國(guó)較常見的食管癌病理分型，由于該腫瘤的早期侵襲性、易發(fā)生淋巴結(jié)和器官轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療效果不佳，患者的預(yù)后較差。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，SHOX2 在ESCC 組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是EMT 的調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；當(dāng)miR-375 過表達(dá)時(shí)，SHOX2 表達(dá)降低，ESCC 細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱，這提示SHOX2 是ESCC 的促癌基因，miR-375 可通過抑制SHOX2 的表達(dá)以抑制EMT[12]。因此，miR-375/SHOX2 信號(hào)通路可能是治療ESCC 的新靶點(diǎn)。

2.2 SHOX2 基因與胃癌

臨床研究表明，SHOX2 表達(dá)升高與胃癌患者總生存率較低顯著相關(guān)，是影響胃癌患者預(yù)后的因素；該研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）IGF2-AS 在胃腺癌（GAC）中起著重要的調(diào)控作用，作為miR-503 的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，其可上調(diào)SHOX2的表達(dá)，與GAC 患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。研究顯示，與正常組織相比，GAC 組織中SHOX2 表達(dá)升高，尤其在小鼠感染幽門螺桿菌（Hp）后，SHOX2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，這提示SHOX2 基因甲基化與GAC 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[14]。SHOX2 基因是否可作為GAC 患者的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物，尚待進(jìn)一步研究。

2.3 SHOX2 基因與CRC

循環(huán)游離DNA（cfDNA）中的SHOX2 和胞裂蛋白9（SEPT9）基因甲基化是CRC 篩查、診斷和分期的生物標(biāo)志物。結(jié)腸腺瘤和CRC 組織中SHOX2 基因甲基化水平顯著高于正常組織；SEPT9或SHOX2 基因甲基化檢測(cè)可能有助于區(qū)分CRC 或結(jié)腸腺瘤與正?；蜓仔越Y(jié)腸組織，并可區(qū)分晚期腺瘤與非晚期腺瘤，該結(jié)論還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證[15]。Bergheim 等[16]的研究檢測(cè)了184 例CRC 患者術(shù)前和術(shù)后3～10 d 的ccfDNA 甲基化水平，結(jié)果 顯 示 治 療 前ccfDNA 中SHOX2 和SEPT9 基 因甲基化水平與國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟（UICC）分期、TNM 分期、組織學(xué)分級(jí)，以及淋巴浸潤(rùn)和囊外淋巴結(jié)擴(kuò)散密切相關(guān)，治療后SHOX2 和SEPT9 基因甲基化水平與UICC 分期相關(guān)；ccfDNA 中SHOX2基因甲基化水平與UICC 分期（Ⅰ～Ⅳ）、淋巴結(jié)分期（N0～N2）、組織學(xué)分級(jí)（G1～G3）和淋巴浸潤(rùn)（L0～L1）程度均呈正相關(guān)，這有助于TNM 分期的診斷及個(gè)體化治療方案的制定。此外，SHOX2與CRC 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Yang 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2 能 通 過 調(diào) 節(jié)lncRNA SNHG11/miR-339-3p 信號(hào)通路促使CRC 進(jìn)展；敲低SHOX2 可抑制CRC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；這提示SNHG11/miR-339-3p/SHOX2 信號(hào)通路是CRC 發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控機(jī)制。

3 RASSF1A 基因甲基化在消化道腫瘤中的作用

3.1 RASSF1A 基因與胃癌

多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已為晚期，可選擇的治療方案有限。胃癌的發(fā)病機(jī)制涉及多種遺傳和表觀遺傳改變，胃癌組織中RASSF1A基因甲基化水平較正常胃組織顯著升高[18]。Karamitrousis 等[19]研究了105 例出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胃癌患者和20 名健康對(duì)照者的血液樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中68 例患者存在RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，而健康對(duì)照者無RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化；此外，在46例疾病進(jìn)展患者中，有35 例存在RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，提示RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與治療效果相關(guān)。多種基因的表觀遺傳修飾是胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。Karamitrousis 等[20]的研究評(píng)估了70例 晚 期 胃 癌 患 者ccfDNA 中RASSF1A、SOX17 和WIF-1 的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，抑癌基因RASSF1A甲基化最為常見，其余依次為SOX17 和WIF-1；與無甲基化的患者相比，RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的患者的無進(jìn)展生存期和總生存期均較短。由于該研究的樣本量較小，未來需進(jìn)一步研究以揭示RASSF1A等基因甲基化是否可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

3.2 RASSF1A 基因與CRC

RASSF1A基因高甲基化與CRC 患者的總生存期較短和預(yù)后不良有關(guān)[21]。80%～90%的CRC 是由腺瘤性息肉和結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤（LST）發(fā)展而來，有研究發(fā)現(xiàn)，LST 患者的RASSF1A基因甲基化水平介于腺瘤性息肉與CRC 之間，提示其可能可以早期診斷CRC[22]。此外，CRC 患者的生存率、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤分化均與RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化水平有關(guān)[23]。Hu 等[21]的薈萃分析結(jié)果顯示，RASSF1A基因甲基化與較高的CRC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和較短的總生存期有關(guān)，這提示RASSF1A是預(yù)測(cè)CRC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的生物標(biāo)志物。Blanchard等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中，抑癌基因叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（FOXM1）會(huì)導(dǎo)致抑癌基因RASSF1A表達(dá)升高，這有助于開發(fā)晚期CRC 的藥物聯(lián)合治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，MGMT、RASSF1A與SEPT9 基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測(cè)診斷CRC 的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和ROC 曲線下面積（AUC）分別為96.6%、74.0%、91.5%和0.97，其診斷效能優(yōu)于表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物（NGFR/SEPT9/TMEFF2，SFRP2/RASSF）[25]。今 后尚需評(píng)估體液（尤其是血液）中MGMT、RASSF1A和SEPT9 基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，以開發(fā)可應(yīng)用于臨床的檢測(cè)方法。

3.3 RASSF1A 基因與HCC

RASSF1A基因異常甲基化是診斷HCC 的潛在生物標(biāo)志物，甲胎蛋白（AFP）診斷HCC 的特異度較高，但敏感度僅為47%[26]。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，RASSF1A基因甲基化與AFP 聯(lián)合檢測(cè)可提高HCC 的診斷率。研究發(fā)現(xiàn)，HBV 介導(dǎo)HCC 發(fā)生的表觀遺傳基礎(chǔ)是HBV 編碼的X 蛋白通過上調(diào)DNMT1 誘導(dǎo)RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，抑制RASSF1A表 達(dá)[27]。在 診 斷HBV 相 關(guān)HCC 時(shí)，相較于AFP 檢測(cè)，血清RASSF1A基因甲基化檢測(cè)的敏感度和特異度較高[28]。因此，AFP 與RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)可有效鑒別HCC 與慢性乙型肝炎（CHB），也可預(yù)測(cè)HCC 的進(jìn)展和預(yù)后[23]。Kim 等[29]應(yīng)用AFP 與尿ccfDNA（TP5 基因突變、RASSF1A基因甲基化和GSTP1 基因甲基化）聯(lián)合檢測(cè)方法，在186例HCC 患者中檢出148 例，診斷的敏感度和特異度分別為79.6%和90%；與AFP單獨(dú)檢測(cè)相比，聯(lián)合檢測(cè)檢出的病例數(shù)增加了30%，并且提高了早期HCC 的檢出率。因此，AFP與尿ccfDNA 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)HCC 的診斷效能較好，尤其是對(duì)AFP 未顯著升高的HCC 患者，該檢測(cè)有潛力作為非侵入性HCC 篩查方法。

3.4 RASSF1A 基因與胰腺癌

胰腺癌的病死率較高，美國(guó)胰腺癌患者的5年生存率約為10%[30]。盡管在胰腺癌的診斷和治療方面已取得重大進(jìn)展，但早期診斷仍較為困難，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差。胰腺癌的易感性與基因突變和表觀遺傳修飾相關(guān)[31]。Asano等[32]對(duì)33 例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMN）患者的手術(shù)切除標(biāo)本的46 個(gè)解剖區(qū)域進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因甲基化在潛在惡性區(qū)域較良性區(qū)域多見，這提示RASSF1A基因高甲基化與IPMN進(jìn)展、惡變及較差的預(yù)后有關(guān)。此外，Henriksen 等[33]的研究納入了346例胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）Ⅰ～Ⅳ期患者和25 例慢性胰腺炎患者，該研究對(duì)血清cfDNA 樣本進(jìn)行了包含RASSF1A在內(nèi)的多種基因甲基化的特異性PCR 檢測(cè)，并與血清CA19-9 聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示PDAC 患者血清cfDNA 的高甲基化基因數(shù)量多于慢性胰腺炎患者；此外，該研究中基因甲基化與血清CA19-9 聯(lián)合檢測(cè)診斷PDAC的AUC 為0.93，大于血清CA19-9 單獨(dú)檢測(cè)，提示其有潛力作為診斷PDAC 的生物標(biāo)志物，并有助于鑒別PDAC 和慢性胰腺炎。

4 總結(jié)

SHOX2 和RASSF1A基因在消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥中均起著重要作用，這2 種基因甲基化檢測(cè)分別與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)被認(rèn)為是較好的消化道腫瘤篩查和監(jiān)測(cè)方法，具有較高的敏感度和特異度。在消化道腫瘤患者體內(nèi)，SHOX2表達(dá)升高，而RASSF1A表達(dá)則降低，兩者的甲基化水平均明顯升高[34]。研究表明，當(dāng)SHOX2 和RASSF1A與其他異常甲基化基因聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，其特異度和敏感度顯著升高。需要注意的是，僅應(yīng)用基因甲基化檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床實(shí)踐的可靠性不高，需與常規(guī)檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用。綜上所述，SHOX2和RASSF1A基因有潛力作為早期消化道腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物，也可作為腫瘤治療中表觀遺傳調(diào)控的靶標(biāo)。DNA 甲基化檢測(cè)的敏感度較高且較為客觀，其與液基脫落細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用可以彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)檢查敏感度較低的缺點(diǎn)。DNA 甲基化檢測(cè)也可以作為組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的輔助診斷工具。