王苗利，薛瑞雪，李玉杰，李金明，李云崗*

[1.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心(山東省人畜共患病流調(diào)監(jiān)測中心），山東濟(jì)南 250100；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032]

非洲豬瘟 (African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV）引起的一種高度接觸性傳染病，致死率可高達(dá)100%[1]，嚴(yán)重影響我國生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。該病可通過多種方式傳播，直接接觸、間接接觸及短距離的氣溶膠均可在豬群傳播，同時也可在在家豬-野豬-軟蜱-家豬間循環(huán)傳播[2]。但目前尚無針對ASFV 的商品化疫苗[3]，檢疫、剖殺及合理的生物安全措施是防控該病的主要手段，其中生物安全措施中的消毒環(huán)節(jié)便成為養(yǎng)殖過程中的重中之重。

有效的消毒可直接阻斷病毒的傳播，是防控ASFV 傳播的關(guān)鍵。常見的消毒方法主要包括化學(xué)消毒、物理消毒和生物消毒3 大類，這些消毒方式中化學(xué)消毒的方式使用較多[4]。為做好ASF 防控工作，在現(xiàn)場消毒后，需評估消毒效果，其中最常用的方法為熒光定量PCR 方法，而當(dāng)前建立的ASFV 微滴式數(shù)字PCR 方法更能直觀地顯示消毒劑對病毒核酸降解能力[5]。本研究擬用微滴式數(shù)字PCR 方法檢測醛類、季銨鹽類、過氧化物類等6 類9 種常用消毒劑與ASFV 陽性樣品作用后核酸產(chǎn)物的含量，評估不同消毒劑對ASFV 核酸降解能力，以期科學(xué)評價消毒劑在ASF 防控實踐中的消毒效果并提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

消毒劑：購買市面常見的醛類(戊二醛、戊二醛癸甲溴銨）、季銨鹽類(癸甲溴銨）、過氧化物類(過硫酸氫鉀、過氧乙酸）、酶制劑 (萊芙酶）、含氯類(月芐三甲氯銨、二氯異氰脲酸鈉、次氯酸）、含碘類(聚維酮碘）等6 類消毒劑。所有消毒劑均可用于畜禽舍欄運載工具、器具消毒；皮膚和黏膜消毒。消毒劑產(chǎn)品詳細(xì)信息見表1，所用產(chǎn)品均注冊有獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號，試驗時均在有效期以內(nèi)。

表1 消毒劑產(chǎn)品信息匯總

主要試劑：磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Probe dPCR SuperMix 及微滴數(shù)字PCR 相關(guān)試劑購自北京新羿生物。

主要儀器：儀器TISSUELYSER II 組織研磨儀由Qiagen生產(chǎn)，微滴式數(shù)字PCR 儀由新羿生物公司生產(chǎn)。

組織樣品：ASFV 陽性組織樣品來自于中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。

1.2 方法

1.2.1 消毒劑與病毒液混合液的制備

取ASFV 陽性組織樣品研磨離心后取上清液，加入磷酸緩沖鹽溶液制備10 倍病毒稀釋液備用。參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部文件《關(guān)于在非洲豬瘟防控中做好消毒劑選擇工作的通知》 (農(nóng)牧便函〔2019〕 735 號），以有效滅活A(yù)SFV 為目的，按照消毒劑說明書標(biāo)明濃度范圍合理選擇工作濃度，制成10 倍工作濃度備用。將0.2 mL 10 倍病毒稀釋液和0.2mL 消毒液加入到1.6mL 磷酸緩沖鹽溶液中充分混勻。無法制成10 倍工作濃度液的消毒劑，按照1∶2 工作濃度，即將1mL 消毒劑原液和0.2mL 10 倍病毒稀釋液，加入到0.8mL 磷酸緩沖鹽溶液中充分混勻。陽性對照組，直接將0.2mL 10 倍病毒液加入1.6mL磷酸緩沖鹽溶液中充分混勻；陰性對照組，直接取1mL 磷酸緩沖鹽溶液。

1.2.2 核酸提取液制備

消毒劑與不同濃度ASFV作用產(chǎn)物制備：取ASFV 陽性組織樣品研磨離心后取上清，用磷酸緩沖鹽溶液制成10、100、1000 倍病毒稀釋液，參照1.2.1 方法制備消毒劑與病毒液混合液，室溫條件下(20～25℃）作用30min。

消毒劑與ASFV 不同作用時間作用產(chǎn)物制備：按照1.2.1方法制備得到的消毒劑與病毒液混合液，室溫條件下(20～25℃）分 別作 用5、10、20、30 和40min。

消毒劑與ASFV 不同作用溫度產(chǎn)物制備：按照1.2.1 方法制備得到的消毒劑與病毒液混合 液，分別于4℃、25℃和35℃溫度條件下作用30min。

陰、陽性對照樣品均按照相同條件作用處理。

1.2.3 病毒核酸提取

取200μL 上述作用后產(chǎn)物，按照DNA/RNA 提取試劑盒說明進(jìn)行操作，提取后的核酸保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4 數(shù)字PCR 擴(kuò)增

數(shù)字PCR 反應(yīng)體系：2×SuperMix 10μL，上游引 物(10μmol/L）、下游引 物(10μmol/L）各1.8μL，探 針(10μmol）0.05μL，DNA 模板2μL，用ddH2O 補齊至20μL。普 通PCR 反應(yīng)條 件：95℃10min；94℃30s，60℃1min，40 個循環(huán)；4℃60min，升降溫速率2℃/s。

1.2.5 檢測結(jié)果分析

重復(fù)處理各組樣品3 次并檢測，統(tǒng)計平均檢測值，將各組檢測結(jié)果分別與對應(yīng)陽性對照組比較。

2 結(jié)果

2.1 各消毒劑與不同濃度ASFV 作用結(jié)果

各消毒劑在選定稀釋度下與不同濃度的ASFV 在室溫條件下作用30min 后，采用微滴式數(shù)字PCR 進(jìn)行檢測。處理樣品平行檢測3 次，各組平均陽性微滴數(shù)批間變異系數(shù)為0.42%～5.91%；取同一批次樣品平行提取核酸3 次進(jìn)行檢測，各組平均陽性微滴數(shù)批內(nèi)變異系數(shù)為0.15%～2.19%。

結(jié)果顯示，與陽性對照相比，本研究中不同濃度的AS-FV 與二氯異氰尿酸鈉作用后核酸降解量最大，病毒核酸含量由17489.2 降為10.1，當(dāng)病毒核酸含量為1743.2 時，與該消毒劑作用后檢測不到病毒核酸；10 倍稀釋的病毒液分別與戊二醛和過硫酸氫鉀消毒劑作用后，檢測的病毒核酸含量降低約100 倍，當(dāng)病毒進(jìn)行100 倍稀釋后，這兩組均未檢測到病毒核酸；10 倍稀釋的病毒液分別與過氧乙酸和聚維酮碘作用后，檢測病毒核酸降低約0.4 倍；病毒與其他種類消毒液作用后，病毒核酸降解量相對不明顯(表2）。

表2 組織樣品微滴式數(shù)字PCR 檢測結(jié)果

2.2 各消毒劑與ASFV 不同作用時間結(jié)果

各消毒劑在選定稀釋度下與原始病料樣品1.7×104copies的ASFV 分別作用5、10、20、30 和40min 后，采用微滴式數(shù)字PCR 進(jìn)行檢測。處理樣品平行檢測3 次，各組平均陽性微滴數(shù)批間變異系數(shù)為0.36%～5.42%；取同一批次樣品平行提取核酸3 次進(jìn)行檢測，各組平均陽性微滴數(shù)批內(nèi)變異系數(shù)為0.17%～2.26%。結(jié)果顯示戊二醛與ASFV 作用時間不同，對病毒的核酸降解量變化最大。其他種類消毒劑對ASFV 核酸降解量并未隨著時間的延長而有明顯增加(圖1）。

圖1 消毒劑與ASFV 不同作用時間病毒拷貝數(shù)

2.3 各消毒劑與ASFV 作用溫度結(jié)果

各消毒劑在選定稀釋度下與原始病料樣品1.7×104copies的ASFV 分別在4、25 和35℃條件下作用30min 后，采用微滴式數(shù)字PCR 進(jìn)行檢測。處理樣品平行檢測3 次，各組平均陽性微滴數(shù)批間變異系數(shù)為0.32%～5.39%；取同一批次樣品平行提取核酸3 次進(jìn)行檢測，各組平均陽性微滴數(shù)批內(nèi)變異系數(shù)為0.20%～2.47%。結(jié)果顯示過硫酸氫鉀和戊二醛癸甲溴銨與ASFV 作用在溫度較高時，消毒劑對核酸的降解量增加較明顯。其他種類消毒劑對ASFV 核酸降解量并未隨著環(huán)境溫度的變化而有明顯變化 (圖2）。

圖2 消毒劑與ASFV 不同作用溫度病毒拷貝數(shù)

3 討論

ASFV 嚴(yán)重危害豬只健康，且目前尚無商品化疫苗。消毒是控制病毒感染的重要環(huán)節(jié)，ASFV 對戊二醛、含氯、含碘類等多數(shù)常用消毒劑敏感[6]。通常，病毒分離方法最能直觀顯示消毒劑對病毒的殺滅效果，但該方法只能在農(nóng)業(yè)部指定實驗室中開展，且檢測周期長、操作繁瑣，不適用于快速監(jiān)測。而ELISA 和膠體金等檢測方法敏感性較低，達(dá)不到對消毒效果評價要求[7]。數(shù)字PCR 方法可對病原含量進(jìn)行定量，且靈敏度高于熒光定量PCR 方法。

該研究通過微滴式數(shù)字PCR 檢測結(jié)果顯示，含氯類中二氯異氰尿酸鈉、醛類中戊二醛、過氧化物中過硫酸氫鉀3類消毒劑與ASFV 作用后，對數(shù)字PCR 檢測結(jié)果影響最顯著，病毒核酸含量明顯下降。有研究顯示，二氯異氰尿酸鈉與水作用后可產(chǎn)生次氯酸，引起蛋白變性從而改變膜的通透性，同時也能影響DNA 合成等來殺滅病原[8]。但該研究中另一含氯類消毒產(chǎn)品，與ASFV 作用后，對病毒核酸影響很小。因此不同含氯類消毒劑對病毒核酸影響差異的原因，需進(jìn)一步研究分析。戊二醛類消毒劑，能夠凝固蛋白質(zhì)中的氨基和羧基導(dǎo)致病原微生物蛋白變性使其死亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)戊二醛有顯著的核酸降解能力，而戊二醛癸甲溴銨對核酸的降解能力較弱，且季銨鹽類消毒劑癸甲溴銨與ASFV 作用后，核酸含量無明顯變化，推測可能癸甲溴銨不僅不具有核酸降解能力，而且會抑制戊二醛對病毒核酸的降解能力。

4 結(jié)論

綜上所述，二氯異氰尿酸鈉、戊二醛、過硫酸氫鉀這3種消毒劑相對于其他消毒劑對病毒核酸降解量最大；戊二醛與非洲豬瘟病毒作用時間不同，對病毒的核酸降解量變化最大；環(huán)境溫度對過硫酸氫鉀和戊二醛癸甲溴銨的非洲豬瘟病毒核酸降解能力影響最大，溫度較高時，核酸降解能力增強。提示了養(yǎng)殖場如若消除病毒核酸污染，可選擇二氯異氰尿酸鈉、戊二醛、過硫酸氫鉀這3 種消毒劑，且在使用過程中，戊二醛盡可能增加消毒作用時間，過硫酸氫鉀適當(dāng)提高消毒作用溫度，來加強病毒核酸降解能力。