黃小翠，于趙龍，祝子健，廖梓妤，程 銘，李加林，吳素珍，3

（1. 贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；2. 贛南醫(yī)學院藥學院；3. 贛南醫(yī)學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是導致糖尿病患者死亡的主要原因之一［1-2］。糖尿病患者常伴隨嚴重的腎功能損害，其特征性病理改變是細胞外基質堆積、腎小球硬化及腎小管間質纖維化［3］。糖尿病腎病發(fā)病機制尚不完全清楚，它很可能與糖代謝紊亂、血流動力學及血液流變學異常、遺傳、氧化應激、炎癥等因素有關，高血糖、蛋白尿均能促進其進展［4-5］。DN 的主要病理學表現(xiàn)為腎臟體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜細胞增生、肥大及系膜區(qū)細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）如纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）堆積，最終發(fā)展為腎小球硬化和腎臟纖維化［6］。

槲皮素是一種存在于很多中藥中的黃酮醇類化合物，具有廣泛的生物活性，近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抑制腫瘤、抗炎、降血脂等多種藥理作用。文獻報道槲皮素有改善DN 作用，能減輕腎小球肥大癥狀，減少蛋白尿，是有效防治糖尿病腎病的藥物之一［7-10］。本研究應用鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）給藥，復制大鼠糖尿病模型，給予一定劑量的槲皮素治療后，收集大鼠血液與尿液標本，檢測腎臟損傷相關指標，探討槲皮素對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD雄性大鼠，體重（200±20） g，購于贛南醫(yī)學院實驗動物中心，動物許可證號SCXK（贛）2014-0001。槲皮素由本實驗室自制，純度＞95%。三諾安穩(wěn)型血糖儀（長沙三諾生物傳感技術有限公司）；鏈脲佐菌素（Sigma）；蛋白質分子量Markers（Fermentas MBI）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；ECL發(fā)光液（Thermo公司）；β-actin 抗體、Fibronectin 抗體（Santa Cruz 公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔（艾美捷科技有限公司）；其他化學試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 32 只SD 大鼠飼養(yǎng)1周使其熟悉環(huán)境，首先稱量體重和測空腹血糖，再隨機取16只作為對照組，分正常對照組和槲皮素對照組，每組8 只；其余16 只大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）1 次，按55 mg·kg-1劑量正常給藥，48 h 血糖穩(wěn)定后測隨機血糖，若血糖≥16.7mmol·L-1則表明糖尿病模型建立成功。隨后再將成功建立模型的糖尿病大鼠，隨機分成糖尿病組與槲皮素治療組各8 只。成模當日給藥，槲皮素對照組和槲皮素治療組槲皮素給藥劑量均為100 mg·kg-1，之后每天上午單次定時灌胃，同時正常對照組和糖尿病組灌胃等體積的生理鹽水，給藥時間為12 周。所有大鼠在實驗期間均為標準飲食，自由飲水。

1.2.2 血液、尿液收集及相關指標檢測 給藥12周結束后，使用代謝籠收集24 h 尿樣，記錄尿量，檢測24 h 尿總蛋白、尿肌酐與尿糖；取大鼠血樣，檢測各組大鼠血液中血糖、血尿素氮及血肌酐含量。

1.2.3 動物標本收集與制作 動物處死后，迅速取出其腎臟，稱重，置于裝有預冷PBS 的器皿內，修剪掉腎臟周圍的脂肪組織和包膜。沿著腎臟縱向切開，去除髓質，迅速將腎皮質剪碎，取部分腎皮質用甲醛固定，用于形態(tài)學實驗。另取部分腎皮質放入1.5 mL 的EP 管中，加入適量細胞裂解液，用靜音高速勻漿儀勻漿至看不到任何組織團塊，EP管在冰上靜置裂解10 min 后，以12 000 rpm 的轉速，在4 ℃條件下，離心15 min，取上清，用BCA 法測定各組蛋白濃度，按30 μg·（10 μL）-1將各組蛋白配平后加入上樣緩沖溶液，用于后續(xù)的Western Blot實驗。

1.3 大鼠腎皮質形態(tài)學觀察

1.3.1 HE 染色 腎皮質切片依次用二甲苯和不同濃度的酒精脫蠟，用蘇木素對細胞核進行染色，用伊紅染液染色染細胞質，最后脫水用中性樹膠封片，拍照。

1.3.2 馬森染色 采用馬森染色（Masson Stain）表征纖維化。染色流程如下：石蠟包埋腎皮質切片后，常規(guī)脫水；采用重鉻酸鉀處理腎臟組織，Weiger氏鐵蘇木素染色，麗春紅酸性品紅液染色，苯胺藍液復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，拍照。

1.4 FN 表達檢測 Western Blot 和免疫組化方法檢測SD大鼠腎皮質胞外基質FN表達。

1.4.1 Western Blot方法檢測FN的表達 Western Blot實驗檢測腎皮質中蛋白表達水平，再將蛋白質從膠轉移到PVDF 膜（Merck Millipore， R1NB76879）上以后，用5%脫脂奶粉封閉，然后與抗FN（1∶10 000，Merck Millipore，#AB1954）及β-actin（1∶1 000， Cell Signalling Technology， 3700S）的抗體4 ℃孵育過夜。隨后，將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育2 h。最后使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad Chemi-Doc MP）對條帶進行顯影，Image J讀取條帶灰度值。

1.4.2 免疫組化方法檢測FN 的表達 免疫組化采用SP 試劑盒，包括：過氧化物酶阻斷液（試劑A）、非免疫性動物血清（試劑B）、生物素標記的二抗（試劑C）、鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D）；DAB 試劑盒，包括：DAB 緩沖液20×（試劑A）、DAB 底物20×（試劑B）、DAB 色原20×（試劑C）。免疫組化具體操作步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0software進行數(shù)據(jù)分析和作圖。各組數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，組間比較用單因素方差（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，組內各指標的多重比較用SNK 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，所有實驗均為重復3次以上的獨立實驗。

2 結果

2.1 槲皮素對糖尿病腎病大鼠腎臟損傷相關指標的影響 糖尿病組血糖≥16.7 mmol·L-1提示糖尿病腎病模型建立成功。與正常對照組比較，糖尿病組腎重/體重、血糖、尿糖、血肌酐、血尿素氮、尿量、尿總蛋白增加，尿肌酐降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；槲皮素對照組與正常對照組比較各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與糖尿病組比較，槲皮素治療組腎重/體重、血糖、血肌酐、血尿素氮、尿量、尿總蛋白降低，尿肌酐增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠臨床參數(shù)分析/ˉx±s

2.2 槲皮素對STZ 誘導的糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學的影響 HE 染色結果顯示，與正常對照組相比，槲皮素對照組腎小球無明顯變化，但糖尿病組腎小球基底膜出現(xiàn)彌漫性加厚，而槲皮素治療后腎小球基底膜彌漫性增厚出現(xiàn)明顯改善（圖1A）。

馬森染色結果顯示，與正常對照組比較，槲皮素對照組腎臟中膠原的堆積無明顯差異，糖尿病組大鼠腎臟膠原的堆積明顯增多，而槲皮素治療組膠原的堆積與糖尿病組比有明顯改善（圖1B）。

2.3 槲皮素對STZ 誘導的糖尿病大鼠腎皮質FN表達的影響 與正常對照組比較，糖尿病組FN蛋白表達量顯著增加（P＜0.01）；與糖尿病組比較，槲皮素治療組FN表達量顯著減少（P＜0.01）（圖2）。

圖2 槲皮素對STZ誘導的糖尿病大鼠腎皮質中FN表達的影響

3 討論

在持續(xù)高糖狀態(tài)下，體內氧化應激和非酶糖基化反應均很明顯，在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用，抑制氧化糖基化可能延緩或減輕糖尿病腎病并發(fā)癥［11］。因此，有效控制血糖也是治療糖尿病腎病的一種最常見的手段。氨基酸脫氨基產生的NH3和CO2在肝臟中合成尿素。腎臟為排泄尿素的主要器官，若腎臟發(fā)生病變，腎小球對血尿素氮的清除率下降，造成血尿素氮水平升高［12］。本研究結果顯示，糖尿病大鼠血尿素氮比正常對照組明顯升高，給予槲皮素治療后血尿素氮與糖尿病組比明顯降低，這可能是因為糖尿病組大鼠腎實質受損，濾過能力下降所致，而給予槲皮素治療后，腎臟損傷有所恢復，從而降低血尿素氮水平。

本研究結果顯示，給予槲皮素治療的糖尿病大鼠其血清肌酐水平與糖尿病組比明顯下降，尿肌酐水平與糖尿病組比升高。肌酐大部分是從腎小球濾過，不被腎小管重吸收，腎小球濾過功能損傷時，影響肌酐的排出，導致血中肌酐升高，尿中肌酐減少，因此，血肌酐與尿肌酐水平可粗略反映腎小球濾過功能，反映腎實質的損傷情況［13-16］。本研究結果表明，槲皮素可使糖尿病大鼠腎小球濾過功能有所恢復。

胞外基質堆積是糖尿病腎病病理特征之一［17］，膠原蛋白和纖連蛋白均屬于胞外基質蛋白。本研究結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病大鼠腎臟腎皮質纖連蛋白表達和膠原蛋白堆積明顯升高，而給予槲皮素治療的糖尿病大鼠其腎皮質纖連蛋白（FN）表達和膠原蛋白堆積比糖尿病組均明顯下降，這說明槲皮素治療的糖尿病大鼠其腎臟胞外基質堆積有所改善，槲皮素對糖尿病腎病大鼠腎臟有一定的保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads 信號通路在糖尿病腎病動物模型和細胞模型中均被激活，導致系膜細胞產生過多的胞外基質成分，且進行性積聚，逐步發(fā)展為腎小球硬化［18］。有文獻報道，TGF-β/Smads 信號通路的激活在誘導腎小球和腎小管的細胞肥大、介導足細胞損傷、促進系膜細胞增生、基底膜增厚以及腎間質纖維化中起重要作用，是糖尿病腎病發(fā)病機制的共同通路。通過對TGF-β/Smads信號通路的抑制可減輕糖尿病腎病的進程［5，19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制糖尿病腎病小鼠腎臟中胞外基質蛋白堆積，腎小球基底膜增厚、血肌酐和血尿素氮均有所改善，從而使腎臟損傷有所恢復，但其分子機制是否與槲皮素對TGF-β/Smads信號通路的抑制有關還值得進一步探討。