凌寶殿，謝志軍，張文娟，王曉玲，王芳勝，胡曉梅，賴(lài)姨梅，吳何莉，胡龍華

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000；4. 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330000）

胃癌（Gastric cancer， GC）是全球第五大流行和第四大致命的惡性腫瘤，占所有癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的7.7%［1］。人體胃腸道定植大量微生物，微生物之間互相拮抗互為制約，維持相對(duì)穩(wěn)定的微生物微環(huán)境，組成一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。機(jī)體胃腸道中的微生物在多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，參與了能量代謝、營(yíng)養(yǎng)吸收、腸道免疫系統(tǒng)的成熟以及防止病原體感染［2］，也參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。微生物群的改變可能與癌癥有關(guān)［3-4］。幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori）感染與GC 密切相關(guān)。研究表明，盡管幽門(mén)螺桿菌可能參與了90%以上胃癌的發(fā)生，但它在胃炎晚期向癌癥發(fā)展過(guò)程中的作用可能很?。?］，這預(yù)示著可能存在其他潛在生物菌群［6］在胃癌發(fā)展中的作用。以往由于分子生物學(xué)技術(shù)的局限，很難全面了解人類(lèi)胃腸道微生物菌群的組成。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，推動(dòng)了越來(lái)越多關(guān)于胃微生物群和腸道微生物群與GC 相關(guān)性研究。然而，有關(guān)胃微生物群和腸道微生物群的多樣性與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究較少。本研究擬表征胃癌患者胃黏膜組織和腸道中的微生物群落，并探討其與胃癌發(fā)生的潛在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 通過(guò)胃鏡檢查篩選贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2019年1月—12月疑似胃癌患者52例，最終病理確診11 例。剔除近期使用抗生素患者5例，轉(zhuǎn)移癌1 例，共收集5 例原發(fā)性胃癌患者胃黏膜組織和糞便樣本。同時(shí)篩選5 例近3 個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何抗菌藥物的健康人群作為對(duì)照組，收集其胃黏膜組織和糞便樣本。共得到20 個(gè)樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初診胃癌患者；（2）原發(fā)性胃癌患者；（3）能同時(shí)獲得胃黏膜組織和糞便標(biāo)本；（4）近3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何抗菌藥物和益生菌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜18周歲的未成年人，＞70周歲的老年人；（2）同時(shí)并發(fā)其他消化道疾病的患者；（3）既往有放化療史和胃腸道手術(shù)史患者；（4）近2周有胃腸道感染疾病史患者。所有入選者本人或其家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 胃黏膜組織和糞便標(biāo)本采集 使用標(biāo)準(zhǔn)胃鏡鉗獲得1～2 mm 的胃黏膜活檢樣本置于無(wú)菌EP 管中；使用糞便收集管患者自我收集50～100 mg 糞便樣本。樣本立即轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱保存，待進(jìn)一步處理。

1.3 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 采用CTAB 或SDS 方法對(duì)樣品基因組進(jìn)行提取，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取出DNA 純度和濃度；隨后取適量DNA 于離心管中，并用無(wú)菌水稀釋至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域選擇使用包含barcode 的特異性引物，采用New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高效高保真酶進(jìn)行PCR，以確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳再次進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)目的條帶使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑 盒 進(jìn) 行 回 收。使 用NEBNext?Ultra ? IIDNA Library Prep Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，將構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行Qubit 和Q-PCR 定量；待文庫(kù)合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行測(cè)序。

1.4 腸道菌群的高通量測(cè)序 樣本委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列獲得的數(shù)據(jù)拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去barcode 和引物序列后使用FLASH 軟件對(duì)樣本的reads 進(jìn)行拼接， 獲得原始標(biāo)簽（Raw Tags）。隨后使用fastp 軟件對(duì)獲得的Raw Tags 進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量測(cè)序標(biāo)簽（Clean Tags）。最后使用Usearch 軟件將Clean Tags 與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)以檢測(cè)嵌合體并進(jìn)行去除，從而得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。使用QIIME2 軟件中的DADA2 模塊或deblur 進(jìn)行降噪，并過(guò)濾掉豐度＜5的序列，從而獲得最終的ASVs 以及特征表。隨后，使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊將得到的ASVs與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到每個(gè)ASV的物種信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方 法 使用QIIME2 軟 件計(jì)算Observed_Otus、Shannon、Simpson、Chao1、Goods_Coverage、Dominance 和Pielou_E 指數(shù)，并繪制稀釋曲線(xiàn)（Rarefaction Curve）和物種累積箱形圖（Species Accumulation Boxplot）。同時(shí)對(duì)alpha 多樣性的組間差異進(jìn)行分析。使用QIIME2 軟件計(jì)算Unifrac 距離，并使用R 軟件繪制PCA、主坐標(biāo)分析（PCoA）和NMDS 降維圖。其中，PCA 和PCoA 調(diào)用R 軟件中的ade4 和ggplot2 包。隨 后，調(diào) 用QIIME2 軟 件 中 的adonis 和anosim 函數(shù)分析組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性。最后，使用線(xiàn)性判別效應(yīng)分析（LEfSe）或R軟件完成組間顯著差異性物種分析。其中，LEfSe 分析通過(guò)LEfSe 軟件來(lái)完成，默認(rèn)設(shè)置LDA score 閾值為4。MetaStat 分析則使用R 軟件對(duì)兩個(gè)比較組在門(mén)、綱、目、科、屬和種6 個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行差異性檢驗(yàn)篩選出組間顯著差異性物種；而t檢驗(yàn)同樣使用R軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)各個(gè)分類(lèi)水平上的物種顯著差異性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胃黏膜和糞便標(biāo)本細(xì)菌的OTU分析 根據(jù)聚類(lèi)從20 個(gè)樣本中總共獲得3 069 個(gè)OTU，其中胃黏膜和糞便樣本共享OTU 557 個(gè)，胃癌組黏膜（WANM）和對(duì)照組黏膜（ZCNM）樣本共享OTU 1 049個(gè)，胃癌組糞便（WAFB）和對(duì)照組糞便（ZCFB）樣本共享OTU 815 個(gè)（圖1）。隨著測(cè)序深度的增加，胃黏膜和糞便樣本菌群稀釋曲線(xiàn)趨于平坦（圖2），表明實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)合理，基本達(dá)到測(cè)序深度。

圖1 胃癌組黏膜（WANM）、對(duì)照組黏膜（ZCNM）、胃癌組糞便（WAFB）、對(duì)照組糞便（ZCFB）菌群OTU分析韋恩圖

圖2 胃黏膜和糞便樣本菌群稀釋曲線(xiàn)

2.2 兩組胃黏膜和糞便菌群ɑ多樣性分析 ɑ多樣性顯示，胃癌組黏膜（WANM）、對(duì)照組黏膜（ZCNM）、胃 癌 組 糞 便（WAFB）和 對(duì) 照 組 糞 便（ZCFB）組間Dominance、Shannon、Chao1、Simpson、Pielou_e、Observed_otus指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組胃黏膜和糞便菌群α 多樣性指數(shù)差異分析（P-value）

2.3 兩組胃黏膜和糞便菌群β 多樣性分析 本研究基于非加權(quán)Unifrac 的PCoA 法分析胃癌組和對(duì)照組胃黏膜和糞便樣本的微生物結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果顯示，胃癌組胃黏膜和糞便菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05），胃癌組胃黏膜和糞便樣本之間物種豐度和構(gòu)成較為分散，而對(duì)照組之間的關(guān)系則更近（圖3）。

圖3 兩組胃黏膜和糞便菌群坐標(biāo)分析（PCoA）分析圖

2.4 兩組群落結(jié)構(gòu)差異顯著性分析 在細(xì)菌分類(lèi)學(xué)的門(mén)水平上，胃癌組黏膜（WANM）和對(duì)照組黏膜（ZCNM）菌群主要由6 個(gè)門(mén)組成，包括厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、彎曲桿菌門(mén)（Campylobacter）和古細(xì)菌（Archaea）。相比對(duì)照組黏 膜（ZCNM），胃 癌 組 黏 膜（WANM）Archaea、Bacteroidetes豐度降低，而Firmicutes、Campylobacter豐度增加。胃癌組糞便（WAFB）和對(duì)照組糞便（ZCFB）菌群主要由4 個(gè)門(mén)組成，包括Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes，其 中Firmicutes和Proteobacteria明顯占優(yōu)勢(shì)，占總數(shù)的65%以上。相比對(duì)照組糞便（ZCFB），胃癌組糞便（WAFB）Firmicutes、Actinobacteria豐 度 降 低，而Proteobacteria、Bacteroidetes、Campylobacter豐度增加（圖4）。

圖4 兩組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析圖

2.5 兩組胃黏膜和糞便菌群LEfSe 差異分析 使用LEfSe差異分析表明，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育型在4組樣本之間存在顯著差異（圖5A）。LDA 值分布柱狀圖中展示了LDA 評(píng)分≥4的物種，即認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物，柱狀圖的長(zhǎng)度代表差異物種的影響大小。當(dāng)LDA 評(píng)分的絕對(duì)值≥4 時(shí)，4 組間有39個(gè)物種差異顯著。其中對(duì)照組黏膜（ZCNM）富集9 種，即Archaea、Bacteroidetes、普 雷 沃 菌 屬（Prevotellaceae）、巴斯德菌屬（Pasteurellales）、放線(xiàn)桿菌屬(Actinobacillus）、腸炎弧菌（Parahaemolyticus）、伯克霍爾德菌屬（Bukholderiales）、異普雷沃菌屬（Alloprevotella）、奈瑟菌科（Neisseraceae）；胃癌組黏膜（WANM）富集5 種，即Helicobacteriota、梭桿菌屬（Fusobacteriia）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、赫爾曼埃希菌（Haemonadales）、韋榮球菌（Veronococcus）。對(duì)照組糞便（ZCFB）富集5 種，即梭菌屬(Clostridia）、顫螺旋菌目(Oscillospirales）、毛螺菌目(Lachnospirales）、雙歧桿菌目(Bifidobacteriales）、布勞特氏菌屬(Blautia）；胃癌組糞便（WAFB）富集2 種，即腸桿菌目(Enterobacterales）、大 腸 埃 希 菌- 志 賀 菌 屬（Escherichia-Shigella）（圖5B）。在屬水平上，胃癌組大腸埃希菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）豐度高于對(duì)照組，而擬桿菌屬（Bacteroides）等益生菌則低于對(duì)照組。

圖5 4組菌群分布的富集偏差圖

2.6 KEGG 功能預(yù)測(cè) 采用PICRUSt2 軟件基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)胃腸道菌群進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)35個(gè)代謝通路有顯著差異（圖6）。

圖6 PICRUSt2 基于細(xì)菌16S rRNA 基因序列的胃黏膜相關(guān)微生物組功能

3 討論

胃癌是一種多因素疾病，腫瘤微環(huán)境的改變是胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的必要條件。作為腫瘤微環(huán)境的一部分，胃微生物群和腸道微生物群中的細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生促腫瘤代謝物、DNA 損傷、抑制抗腫瘤免疫和激活致癌信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胃腫瘤的發(fā)展。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，胃癌患者的微生物群多樣性存在差異［7-8］。許多腸道和胃微生物被認(rèn)為是結(jié)直腸癌和胃癌的致癌物［9-11］，或是增加患者對(duì)癌癥的免疫治療反應(yīng)的益生菌［12］。然而，關(guān)于疾病進(jìn)展與胃和腸道微生物群多樣性之間關(guān)系的研究結(jié)果不一。

幽門(mén)螺桿菌感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，該菌具有多種與胃癌相關(guān)的毒力因子［13］，如空泡毒素、細(xì)胞毒素相關(guān)基因A和外膜蛋白，亦可過(guò)度表達(dá)如IL-1β、IL-8、IL-17 和TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，引起慢性胃炎，進(jìn)而發(fā)展為胃萎縮、腸化生，最終進(jìn)展為胃腸腺癌［14］。幽門(mén)螺桿菌感染和酸分泌的損害，改變了胃微生物群的組成，促進(jìn)了胃內(nèi)其他細(xì)菌的定植。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者乳酸菌屬的比例升高［8］，乳球菌和乳桿菌屬可以產(chǎn)生乳酸，而乳酸可以作為腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的能量來(lái)源，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組和對(duì)照組之間胃黏膜和糞便樣本優(yōu)化序列數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胃癌組糞便（WAFB）OTU 數(shù)明顯高于對(duì)照組，表明胃癌組腸道菌群物種豐富程度大于對(duì)照組，這與李慧珍等［15］報(bào)道一致。ɑ 多樣性顯示，兩組人群胃黏膜和腸道菌群的Dominance、Shannon、Chao1、Simpson 指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與YOUSSEF O等［16］、COSTEA P I 等［17］研究結(jié)果一致，即人體腸道微生物受飲食、疾病、治療干預(yù)等因素影響，可能會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)菌群豐度及多樣性的暫時(shí)性變化。但胃癌組糞便和胃癌組黏膜組內(nèi)物種多樣性中位數(shù)均高于對(duì)照組，這表明胃癌患者腸道菌群和胃黏膜菌群多樣性較高。這與聶蓬等［18］、HU Y L 等［19］研究一致，但亦有不一致的研究結(jié)果［20-22］，可能由于地域因素對(duì)胃腸道菌群的影響所致。β 多樣性顯示，胃癌組胃黏膜和糞便樣本之間物種豐度和構(gòu)成較為分散，而對(duì)照組之間的關(guān)系則更近。這表明胃癌中微生物群落的結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)發(fā)育上是多樣化的，與研究報(bào)道一致［23-24］。

主坐標(biāo)分析顯示，胃癌組與對(duì)照組菌群結(jié)構(gòu)存在差異。線(xiàn)性判別效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在門(mén)水平上，胃黏膜菌群的豐度差異主要集中在厚壁菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、彎曲桿菌門(mén)、古細(xì)菌，腸道菌群的豐度差異主要集中在厚壁菌門(mén)、變形桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和擬桿菌門(mén)，與COSTEA P I等［17］研究結(jié)果一致。其中擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)為具有顯著差異的標(biāo)志性菌群，與LIANG W R 等［21］研究結(jié)果一致。在屬水平上，胃癌組大腸埃希菌—志賀菌屬豐度顯著高于對(duì)照組，而擬桿菌屬等益生菌則顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（線(xiàn)性判別分析值=4，P＜0.05），是屬水平上的標(biāo)志性物種。與李寧寧等［20］、黃鑫等［25］研究一致。提示志賀氏桿菌的富集可能預(yù)測(cè)GC 的發(fā)生。京都基因和基因組百科全書(shū)結(jié)果顯示，胃癌患者與健康對(duì)照組間的菌群代謝存在差異。

然而，盡管大多數(shù)研究表明與健康人群相比，胃癌患者的微生物群發(fā)生了改變，但微生物群中不同細(xì)菌在特定微生境中的作用仍不清楚。在胃癌發(fā)生過(guò)程中，需要進(jìn)一步研究確定胃癌細(xì)菌的微生物群和宿主間的相互作用。