韓善浩, 李建輝, 祝玉婷, 高宏偉, 董 波,3??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003; 2. 青島海關(guān)檢測技術(shù)中心, 山東 青島 266114; 3. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所, 山東 青島 266003)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在中國,癌癥發(fā)病率和死亡率一直在上升[1]。死亡率最高的癌癥為肺癌,其次是肝癌和胃癌[2]。腫瘤的治療方法主要有手術(shù)療法、放射療法以及化學(xué)藥物療法。其中化學(xué)藥物療法的成效已初步顯現(xiàn),腫瘤患者的生存時間明顯增長。但對于一些死亡率較高的癌癥,化學(xué)藥物仍具有毒副作用大、治療效率低、腫瘤細(xì)胞易耐藥等問題。因此,尋求高效、毒性小、特異性強的抗腫瘤化學(xué)藥物成為解決癌癥疾病的當(dāng)務(wù)之急[3]。

海鞘作為被囊動物,在生物進(jìn)化史上處于無脊椎動物到脊椎動物的進(jìn)化節(jié)點[4]。由于其多樣性和廣泛的適應(yīng)性,決定了海鞘次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)新穎性和功能多樣性[5]。第一個在海鞘中發(fā)現(xiàn)的具有活性的化合物為香葉醇對苯二酚,具有抗白血病的細(xì)胞毒性[6]。此后,越來越多海鞘來源的天然活性化合物被報道,包括生物堿、多肽、聚酮、醌類以及甾體等物質(zhì),表明海鞘具有極大的藥用挖掘價值[7],是海洋天然活性產(chǎn)物的重要來源[8]。從海鞘(Trididemnumsolidum)中分離得到的環(huán)肽Didemnin B在1984年進(jìn)入一期臨床試驗階段,成為第一個進(jìn)入臨床研究的海洋藥物[9]。Didemnin B具有環(huán)狀脫氫肽的新穎結(jié)構(gòu),對多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,此外還具有抗病毒的生物功能[10]。Didemnin B通過抑制蛋白質(zhì)的生物合成來產(chǎn)生細(xì)胞毒性及免疫抑制作用[11]。而在這之后,又從加勒比海海鞘(Ecteinascidiaturbinate)中分離得到Ecteinascidin 743(ET-743),該化合物屬于生物堿,具有廣譜的抗癌活性,被稱為海洋藥物史上里程碑式的發(fā)現(xiàn)之一[12]。ET-743具有獨特的作用機制,在體外能夠抑制轉(zhuǎn)錄依賴的核苷酸切除修復(fù)途徑,以及通過影響細(xì)胞周期來促進(jìn)非p53途徑依賴的細(xì)胞凋亡[13]。在臨床上ET-743也顯示出較高的應(yīng)用價值[14]。

真海鞘屬于脊索動物門、尾索亞門、海鞘綱[15]。主要分布于日本海南鹿半島以北以及韓國東、南海岸。由于其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),例如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、類胡蘿卜素、?；撬?、血漿原和其他微量營養(yǎng)素等[16],日本、韓國和中國都開展了真海鞘的人工養(yǎng)殖[17]。近年來,在真海鞘中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的真海鞘內(nèi)囊酶解物[18]、抗微生物的血細(xì)胞凝集素等[19]。但關(guān)于真海鞘抗腫瘤活性的天然小分子報道甚少,且缺乏作用機制方面的研究工作[20]。

本研究采用真海鞘為原料,以乙醇為介質(zhì)提取真海鞘根索及被囊中的天然活性產(chǎn)物。利用硅膠柱層析、液相層析等方法對其進(jìn)行分離純化,并利用腫瘤細(xì)胞系研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

真海鞘采于山東省榮成市尋山集團。高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和1X磷酸緩沖鹽溶液(PBS)均購買于Biological Industries (Israel)。噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購買于Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。有機試劑均購買于國藥。薄層層析(TLC)所用硅膠制備板來自默克。硅膠來自于青島海洋化工集團。HepG2細(xì)胞來自中國海洋大學(xué)陳西廣教授實驗室,HeLa細(xì)胞和L929細(xì)胞來自中科院上海細(xì)胞庫,HT-1080細(xì)胞來自中國海洋大學(xué)實驗中心。細(xì)胞培養(yǎng)所用耗材包括96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,167008)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING,3524)、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Thermo Fisher,140675)和細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Thermo Fisher,156367)。

1.2 活性物質(zhì)制備與純化

1.2.1 真海鞘根索和被囊乙醇提取物的制備 解剖取真海鞘根索和被囊,破碎機打碎約40目,將碎屑在95%乙醇中震蕩浸泡1周。

1.2.2 硅膠柱層析 乙酸乙酯-石油醚體系作為流動相。將乙醇提取物原液拌于200～300目硅膠中。待樣品干于硅膠中后進(jìn)行干法裝柱。最下端為300～400目硅膠,高度約為40 cm,上層為樣品,最上層為60～80目硅膠用于緩沖。裝好層析柱之后,使用極性較小的石油醚對硅膠柱進(jìn)行浸潤。浸潤完成后依次采用洗脫劑石油醚∶乙酸乙酯=1∶3(800 mL)、1∶2(400 mL)、1∶1(200 mL)、甲醇(500～700 mL)進(jìn)行洗脫,得到ST-Ⅱ。采用二氯甲烷-甲醇體系進(jìn)行制備型薄層層析(PLC)。將ST-Ⅱ點于默克制備型硅膠板上,流動相條件為二氯甲烷∶甲醇=30∶1。層析結(jié)束后得到目的樣品。

1.2.3 制備液相純化 以色譜級甲醇(國藥)、純水為流動相,流動相極性由小到大(甲醇含量逐漸減小)進(jìn)行分離條件的摸索,在甲醇∶水=7∶3時對ST-Ⅱ-Ⅱ的分離效果最佳。制備時每次進(jìn)樣量為200 μL,按照各樣品出峰時間手動接樣。制備液相所用色譜柱為Kromasil C18反向色譜柱,液相型號為日立L-2000型液相。

1.2.4 化合物的結(jié)構(gòu)解析1H NMR譜,1H-1H COSY譜均來自BRUKER AVANCE III HD 600 MHz核磁共振波譜儀。約1 mg樣品加入含有0.03%四甲基硅烷(Tetramethylsilane,TMS)的氘代DMSO,混合均勻,裝入核磁管中待測,室溫測定。NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及Mest Re Nova9.0.1軟件處理。

1.3 體外活性及機理研究

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均使用含15%胎牛血清(BI)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。L929細(xì)胞使用含15%胎牛血清(Gibco)和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞在提供95%空氣,5%二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱(Thermo scientific)中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT(噻唑藍(lán))比色法 采用MTT體外檢測法檢測ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Ω骷?xì)胞系的增殖抑制率[21]。將各細(xì)胞系種在96孔板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞的密度長到60%左右時吸去舊培養(yǎng)液,加入含有不同濃度ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)48 h后吸去舊培養(yǎng)液,加入配置好的MTT染液,MTT染液由90%無血清的DMEM培養(yǎng)基和10%的MTT染液組成。37 ℃孵育4 h后吸去染液,每孔加入100 μL DMSO,37 ℃孵育5 min后在490 nm吸光度下檢測對照組和實驗組的吸光度值,并計算增殖抑制率。

1.3.3 DAPI細(xì)胞核染色 使用4,6-二脒基-乙-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核,觀察細(xì)胞核形態(tài)的方法作為細(xì)胞凋亡的一種指標(biāo)[22]。將HepG2細(xì)胞種在6孔板上,6孔板底部放置一片細(xì)胞爬片,使HepG2細(xì)胞爬片,便于后續(xù)拍照,37 ℃孵育24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到孔的60%～70%后,吸去舊的培養(yǎng)液,加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液。之后37 ℃孵育24 h,取出細(xì)胞爬片,放置于載玻片上,DAPI染色后封片,激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM-900)拍照。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI染色檢測細(xì)胞凋亡 將HepG2細(xì)胞種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,然后37 ℃再次孵育24 h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集于EP管中后,加入染料,避光染色15 min,隨后置于冰浴中。1 000 r/min離心去除染液,加入適量PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特Cyto FLEX)檢測對照組和實驗組凋亡細(xì)胞比例。

1.3.5 細(xì)胞活性氧(ROS)檢測 將HepG2種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用DCFH-DA探針染色15 min。15 min后,使用不含血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌染料3次。洗滌完成后,板中加入適量PBS緩沖液,倒置于熒光顯微鏡(品牌:尼康)拍攝。

1.3.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,再次37 ℃孵育24 h。使用JC-1探針對HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色,染色時在37 ℃培養(yǎng)箱中染色20 min。使用JC-1染色緩沖液洗滌2次,隨后孔內(nèi)加入適量PBS緩沖液防止細(xì)胞干燥。最后采用酶標(biāo)儀(Tecan Infinite E Plex)檢測熒光強度。JC-1單體采用490 nm激發(fā)波長,530 nm發(fā)射波長。JC-1聚合物采用525 nm激發(fā)波長,590 nm發(fā)射波長。

1.3.7 Western Blot檢測 將HepG2接種在6孔板上,37 ℃孵育24 h。吸去舊培養(yǎng)液,實驗組加入含有70 μg/mL ST-Ⅱ-Ⅱ的培養(yǎng)液,37 ℃再次孵育24 h。孵育完成后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,并收集于EP管中。隨后裂解細(xì)胞提取蛋白。蛋白提取完成后,上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后,濕法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后,使用5%脫脂牛奶封閉1 h。隨后將一抗按照1∶500比例稀釋后4 ℃過夜孵育。一抗孵育完成后,將PVDF膜(默克)取出,使用TBST清洗3次,每次15 min。二抗按照1∶1 000比例稀釋后在室溫下孵育1 h。二抗孵育完成后,再次在TBST中清洗3次,每次15 min。清洗完成后,顯色拍照。

2 結(jié)果

2.1 真海鞘根索被囊乙醇提取物活性物質(zhì)的分離與活性驗證

真海鞘的構(gòu)造可以分為3部分:外部包圍著一層堅硬的殼,呈橙紅色;殼頂部有生殖根;殼內(nèi)部為其身體組織,呈橙色(見圖1A)。

(A. 真海鞘成體及其3個組成部分;B. 根索和被囊乙醇提取物與內(nèi)囊乙醇提取物對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性,2組實驗組濃度均為200 μL/mL ,對照組加入含有與實驗組等量乙醇的培養(yǎng)液,p<0.001,0.01

首先本文作者使用95%乙醇提取根索被囊以及內(nèi)囊中的天然活性產(chǎn)物。利用MTT比色法檢測兩部分的乙醇提取物是否具有細(xì)胞毒性。MTT比色法檢測結(jié)果表明根索被囊乙醇提取物對HepG2細(xì)胞具有極強的細(xì)胞毒性,內(nèi)囊乙醇提取物對HepG2細(xì)胞具有較弱的細(xì)胞毒性(見圖1B)。同時根索被囊乙醇提取物對L929細(xì)胞的毒性較小(見圖1C)。采用硅膠柱層析分離根索被囊乙醇提取物得到兩部分,第一部分命名為ST-Ⅰ,第二部分命名為ST-Ⅱ。MTT比色法檢測結(jié)果表明ST-Ⅱ?qū)epG2細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性(見圖1D)。

2.2 ST-Ⅱ的分離與活性驗證

得到ST-Ⅱ后,采用PLC法,在二氯甲烷∶甲醇=30∶1的情況下對ST-Ⅱ進(jìn)行分離得到9個組分(見圖2A)。MTT比色法對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測結(jié)果表明,在加樣濃度為50 μg/mL、作用時間為48 h時,第二組樣品的細(xì)胞毒性較為明顯(見圖2B),并將其命名為ST-Ⅱ-Ⅱ。對小鼠成纖維細(xì)胞L929的MTT比色法實驗結(jié)果表明,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)ζ錈o明顯細(xì)胞毒性(見圖2C)。同時本文作者選擇發(fā)病率和死亡率較高的癌癥細(xì)胞系-人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞、人纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞,來檢測ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)λ鼈兊募?xì)胞毒性,結(jié)果表明,100 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)eLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均顯示出細(xì)胞毒性,其中HepG2細(xì)胞對ST-Ⅱ-Ⅱ最為敏感(見圖2D)。后續(xù)實驗均利用HepG2細(xì)胞進(jìn)行實驗。

(A. PLC分離ST-Ⅱ得到1～9組組分;B. PLC分離ST-Ⅱ得到的9組組分(ST-Ⅱ-Ⅰ～ST-Ⅱ-Ⅸ)對HepG2細(xì)胞的增殖影響,實驗組濃度均為50 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

2.3 ST-Ⅱ-Ⅱ的分離與活性驗證

確定ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)Π┘?xì)胞具有毒性后,使用UPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ含有多種具有生物活性的天然產(chǎn)物。為了進(jìn)一步確定ST-Ⅱ-Ⅱ中的有效活性化合物,使用制備液相對ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在甲醇∶水=7∶3的條件下,得到了9個組分(見圖3A)。隨后對這9組分進(jìn)行了活性驗證,在30 μg/mL的濃度下,第Ⅸ組分對HepG2細(xì)胞的毒性最強(見圖3B),其他組分活性較弱或沒有生物活性。在10 μg/mL濃度下,ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ和紫杉醇對癌細(xì)胞增殖抑制率處于同一水平。同時ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ對正常細(xì)胞L929無明顯細(xì)胞毒性(見圖3C)。以上結(jié)果表明ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中導(dǎo)致細(xì)胞毒性的主要組分。

(A. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個組分;B. HPLC分離ST-Ⅱ-Ⅱ得到的9個組分的活性驗證,實驗組濃度均為30 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,p<0.001,0.01

2.4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.5 ST-Ⅱ-Ⅱ誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

以上結(jié)果表明海鞘根索被囊乙醇提取物的主要活性為組分為ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,但實驗中ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率極低?；赟T-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是ST-Ⅱ-Ⅱ中的主要活性組分(見圖3B),本研究后續(xù)利用ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行作用機制實驗。

為了研究ST-Ⅱ-Ⅱ?qū)epG2增殖抑制作用機制,本研究中使用Annexin V-FITC/PI染色,DAPI細(xì)胞核染色以及細(xì)胞凋亡抑制劑Nicotiflorin確認(rèn)添加ST-Ⅱ-Ⅱ是否導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果說明,在濃度為70 μg/mL時,作用24 h后,凋亡細(xì)胞的比例較對照組有明顯提高(見圖5A)。DAPI細(xì)胞核染色實驗組細(xì)胞核有了較明顯的形態(tài)變化。與對照組相比,實驗組細(xì)胞核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,有核裂解情況發(fā)生(見圖5B)。細(xì)胞凋亡抑制劑Nicotiflorin與ST-Ⅱ-Ⅱ共同作用后,凋亡細(xì)胞比例顯著減少(見圖5C)。以上結(jié)果說明添加ST-Ⅱ-Ⅱ后引起HepG2細(xì)胞顯著凋亡。

(A.ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的核磁氫譜(1H NMR);B. ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的1H-1H COSY譜。 A. 1H NMR of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ; B.1H-1H COSY spectrum of ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ.) 圖4 ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ的結(jié)構(gòu)鑒定

2.6 ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體凋亡途徑引起HepG2細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步研究ST-Ⅱ-Ⅱ引起HepG2細(xì)胞凋亡的作用機制,本文作者進(jìn)行了線粒體膜電位、細(xì)胞ROS以及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況的檢測。在ST-Ⅱ-Ⅱ作用濃度為70 μg/mL,作用時間24 h后,HepG2細(xì)胞的ROS水平顯著升高(見圖6A),線粒體膜電位顯著降低(見圖6B)。ST-Ⅱ-Ⅱ處理后,HepG2細(xì)胞中促細(xì)胞凋亡蛋白p53和Bax表達(dá)水平顯著升高,而抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(見圖6C)。以上結(jié)果表明,海鞘根索被囊乙醇提取物通過線粒體凋亡通路引起HepG2細(xì)胞凋亡。

(①ST-Ⅱ-Ⅱ+Nicotiflorin. A. AV/PI染色檢測ST-Ⅱ-Ⅱ作用后早期凋亡細(xì)胞的比例,實驗組濃度為70 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,0.001

(A. ST-Ⅱ-Ⅱ作用后HepG2細(xì)胞相關(guān)ROS水平,實驗組濃度為70 μg/mL,對照組加入含有與實驗組等量甲醇的培養(yǎng)液 ,倒置熒光顯微鏡拍攝及相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計,0.001

3 討論

本研究通過硅膠柱層析、PLC和HPLC等方法從真海鞘根索及被囊中分離得到具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的天然活性組分。采用制備液相分離ST-Ⅱ-Ⅱ后得到高效抑制HepG2細(xì)胞增殖的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分。由于樣品制備得率極低,無法制備足夠量的ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ,不能對其進(jìn)行完整核磁圖譜檢測,只檢測了氫譜和1H-1H COSY譜,結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,推測ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ為硬脂酸與二取代苯環(huán)酯化后形成的一類結(jié)構(gòu)新穎的化合物。此構(gòu)效關(guān)系與姜酚類活性產(chǎn)物類似。姜酚類活性產(chǎn)物具有抗腫瘤功效,并且其苯環(huán)所帶碳鏈越長,抗腫瘤作用越顯著[23]。另外也有多不飽和脂肪酸能夠引起人源癌細(xì)胞鐵死亡的報道[24]。通過本研究推測的結(jié)構(gòu)同樣為二取代苯環(huán)加長碳鏈結(jié)構(gòu)。所以在此結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)類似物的基礎(chǔ)上,可能存在著高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物。

ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ無法制備得到更多樣品,但ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分占ST-Ⅱ-Ⅱ的40%左右(見圖3A),且ST-Ⅱ-Ⅱ的抗腫瘤活性集中在ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ組分,所以本研究中用ST-Ⅱ-Ⅱ進(jìn)行作用機制的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ抑制人肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖的機制是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡也稱為細(xì)胞程序性死亡,是細(xì)胞通過死亡來減少細(xì)胞增殖或?qū)?xì)胞DNA損傷做出反應(yīng)的一種機制[25]。細(xì)胞凋亡主要通過兩種途徑(線粒體信號通路和死亡受體信號通路)來實現(xiàn),而在線粒體信號通路控制的細(xì)胞凋亡中,Bcl-2蛋白家族起了非常關(guān)鍵的作用[26]。本文作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ST-Ⅱ-Ⅱ能夠促使HepG2細(xì)胞活性氧水平升高,線粒體膜電位降低,線粒體凋亡通路中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低,促凋亡蛋白Bax、p53蛋白的表達(dá)量升高,所以證實ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。線粒體是細(xì)胞的能量中心,是有氧呼吸的主要場所[27]。多種疾病都與線粒體有關(guān),如帕金森病[28],糖尿病等[29]。此外,線粒體參與凋亡調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等,被認(rèn)為是治療癌癥的一個重要靶點[30]。因此,ST-Ⅱ-Ⅱ通過線粒體通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,表明ST-Ⅱ-Ⅱ具有較強的抗腫瘤活性,本研究中的發(fā)現(xiàn)為該化合物在癌癥治療中的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

到目前為止,越來越多來源于海鞘的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn),其中的功能也各有異同。一些天然產(chǎn)物來源于海鞘本身,另一些來自海鞘的共生微生物。生物堿類物質(zhì)是在海鞘及其共生微生物中發(fā)現(xiàn)的最多的天然化合物種類[7]。來源于海鞘(Aplidiummeridianum)本身的生物堿類化合物Meridianins[31]是多種蛋白激酶的抑制劑。已經(jīng)應(yīng)用于臨床的生物堿類化合物ET-743來源于海鞘的共生微生物Ca.E. frumentensis[32]。關(guān)于ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ是來源于真海鞘自身還是來源于其共生微生物這個問題目前還不清楚,后續(xù)工作將會提高ST-Ⅱ-Ⅱ-Ⅸ制備得率,來確定其結(jié)構(gòu)及來源。真海鞘根索及被囊中天然活性產(chǎn)物的報道極少,本研究結(jié)果表明,真海鞘根索及被囊中含有高效的抗腫瘤天然活性產(chǎn)物,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

致謝：感謝中國科學(xué)院上海藥物研究所譚昌恒老師對核磁圖譜以及化合物解析方面的指導(dǎo)。感謝中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院王長云老師,邵長倫老師給予的實驗上的指導(dǎo)以及實驗儀器上的幫助。感謝中國海洋大學(xué)食品學(xué)院徐杰老師給予的實驗儀器上的幫助。