王占魁 袁明權(quán) 康武林 朱峰峰 董博 袁普衛(wèi) 余紅超**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046;2.開封市第二中醫(yī)院,河南 開封 475000)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA),是中老年常見的關(guān)節(jié)軟骨退行性疾病。主要表現(xiàn)為軟骨的退變、破壞,軟骨下骨增生,進(jìn)而引發(fā)關(guān)節(jié)功能障礙等一系列病理改變[1-2]。其中疼痛是KOA患者最嚴(yán)重的致殘癥狀,也是驅(qū)使患者就醫(yī)的主要因素[3]。大量臨床試驗(yàn)表明電針是一種有效緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎疼痛的治療手段,然而其鎮(zhèn)痛機(jī)制不明。既往研究表明P2X4受體與疼痛密切相關(guān),任春光等[4]研究表明,大鼠脊髓P2X4受體表達(dá)上調(diào)參與了骨癌痛的產(chǎn)生;黃華等[5]研究表明,電針夾脊穴可降低P2X4的表達(dá)從而減緩坐骨神經(jīng)慢性損傷大鼠的疼痛。P2X4受體可以通過介導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化,促進(jìn)炎癥因子表達(dá),從而導(dǎo)致疼痛。然而電針治療膝骨性關(guān)節(jié)炎性疼痛是否也與P2X4受體有關(guān),目前相關(guān)研究尚不清楚。因此,我們構(gòu)建膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠,探討電針是否通過調(diào)控P2X4受體表達(dá)進(jìn)而減輕膝骨性關(guān)節(jié)炎性疼痛。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取60只清潔級3月齡SD大鼠,雄性,體重200～230 g,人工喂養(yǎng)。動(dòng)物購由恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號:SCXK(湘)(2019-0004)。陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)研究室動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng),溫度保持在25～28 ℃,濕度維持在40%～60%,室內(nèi)光照周期采用12 h/12 h晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)大鼠的使用與處理等均遵照美國國立衛(wèi)生署頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)護(hù)和使用指南》進(jìn)行。人工適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為3組,其中電針組20只,模型組20只,空白組20只。

1.2主要試劑與儀器 試劑:Anti-IL-1β(美國abcam公司,ab283818)、Anti-Iba1單克隆抗體(美國abcam公司,ab178846)、Anti-P2X4多克隆抗體(美國abcam公司,ab134559),小鼠IL-1βELISA檢測試劑盒(上海紀(jì)寧公司),抗小鼠FITC、Alexa fluor 555標(biāo)記驢抗兔、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、Western-Blot相關(guān)試劑、RIPA裂解液(強(qiáng))、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF印跡膜(碧云天生物技術(shù)有限公司)、PBS緩沖液(福州科諾生物技術(shù)技術(shù)有限公司)。

儀器:SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州信諾達(dá)醫(yī)療科技有限公司),華佗牌一次性不銹鋼針灸針(0.25 mm×13 mm),包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司,JB-P5),切片機(jī)(上海萊卡儀器公司,RM2016),熒光顯微鏡(德國Lecia,MZ10F),F50酶標(biāo)儀(瑞士Sunrise公司),電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad)。

1.3KOA模型建立 采用碘乙酸鈉(Sodium iodoacetate)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射制備雄性大鼠KOA模型,造模周期為1 w。理論依據(jù):碘乙酸鈉通過抑制糖醇解和蛋白多糖的合成,可干擾軟骨細(xì)胞的正常代謝,造成軟骨細(xì)胞顯著的破壞[6]。其方法為:電針及模型組40只SD大鼠,向右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉0.4 ps/0.1 mL,即造模完成。于術(shù)后4 w處死造模組大鼠3只,取出膝關(guān)節(jié),通過番紅-固綠染色進(jìn)行病理組織學(xué)檢測,若出現(xiàn)軟骨結(jié)構(gòu)破壞,關(guān)節(jié)面粗糙不整等則造模成功。

1.4機(jī)械痛閾記錄 在造模前(第0 d)、造模后第7、14、21、28 d時(shí)測定機(jī)械痛閾值。采用Von Frey纖維絲測痛儀(美國Stoelting公司)。將標(biāo)記好的各組實(shí)驗(yàn)大鼠置于專用透明小格箱中,底部放置金屬網(wǎng)架,約10 min大鼠對陌生環(huán)境安靜后用不同大小的Von Frey絲(規(guī)格:1,1.4,2,4,6,8,10,15,26 g)垂直刺激其后爪足心,力度以Von Frey絲輕微彎曲,呈“S”型,出現(xiàn)明顯縮足或舔足而非跳躍性反應(yīng),則記為陽性。作用時(shí)間6～8 s,相鄰刺激間隔至少7 s。同一纖維絲刺激5次后出現(xiàn)3次陽性時(shí)記錄為最小刺激強(qiáng)度。

1.5電針干預(yù)方法 使用ABM動(dòng)物麻醉機(jī)對大鼠進(jìn)行吸入麻醉,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]取穴內(nèi)膝眼、外犢鼻(在髕韌帶內(nèi)緣凹陷中、髕韌帶外緣凹陷中)兩穴,采用0.25 mm×13 mm毫針垂直刺入5 mm,1次/日,設(shè)定脈沖頻率1～3 Hz,強(qiáng)度1～3 mA,設(shè)置為疏密波,以局部肌肉輕抽搐為度,連續(xù)干預(yù)4 w。

1.6組織取材 干預(yù)30d后處死各組大鼠,取材前15 h禁飲食。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,在泡沫紙板上仰臥固定大鼠。迅速沿劍突下緣剪開胸腔并暴露心臟,在心間處插入灌注針到主動(dòng)脈根部,快速灌注150 mL 37 ℃生理鹽水溶液,待從右心耳流出澄清液體,肝臟和無血心臟顏色相近時(shí),使用4 ℃4%多聚甲醛灌注,取出脊髓L4～L6腰膨大部位。

1.7觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1免疫組織化學(xué)熒光雙標(biāo)法 將備用的脊髓組織脫水,切片,載玻片貼片,丙酮固定,將載玻片拿出復(fù)溫后,放置在PBS緩沖液中進(jìn)行漂洗,在山羊血清工作液、室溫條件下封閉,一抗孵育:滴加一抗混合液(Iba-1抗1∶200、P2X4抗1∶50),4 ℃冰箱孵育過夜;二抗孵育:避光滴加熒光二抗混合液(抗小鼠FITC 1∶250;Alexa fluor 555標(biāo)記驢抗兔1∶500),避光滴加DAPI溶液,使用抗熒光淬滅劑封片,保存于暗盒中,并使用激光共焦距顯微鏡拍照觀察。

1.7.2Western blot檢測脊髓組織P2X4受體表達(dá) 取脊髓組織剪碎,加入適量裂解液。充分裂解后,4 ℃下12000 rpm離心30 min,迅速取上清液用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。制作8%分離膠及5%濃縮膠,按照每孔20 μg定量加入蛋白樣品后進(jìn)行電泳分離,后轉(zhuǎn)入PVDF膜。旋轉(zhuǎn)封閉,加入5 mL稀釋后的一抗(稀釋度1∶1000的Rabbit anti-P2X4 receptor antibody),過夜?；厥辗跤^夜一抗,加入5 mL 5%脫脂牛奶稀釋的二抗(稀釋度1∶8000 的HRP-conjugated secondary antibody)。棄去二抗,用5 mL 1x TBST,旋轉(zhuǎn)洗脫15 min/次,洗脫3次,每次洗脫完畢棄去TBST。將膜置于凝膠成像儀中,在膜上均勻滴加適量ECL發(fā)光液,按程序進(jìn)行曝光。

1.7.3Elisa檢測大鼠脊髓組織勻漿IL-1β濃度 將脊髓組織放入EP管中,加入適量裂解液,充分裂解后在4 ℃下,1200 rpm離心30 min,取上清液。第一排設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)孔,從低到高加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,余為樣本孔。各樣本孔加入10 μL樣本及樣本稀釋液40 μL。各孔加入辣根過氧化物酶100 μL,封孔,37 ℃孵育1 h。孵育結(jié)束,沒空加入350 μL洗滌劑1 min,棄去洗滌劑,吸水紙拍干,重復(fù)5次。每孔加入底物A、B各50 μL,37 ℃避光孵育25 min。每孔加入50 μL終止液,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定吸光度,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測定各組樣品中IL-1β濃度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。服從正態(tài)分布、方差齊性的多組均數(shù)之間的比較,采用方差分析,方差不齊采用秩和檢驗(yàn),在總體差異有顯著性的基礎(chǔ)上進(jìn)行均數(shù)間的兩兩比較。以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并使用Prism 8.3制圖。

2 結(jié)果

2.1番紅固綠染色結(jié)果 空白組:空白組大鼠關(guān)節(jié)間隙正常,軟骨結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊,軟骨表層光滑無破損,細(xì)胞排列有序,中間細(xì)胞層呈梭形聚集,松質(zhì)骨骨小梁密度適中。

模型組:模型組大鼠關(guān)節(jié)間隙較空白組變窄,關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞較空白組明顯,表層變薄變粗糙,表層不完整,可見部分區(qū)域軟骨表面破壞,局部軟骨增厚,軟骨纖維化明顯,中間細(xì)胞層梭形結(jié)構(gòu)消失,軟骨下骨出現(xiàn)增生,軟骨層變薄。

電針組:電針組大鼠關(guān)節(jié)間隙較空白組變窄,軟骨表層裂縫較少,組織損傷程度輕于模型組,整體上細(xì)胞排列較整齊,部分區(qū)域排列較亂,但優(yōu)于模型組,軟骨深層結(jié)構(gòu)清晰,各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)較正常(見圖1)。

2.2機(jī)械痛檢測結(jié)果 3組大鼠在造模前機(jī)械痛閾沒有顯著差異。在碘乙酸鈉注射建立KOA模型后模型組大鼠及電針組大鼠機(jī)械痛閾在第1個(gè)周期顯著下降,在之后的4個(gè)周期內(nèi)保持平穩(wěn),無明顯變化。從圖中可看出經(jīng)電針治療的電針組較模型組痛閾明顯提高(見圖1)。

結(jié)果表明,電針內(nèi)膝眼、外犢鼻穴治療可提高KOA模型大鼠的機(jī)械痛閾。

2.3免疫熒光結(jié)果 通過免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測P2X4在大鼠脊髓背角的表達(dá)部位。結(jié)果提示:P2X4受體與Iba-1表達(dá)部位一致,主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。而電針可抑制P2X4受體減少Iba-1的表達(dá),從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化(見圖2)。

圖1 各組番紅固綠染色結(jié)果

注:與KOA模型大鼠相比,電針組的機(jī)械痛閾值顯著提高,**P<0.01

2.4Western-Blot檢測結(jié)果 Western-Blot結(jié)果顯示:與空白組相比,模型組脊髓組織的P2X4受體蛋白表達(dá)高于空白組(P<0.01)。與模型組相比,電針組脊髓組織的P2X4受體蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.01)(見圖3)。

結(jié)果提示,KOA模型組大鼠脊髓背角P2X4受體的蛋白表達(dá)水平較空白組大鼠顯著提高。而模型組與電針組相比較,電針組脊髓背角P2X4受體蛋白表達(dá)水平顯著降低。提示電針可以抑制KOA模型脊髓增高的P2X4受體蛋白水平(見圖4)。

2.5Elisa檢測結(jié)果 Elisa結(jié)果顯示:模型組IL-1β水平明顯高于空白組(P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電針組與模型組比較,IL-1β水平均明顯降低(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。

結(jié)果表明:電針可以減少炎性因子IL-1β的釋放。

圖3 P2X4和Iba-1在大鼠脊髓背角免疫熒光雙標(biāo)

注:與空白組相比較:*P<0.01;#P>0.05與模型組相比較:**P<0.01

注:與空白組相比較:*P<0.01;#P<0.05與模型組相比較:**P<0.01

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎主要是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹?軟骨原有形態(tài)結(jié)構(gòu)遭受破壞并伴隨滑膜增生,使軟骨周圍骨質(zhì)增生以及關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)發(fā)生[8-11]。膝骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的疼痛,機(jī)制復(fù)雜,臨床治療棘手。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),電針能減輕KOA疼痛。Lin等[12]的一項(xiàng)初步研究表明,電針對于緩解KOA疼痛有一定效果,而每周3次較每周1次效果更優(yōu);Liang等[13]的研究表明,電針與軟組織松解針刺法兩組均可降低KOA的VAS評分;Lv等[14]的研究表明,電針可減緩疼痛,降低VAS評分;Tu等[15]的多中心研究發(fā)現(xiàn),電針可減輕KOA的疼痛,且效果持續(xù)較久。而電針鎮(zhèn)痛機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

內(nèi)膝眼及犢鼻穴是臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎最常見取穴部位?！夺樉募滓医?jīng)》記載:“犢鼻腫,可刺其上?！薄队颀埜琛吩?“膝頭紅腫不能行,必針膝眼、膝關(guān)穴?！苯陙?有學(xué)者通過文獻(xiàn)定量分析發(fā)現(xiàn)犢鼻穴在膝骨關(guān)節(jié)炎的治療穴位占比中達(dá)79.2%,占據(jù)首位[16]。本次研究也采用電針犢鼻穴及內(nèi)膝眼,同樣發(fā)現(xiàn)在改善骨關(guān)節(jié)炎退變方面有著較好作用。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)疏密波電針可改善局部血液循環(huán),促進(jìn)膝關(guān)節(jié)積液吸收及關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)[17],故在本研究中我們采用疏密波電針治療,取得了較好效果。

KOA的疼痛機(jī)制較為復(fù)雜,除了外周疼痛的產(chǎn)生外,疼痛敏化作用的神經(jīng)性疼痛機(jī)制或中樞疼痛機(jī)制也參與KOA之中[3,18-19]。既往研究表明脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)病理痛的發(fā)生、發(fā)展及調(diào)控[20-21]。作為P2X受體的一種亞型,P2X4受體主要分布在小膠質(zhì)細(xì)胞中,其對于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活具有重要的調(diào)控作用[22-24]。研究證明P2X4受體激活后,小膠質(zhì)細(xì)胞表面的Iba-1大量表達(dá),而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放炎性細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)炎癥,降低疼痛閾值[25]。結(jié)合我們研究結(jié)果提示P2X4參與了KOA患者的慢性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)膝眼、犢鼻穴可抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠脊髓P2X4受體表達(dá)及小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及下游炎癥因子IL-1β過度表達(dá),從而減輕膝骨性關(guān)節(jié)炎引起的疼痛。