徐曉瑩，王鶴，李秀梅，趙延寧，張寧，史文凱，劉蓬*

(1.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司，山東 煙臺(tái) 265617)

鈍吻黃蓋鰈(Pseudopleuronectesyokohamae)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)鰈科(Pleruonectida)黃蓋鰈屬(Pseudopleuronectes)[1]，主要分布于太平洋西部近海，多產(chǎn)于中國(guó)的黃海和渤海，是北溫帶淺海冷水底棲魚類[2]。其肉質(zhì)細(xì)嫩、食性溫和、適應(yīng)性強(qiáng)并喜好集群[3]，是黃海、渤海地區(qū)拖網(wǎng)作業(yè)的重要對(duì)象及理想的增殖對(duì)象[4]。

近年來(lái)，隨著中國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，鈍吻黃蓋鰈的集約化養(yǎng)殖不斷擴(kuò)大。鈍吻黃蓋鰈養(yǎng)殖過(guò)程中使用的飼料主要有冰鮮雜魚和配合飼料。隨著水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖“五大行動(dòng)”中“配合飼料替代幼雜魚行動(dòng)”的不斷推廣，養(yǎng)殖餌料已經(jīng)開(kāi)始逐漸向人工配合飼料轉(zhuǎn)變。目前，關(guān)于冰鮮雜魚和配合飼料的飼喂對(duì)比研究已在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、大黃魚(Larmichthyscrocea)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等各種經(jīng)濟(jì)魚類中相繼開(kāi)展，主要涉及生長(zhǎng)性能、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分、免疫功能和腸道微生物結(jié)構(gòu)等方面[5-8]，但在鈍吻黃蓋鰈的相關(guān)研究中未見(jiàn)報(bào)道。不同飼料對(duì)魚類腸道健康狀況和菌群組成影響較大，如攝食配合飼料和冰鮮雜魚的大口黑鱸腸道菌群多樣性不同[9]，攝食植物和海洋動(dòng)物的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群不同[10]。本研究中，通過(guò)高通量測(cè)序等方法，對(duì)投喂不同飼料的鈍吻黃蓋鰈進(jìn)行了生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)及腸道菌群分析，從其宏觀生長(zhǎng)及微觀結(jié)構(gòu)、腸道菌群等方面探索了鈍吻黃蓋鰈的營(yíng)養(yǎng)需求，以期為其飼料的合理配制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用鈍吻黃蓋鰈為煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司自繁自育的健康魚苗，體長(zhǎng)為(10.16±0.06)cm。配合飼料為賽格林仔稚魚育苗專用飼料，其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)52%、粗脂肪8%、粗灰分17%、粗纖維8%和水分12%；冰鮮雜魚捕撈自煙臺(tái)沿海，其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)21%、粗脂肪3%、粗灰分4%和水分66%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取健康且規(guī)格整齊的鈍吻黃蓋鰈270尾，隨機(jī)分為配合飼料投喂組(CF)、冰鮮雜魚與配合飼料混合投喂組(MF)及冰鮮雜魚投喂組(FF)。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚，分別放入126 L的塑料箱中養(yǎng)殖，水溫為(15±1)℃，鹽度為24～30。為保證水質(zhì)，每天定時(shí)更換魚箱中20%的水量。試驗(yàn)期間，每天7：30和16：30各投喂一次，混合投喂組上午投喂配合飼料，下午投喂冰鮮雜魚，冰鮮雜魚經(jīng)過(guò)粉碎后，每次投餌量為魚體質(zhì)量的3%，配合飼料每次投餌量為魚體質(zhì)量的1%。養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行42 d。

1.2.2 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定 在試驗(yàn)的第0、14、28、42天時(shí)分別稱量魚體質(zhì)量，第42天時(shí)測(cè)量魚體長(zhǎng)，每天記錄各組魚的攝食量。稱量前停食24 h，分別從各組隨機(jī)取10尾魚進(jìn)行測(cè)量。

試驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算各組魚的增重率(GBW，%)、特定生長(zhǎng)率(RSG，%/d)、飼料系數(shù)(RFC)和肥滿度(FC，g/cm3)。計(jì)算公式為

GBW=(Wt-W0)/W0×100%，

(1)

RSG=(lnWt-lnW0)/t×100%，

(2)

RFC=F/(Wt-W0)，

(3)

FC=Wt/L3×100。

(4)

其中：W0、Wt分別為試驗(yàn)魚初始體質(zhì)量(g)和終末體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；F為養(yǎng)殖周期內(nèi)的攝食量(g)；L為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的魚體長(zhǎng)(cm)。

1.2.3 腸道結(jié)構(gòu)觀察 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，從各組隨機(jī)取3尾魚，解剖取其腸道，并立即浸入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定液中固定。腸道組織石蠟切片由生工生物工程(上海)股份有限公司制作。后腸組織在固定液中固定24 h后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液反復(fù)沖洗，用叔丁醇脫水，浸蠟包埋，再用冷凍切片機(jī)連續(xù)切片(厚度6 μm)，HE染色。腸道切片在顯微鏡下觀察拍照，并測(cè)量絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和基層厚度等指標(biāo)。

1.2.4 腸道DNA提取與PCR擴(kuò)增 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，分別從各組隨機(jī)取9尾魚，無(wú)菌條件下解剖取出完整腸道，每3尾魚的腸道內(nèi)容物作為1個(gè)混合樣品置入凍存管中，將3個(gè)混合樣品用液氮速凍后保存待測(cè)。腸道樣品基因組DNA的提取和測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將提取的腸道微生物總DNA用341F(5′CCTAC- GGGNGGCWGCAG 3′)和805R(5′GACTACHVGGGTATCTAATCC 3′)特定引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在Illumina平臺(tái)完成測(cè)序。

1.2.5 腸道菌群生物信息學(xué)分析 下機(jī)數(shù)據(jù)使用FLASH 1.2.7[11]、QIIME 1.7.0[11]對(duì)樣品原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行拼接、過(guò)濾及質(zhì)控，去除嵌合體后獲得有效數(shù)據(jù)(effective tags)。應(yīng)用Uparse 7.0.1001軟件[12]在97%的一致性水平上對(duì)樣品所有effective tags進(jìn)行聚類分析，獲得OTUs?；诳刹僮餍苑诸悊卧狾TUs計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指數(shù)，并進(jìn)行Alpha多樣性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料組鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)性能

從表1可見(jiàn)：與冰鮮雜魚組相比，配合飼料組鈍吻黃蓋蝶增重率、特定生長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05)，肥滿度變化不大(P>0.05)；混合投喂組魚體的增重率、特定生長(zhǎng)率及肥滿度等指標(biāo)均高于配合飼料組，但低于冰鮮雜魚組(P>0.05)；以濕物質(zhì)為基礎(chǔ)的飼料系數(shù)表現(xiàn)為冰鮮雜魚組顯著高于配合飼料組(P<0.05)，而以干物質(zhì)為基礎(chǔ)的飼料系數(shù)則表現(xiàn)為配合飼料組顯著高于冰鮮雜魚組(P<0.05)。

表1 各組鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)性能Tab.1 Growth of Pleuronectes yokohama in each group

2.2 不同飼料組鈍吻黃蓋鰈的腸道結(jié)構(gòu)

鈍吻黃蓋鰈腸道黏膜形態(tài)如圖1所示，不同飼料影響了鈍吻黃蓋鰈腸道組織形態(tài)，冰鮮雜魚組絨毛相對(duì)致密且高度較高，排列整齊，配合飼料組及混合投喂組的絨毛稀疏且高度較低。

圖1 鈍吻黃蓋鰈后腸黏膜形態(tài)Fig.1 Mucosal morphology in distal intestine of Pleuronectes yokohama

從表2可見(jiàn)，冰鮮雜魚組鈍吻黃蓋鰈腸道的絨毛長(zhǎng)度和基層厚度顯著高于配合飼料組和混合投喂組(P<0.05)，配合飼料組最低；3組間絨毛寬度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表2 各組腸道黏膜形態(tài)參數(shù)Tab.2 Morphological parameters of intestinal mucosa in each group μm

2.3 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的多樣性

對(duì)MiSeg測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理后，3組樣品共產(chǎn)生157 646條優(yōu)化序列，有效序列數(shù)為49 331～56 251條。從圖2可見(jiàn)，3組鈍吻黃蓋鰈腸道樣品產(chǎn)生的OTUs數(shù)目為429～483個(gè)，3組共有OTUs為107個(gè)，CF、MF和FF組特有OTUs分別為234、225和269個(gè)。

圖2 各組腸道微生物分類Venn圖Fig.2 Venn diagram of intestinal microbiome in each group

對(duì)3組鈍吻黃蓋鰈的Alpha多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示，3組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的Chao1和ACE指數(shù)依次為FF組>CF組>MF組，說(shuō)明冰鮮雜魚組魚腸道菌群的物種豐富度最高，混合投喂組物種豐富度最低；混合投喂組魚腸道菌群的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說(shuō)明其多樣性較低，其余2組腸道菌群多樣性基本相似。

表3 各組腸道菌群多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index of intestinal flora in each group

2.4 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成

在門水平上，鈍吻黃蓋鰈腸道微生物中豐度排列前10的菌群如圖3所示，冰鮮雜魚和配合飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度影響不同，3組魚腸道主要菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)等，隨飼料中冰鮮雜魚比例的增高，鈍吻黃蓋鰈腸道菌群中變形菌門相對(duì)豐度增大，而厚壁菌門相對(duì)豐度則降低。

圖3 鈍吻黃蓋鰈腸道門水平上的物種相對(duì)豐度Fig.3 Bacterial communities in intestinal flora of Pleuronectes yokohama at the phylum level

在屬水平上，鈍吻黃蓋鰈腸道菌群中相對(duì)豐度較高的10個(gè)主要菌群如表4所示，3組魚腸道的優(yōu)勢(shì)菌群均為微桿菌屬(Microbacterium)，其中，配合飼料組的次優(yōu)勢(shì)菌群為巨型球菌屬(Macrococcus)和異常球菌屬(Deinococcus)，混合投喂組的次優(yōu)勢(shì)菌群為巨型球菌屬(Macrococcus)和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)，冰鮮雜魚組的次優(yōu)勢(shì)菌群為紅桿菌科未分類菌群unclassified_Rhodobacteraceae和巨型球菌屬(Macrococcus)。

表4 各組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群優(yōu)勢(shì)度最高的10個(gè)屬Tab.4 Top ten genera of bacterial communities in intestinal flora of Pleuronectes yokohama in each group

3 討論

3.1 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)的影響

集約化養(yǎng)殖魚類的營(yíng)養(yǎng)取決于飼料，飼料的質(zhì)量決定了養(yǎng)殖魚類的生長(zhǎng)發(fā)育情況。本研究中，冰鮮雜魚組鈍吻黃蓋鰈的特定生長(zhǎng)率分別比配合飼料組和混合投喂組提高了29.66%和14.18%，說(shuō)明冰鮮雜魚更能促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)，這與佟偉等[13]對(duì)大菱鲆、叢林梅等[14]對(duì)珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)、牛行健等[7]對(duì)斜帶石斑魚及朱擇敏等[15]對(duì)大口黑鱸的研究結(jié)果一致。人工配合飼料雖營(yíng)養(yǎng)豐富，但與天然餌料在營(yíng)養(yǎng)成分、適口性等方面仍存在較大差異。本研究中，鈍吻黃蓋鰈對(duì)人工配合飼料還未形成很好的適應(yīng)性，因而影響了養(yǎng)殖魚體的生長(zhǎng)速度。就飼料系數(shù)而言，雖然冰鮮雜魚組的濕物質(zhì)飼料系數(shù)比配合飼料組增加了2倍，但因冰鮮雜魚水分含量較高，通過(guò)計(jì)算干物質(zhì)量飼料系數(shù)發(fā)現(xiàn)，冰鮮雜魚組的干物質(zhì)量飼料系數(shù)比配合飼料組更低，加之冰鮮雜魚的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，配合飼料還應(yīng)進(jìn)一步改善質(zhì)量以提升其飼料利用率，增加市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。

3.2 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道結(jié)構(gòu)的影響

魚類腸道健康與腸道絨毛形態(tài)密切相關(guān)，絨毛的長(zhǎng)度和寬度影響著腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[16]。腸道基層厚度影響腸道穩(wěn)固性，對(duì)魚體健康極為重要。本研究中，攝食配合飼料的鈍吻黃蓋鰈腸道絨毛長(zhǎng)度顯著低于冰鮮雜魚組，結(jié)合生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，配合飼料組的鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)較慢，這可能是配合飼料適口性差、誘食作用弱等原因，導(dǎo)致鈍吻黃蓋鰈腸道形態(tài)發(fā)育不如冰鮮雜魚組好，從而影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響了魚的生長(zhǎng)。

3.3 不同飼料對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性的影響

魚類腸道中微生物與宿主在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，直接或間接地影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、代謝免疫等功能[17]。魚類腸道菌群組成與其攝食的飼料也有關(guān)[18]。本研究中，配合飼料降低了鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的多樣性，結(jié)合配合飼料高溫高壓的生產(chǎn)加工方式，這可能與配合飼料中的微生物多樣性較低有關(guān)。

本研究中，3組鈍吻黃蓋鰈腸道的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門，第二位是放線菌門，第三位是厚壁菌門。變形菌門是細(xì)菌中最大的門，許多病原菌均位列其中，可導(dǎo)致生物功能失調(diào)，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)[19]。冰鮮雜魚組變形菌門豐度最高，這可能與冰鮮雜魚攜帶的微生物數(shù)量高于配合飼料有關(guān)。放線菌門是水生生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的細(xì)菌門，是抗生素的主要生產(chǎn)菌，其中許多種類屬于潛在的益生菌[20]。厚壁菌門中存在許多能夠促進(jìn)碳水化合物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，有助于提高宿主對(duì)飼料的消化能力[21]。研究表明，擬桿菌門與厚壁菌門豐度的比值影響?zhàn)B殖魚類的生長(zhǎng)速度[9]。本研究中，配合飼料組擬桿菌門與厚壁菌門豐度的比值最低，鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)速度也最慢，這與郁二蒙等[9]對(duì)攝食不同飼料的大口黑鱸腸道菌群的研究結(jié)果一致。推測(cè)攝食配合飼料的鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)較慢，可能與其腸道中擬桿菌門與厚壁菌門豐度的比值下降有關(guān)。

研究表明，紅桿菌科中的大多數(shù)成員具有合成維生素B12的路徑，而維生素B12可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[22]。紅桿菌科中的魯杰氏菌(Ruegeriamobilis)對(duì)致病菌有抑制作用，具有開(kāi)發(fā)成為益生菌的潛能[23]。本研究中，在屬水平上對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，冰鮮雜魚組未分類的紅桿菌科豐度顯著高于配合飼料組和混合投喂組。由此可見(jiàn)，投喂冰鮮雜魚相對(duì)提高了鈍吻黃蓋鰈腸道有益菌的含量，這也為鈍吻黃蓋鰈腸道微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

1)通過(guò)分析投喂配合飼料和冰鮮雜魚在鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)和腸道菌群方面的差異，發(fā)現(xiàn)冰鮮雜魚更能促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)及腸道健康。

2)配合飼料組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性減少，可能與人工配合飼料的營(yíng)養(yǎng)成分無(wú)法滿足魚體及其腸道內(nèi)土著細(xì)菌的生長(zhǎng)需求有關(guān)。因此，在養(yǎng)殖過(guò)程中可在配合飼料中添加有利于鈍吻黃蓋鰈腸道健康的益生菌，以促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈的健康生長(zhǎng)。