于愛清，施永海，徐嘉波

(上海市水產(chǎn)研究所 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 200433)

刀鱭(Coilianasus)隸屬于鯡形目(Clupeiformes)鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)，在中國(guó)的渤海、黃海、東海海域及其通海的江河中均能發(fā)現(xiàn)其蹤跡，其中以長(zhǎng)江下游的捕獲量最高。長(zhǎng)江刀鱭魚體豐腴肥滿，肉鮮味美，曾與鰣、河豚并稱為“長(zhǎng)江三鮮”[1]。近年來(lái)，由于棲息地生存環(huán)境受到污染、惡化，以及酷漁濫捕、沿岸工程建設(shè)等人類活動(dòng)的影響，野生長(zhǎng)江刀鱭數(shù)量急劇下降，甚至不能形成優(yōu)勢(shì)種群[1-4]，亟須對(duì)其自然種質(zhì)資源進(jìn)行有效保護(hù)、開發(fā)和利用。自2019年2月1日開始，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部就已停止發(fā)放長(zhǎng)江刀鱭專項(xiàng)捕撈許可證，禁止對(duì)其自然資源進(jìn)行生產(chǎn)性捕撈，次年又開始實(shí)施長(zhǎng)江“十年禁漁”政策。同期長(zhǎng)江刀鱭全人工繁育技術(shù)和苗種規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)亦獲得了突破性進(jìn)展，這些舉措不僅促進(jìn)了長(zhǎng)江刀鱭產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的發(fā)展，而且有效地緩解了長(zhǎng)江刀鱭野生種質(zhì)資源銳減的狀況。

分子標(biāo)記不僅可以探究整個(gè)動(dòng)物基因組的遺傳變異，且遺傳相對(duì)穩(wěn)定，常用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的群體遺傳分析和分子育種研究，其中，微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)的應(yīng)用最為廣泛[5]。微衛(wèi)星標(biāo)記，亦稱短鏈重復(fù)序列(short tandem repeats，STRs)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，是在真核生物基因組中均勻分布的、由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成的序列，這些序列的重復(fù)次數(shù)和重復(fù)單位在不同個(gè)體間呈現(xiàn)高度變異性和多態(tài)性，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的群體遺傳分析、種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助良種選育及構(gòu)建遺傳圖譜等方面[5-7]。近年來(lái)，研究人員利用線粒體基因D-loop[8]、RAPD[9]和AFLP[10]等不同類型的分子標(biāo)記，開展了長(zhǎng)江刀鱭不同群體的遺傳變異研究，這些類型的標(biāo)記試驗(yàn)成本較高、操作復(fù)雜且數(shù)量相對(duì)較少，而微衛(wèi)星標(biāo)記則操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低且數(shù)量多，但對(duì)長(zhǎng)江刀鱭SSR開發(fā)利用的報(bào)道較少。Ma等[11]基于FIASO法，從微衛(wèi)星富集文庫(kù)開發(fā)鑒定到12對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記，用于長(zhǎng)江刀鱭和鳳鱭的遺傳分析。Chen等[12]基于磁珠富集法，從微衛(wèi)星富集文庫(kù)開發(fā)鑒定到34對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記，用于長(zhǎng)江刀鱭及其近緣物種的通用性研究。Rong等[13]基于FIASO法，從微衛(wèi)星富集文庫(kù)開發(fā)鑒定到20對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，用于長(zhǎng)江刀鱭的群體遺傳研究?；诖胖楦患虵IASO等方法，雖然從水產(chǎn)動(dòng)物基因組規(guī)模化開發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性較高，但成本相對(duì)較高且費(fèi)時(shí)、低效，已不能滿足長(zhǎng)江刀鱭群體遺傳分析及分子標(biāo)記輔助良種選育對(duì)SSR的需求，亟待大規(guī)模挖掘開發(fā)[5]。

與傳統(tǒng)的基因組SSR(genomic SSR，G-SSR)開發(fā)技術(shù)相比，基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)所開發(fā)的SSR，則被定義為表達(dá)序列標(biāo)簽-SSR(expressed sequence tag SSR，EST-SSR)，雖然標(biāo)記多態(tài)性相對(duì)G-SSR較低，但由于其數(shù)量豐富、開發(fā)成本低和開發(fā)周期短，且常常與相關(guān)性狀的功能基因關(guān)聯(lián)[5，14]，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物多態(tài)性EST-SSRs的規(guī)?；_發(fā)與應(yīng)用。近年來(lái)，陸續(xù)出現(xiàn)的海量高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，亦為水產(chǎn)動(dòng)物微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)提供了便利條件，同時(shí)，一大批針對(duì)高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘EST-SSRs的軟件，如MISA(MIcroSAtellite Identification Tool)[15]、Candi-SSR[16]、SSRMMD(Simple Sequence Repeat Molecular Marker Developer)[17]等多態(tài)性SSR位點(diǎn)篩選軟件陸續(xù)被開發(fā)出來(lái)，極大地加快了水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物多態(tài)性EST-SSRs的開發(fā)和利用研究進(jìn)程。

本研究中，基于長(zhǎng)江刀鱭雌、雄個(gè)體的腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用MISA軟件深入挖掘長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組Unigenes中的EST-SSRs，采用SSRMMD軟件規(guī)模化地開發(fā)多態(tài)性EST-SSRs，并利用篩選獲得的18個(gè)多態(tài)性較好的EST-SSRs，評(píng)估了3個(gè)長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，以期為長(zhǎng)江刀鱭的群體遺傳分析、分子標(biāo)記規(guī)?；_發(fā)與利用及分子標(biāo)記輔助良種選育提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的12尾2齡長(zhǎng)江刀鱭(雌、雄各6尾)，取自上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地2018年的繁育群體；用于EST-SSRs多態(tài)性分析和有效性驗(yàn)證的長(zhǎng)江刀鱭，分別取自該基地2018、2019和2020 年獲得的繁育子代，每年各取24尾，分別記為2018、2019、2020養(yǎng)殖群體。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 利用Illumina轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒分別構(gòu)建長(zhǎng)江刀鱭雌、雄個(gè)體腦組織的轉(zhuǎn)錄組cDNA測(cè)序文庫(kù)，并基于Illumina HisSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)采用SeqPrep和Sickle軟件進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾處理，獲得質(zhì)量較高的純凈數(shù)據(jù)(Clean Reads)；采用Trinity軟件對(duì)所獲得的Clean Reads進(jìn)行從頭組裝和去冗余后，獲得高質(zhì)量的雌性腦轉(zhuǎn)錄組Unigenes(以下簡(jiǎn)稱“CEF.fa”)和雄性腦轉(zhuǎn)錄組Unigenes(以下簡(jiǎn)稱“CEM.fa”)。

1.2.2 長(zhǎng)江刀鱭EST-SSRs的識(shí)別和特征分析 在Linux操作系統(tǒng)下，利用MISA軟件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa /misa.html)分別掃描和檢索CEF.fa和CEM.fa中的EST-SSRs。單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基序的最少重復(fù)次數(shù)分別設(shè)置為10、6、5、5、5和5次，經(jīng)篩選和計(jì)算后，統(tǒng)計(jì)雌性和雄性刀鱭轉(zhuǎn)錄組中這6類核苷酸重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)及各重復(fù)類型的比例；復(fù)合型EST-SSRs兩個(gè)位點(diǎn)間最大間隔堿基數(shù)設(shè)置為100。

1.2.3 長(zhǎng)江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的快速識(shí)別和檢測(cè) 在Linux操作系統(tǒng)下，采用SSRMMD軟件檢索CEF.fa和CEM.fa中完美的EST-SSRs位點(diǎn)和候選的多態(tài)性EST-SSRs。軟件運(yùn)行參數(shù)如下：perl SSRMMD.pl -f1 CEFM/CEF.fa -f2 CEFM/CEM.fa -p1 -me NW -st 0 -t 2；從篩選出的多態(tài)性EST-SSRs中隨機(jī)選取20條序列，并結(jié)合長(zhǎng)江刀鱭參考基因組序列和EST-SSRs兩側(cè)保守側(cè)翼序列的保守性特征，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)、篩選出評(píng)分較高的EST-SSRs PCR擴(kuò)增引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成與純化，用于后續(xù)EST-SSRs有效性和多態(tài)性的檢測(cè)。

從不同年份養(yǎng)殖長(zhǎng)江刀鱭的每個(gè)樣本，分別剪取鰭條組織約5 mg，用滅菌雙蒸水清洗，剪碎后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)[天根生化科技(北京)有限公司)]，提取每個(gè)樣本的基因組DNA；用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA質(zhì)量，利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量濃度后，將符合要求的DNA樣品稀釋到50 ng/μL，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

隨機(jī)選取10個(gè)DNA樣本等量混合成PCR擴(kuò)增的模板，在Eppendorf Mastercycler X50s梯度PCR儀(ABI，美國(guó))上篩選各引物的最適退火溫度。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：模板DNA 1 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL，2×Taq PCR MasterMix(天根生化，KT201)5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性 0.5 min，48～68 ℃下退火0.5 min，72 ℃下延伸0.5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照、保存，確定各EST-SSRs引物的最佳退火溫度和有效性。

1.2.4 長(zhǎng)江刀鱭不同年份養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評(píng)估 以2018、2019和2020年的3個(gè)長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體共72個(gè)DNA樣本為試驗(yàn)材料，利用篩選獲得的18對(duì)多態(tài)性EST-SSRs引物(表1)，在Eppendorf Mastercycler X50s梯度PCR儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照引物最佳退火溫度的篩選過(guò)程，在各引物的最佳退火溫度(表1)下獲取PCR產(chǎn)物。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過(guò)銀染法進(jìn)行顯色定影，利用數(shù)碼相機(jī)對(duì)顯色清晰的條帶拍照保存，用于后續(xù)長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳差異分析。

表1 長(zhǎng)江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs引物信息和參數(shù)Tab.1 Primer sequences and parameters of polymorphic EST-SSRs in Coilia nasus

1.2.5 遺傳多樣性參數(shù)的計(jì)算與分析 采用GenAlEx 6.0軟件計(jì)算長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳相似度、遺傳距離和遺傳分化指數(shù)(FST)等遺傳多樣性參數(shù)，并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)；采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建不同群體間的UPGMA聚類分析樹。

基于Botstein等[18]的公式，計(jì)算長(zhǎng)江刀鱭不同群體和位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)：

其中：CPI為多態(tài)信息含量；pi、pj分別為群體中第i、j個(gè)等位基因的頻率；N為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組序列特征

從雌性長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組中共獲得49.69 Gbp Clean Data，6個(gè)樣品的Clean Data均達(dá)到了 7.79 Gbp以上，Q30堿基百分比在95.11%以上，表明測(cè)序結(jié)果良好；經(jīng)Trinity軟件組裝和優(yōu)化后，共獲得N50為1 488 bp的Unigenes 143 374個(gè)(表2)。

從雄性長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組中共獲得50.15 Gbp Clean Data，6個(gè)樣品的Clean Data均達(dá)到了8.19 Gbp以上，Q30堿基百分比在95.30%以上，表明測(cè)序結(jié)果良好；經(jīng)Trinity軟件組裝和優(yōu)化后，獲得N50為1 569 bp的Unigenes 135 215個(gè)(表2)。

表2 雌、雄長(zhǎng)江刀鱭個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組序列信息Tab.2 Sequence characteristics of the brain transcriptome in the female and male Coilia nasus

2.2 長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄中EST-SSRs特征分析

雌性長(zhǎng)江刀鱭143 374條Unigenes中總共獲得95 905個(gè)EST-SSRs，其中，33.99%的Unigenes包含EST-SSRs，11.30%的Unigenes含有1個(gè)以上的EST-SSRs，平均每隔1 688 bp有一個(gè)EST-SSR；雄性長(zhǎng)江刀鱭135 215條Unigenes中共獲得88 774個(gè)EST-SSRs，其中，33.17%的Unigenes包含EST-SSRs，11.03%的Unigenes含有1個(gè)以上的EST-SSRs，平均每隔1 740 bp有一個(gè)EST-SSR(表3)。

表3 雌、雄長(zhǎng)江刀鱭個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs搜索結(jié)果Tab.3 EST-SSRs search results in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

長(zhǎng)江刀鱭雌、雄個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs具有相似的類型特征，從單核苷酸重復(fù)EST-SSRs到六核苷酸重復(fù)EST-SSRs均有分布，且具有不同程度的數(shù)量分布差異，均以二核苷酸重復(fù)EST-SSRs數(shù)量最多，單核苷酸重復(fù)EST-SSRs數(shù)量次之，三核苷酸重復(fù)EST-SSRs的數(shù)量亦較為豐富，四核苷酸重復(fù)EST-SSRs的數(shù)量相對(duì)較少，五核苷酸和六核苷酸重復(fù)EST-SSRs的數(shù)量最少(表4)。

表4 雌、雄長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組主要EST-SSRs重復(fù)基序的數(shù)量Tab.4 Number of main repeat motif of EST-SSRs in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

長(zhǎng)江刀鱭雌、雄個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs主要優(yōu)勢(shì)核苷酸重復(fù)基序亦有相似的數(shù)量分布特征，其中，單核苷酸重復(fù)EST-SSRs的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序均為A/T，二核苷酸均為AC/GT，三核苷酸均為AGG/CCT，四核苷酸均為ACAG/CTGT(表5)。

表5 雌、雄長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs主要重復(fù)基序的類型和數(shù)量Tab.5 Type and number of main repeat motif of EST-SSRs in the brain transcriptome of female and male Coilia nasus

2.3 長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性EST-SSRs特征分析

基于SSRMMD軟件的搜索結(jié)果顯示，從長(zhǎng)江刀鱭雌、雄腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs序列中篩選獲得了5 675 條雌、雄個(gè)體共有的EST-SSRs，并從中鑒定出1 082 個(gè)多態(tài)性EST-SSRs。從圖1可見，多態(tài)性EST-SSRs的數(shù)量隨著堿基重復(fù)基序類型次數(shù)的增加而逐級(jí)減少，表明長(zhǎng)江刀鱭轉(zhuǎn)錄組中多態(tài)性EST-SSRs的類型極為豐富，從單核苷酸到六核苷酸均有分布，且主要以單核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)為主，這兩類EST-SSRs的數(shù)量約占88.5%，多堿基重復(fù)基序的EST-SSRs相對(duì)保守，不易累積遺傳變異，獲得的多態(tài)性位點(diǎn)相對(duì)較少。

圖1 長(zhǎng)江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的類型和數(shù)量特征Fig.1 Type and quantities characteristics of polymorphic EST-SSRs in Coilia nasus

2.4 多態(tài)性EST-SSRs的有效性和多態(tài)性驗(yàn)證

以上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地隨機(jī)選取的2018、2019和2020群體72尾養(yǎng)殖長(zhǎng)江刀鱭的基因組DNA為模板，利用20對(duì)EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)顯示，除1對(duì)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物外，其余19對(duì)EST-SSRs引物擴(kuò)增得到預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為95%。用10%非變性聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)顯示，有18對(duì)EST-SSRs引物具有較好的多態(tài)性，占有效擴(kuò)增引物的94.7%(引物信息見表1)，部分多態(tài)性EST-SSRs引物(EST-SSR02、EST-SSR04、EST-SSR08和EST-SSR09)在24個(gè)試驗(yàn)樣本(2018群體)的PCR擴(kuò)增電泳圖譜見圖2。

M—DNA marker(pBR322/MspI)；1～24—24個(gè)長(zhǎng)江刀鱭樣品(2018群體)。M—represents the DNA marker (pBR322/MspI)；1-24—denote the 24 samples of Coilia nasus in 2018 population.圖2 長(zhǎng)江刀鱭部分EST-SSRs引物的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic map of PCR products with partial EST-SSRs primers of Coilia nasus

2.5 長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江刀鱭2018、2019、2020養(yǎng)殖群體的平均觀測(cè)雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.445 2、0.485 4和0.420 9，表明3個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性較為豐富，但伴隨著繁育年份的增加，3個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)呈現(xiàn)逐年降低的趨勢(shì)，特別是2020養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性降低幅度相對(duì)較大(表6)。哈迪-溫伯格平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，2018、2019、2020養(yǎng)殖群體中分別有4、6、7個(gè)位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)，表明人工選擇壓力已經(jīng)對(duì)長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同程度的影響(表7)。

表6 長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.6 Genetic variation parameter of different cultured populations of Coilia nasus

表7 長(zhǎng)江刀鱭不同EST-SSRs的遺傳多樣性參數(shù)Tab.7 Genetic variation parameter of different EST-SSRs loci in Coilia nasus

遺傳距離和遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江刀鱭2018養(yǎng)殖群體與2020養(yǎng)殖群體的遺傳距離最大(0.148 7)，遺傳相似性最低(0.861 8)；2018養(yǎng)殖群體與2019養(yǎng)殖群體的遺傳距離最小(0.104 7)，遺傳相似性最高(0.900 6)(表8)?；贜ei’s遺傳距離構(gòu)建的長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的UPGMA聚類分析顯示，長(zhǎng)江刀鱭2018養(yǎng)殖群體先與2019養(yǎng)殖群體聚為一支，然后再與2020養(yǎng)殖群體聚為一支(圖3)。

表8 長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體的遺傳相似系數(shù)(對(duì)角線下)和遺傳距離(對(duì)角線上)Tab.8 Genetic similarity index (below diagonal)and genetic distance (above diagonal)of selected populations in Coilia nasus

圖3 不同養(yǎng)殖群體間的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA analysis among different cultured populations

遺傳分化指數(shù)分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)江刀鱭2018、2019、2020養(yǎng)殖群體間存在不同程度的遺傳分化，兩兩群體間均處于中等程度的遺傳分化(0.05

表9 長(zhǎng)江刀鱭兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)Tab.9 Index of genetic differentiation between selected populations in Coilia nasus

表10 長(zhǎng)江刀鱭不同養(yǎng)殖群體間的AMOVA分子方差分析Tab.10 AMOVA analysis of selected populations in Coilia nasus

3 討論

DNA分子因復(fù)制、缺失、滑移或錯(cuò)配及姐妹染色單體的不均等交換等原因而具有高度變異性[5]，故微衛(wèi)星分子標(biāo)記在水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親子鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀定位和分子標(biāo)記輔助育種[19-20]等相關(guān)研究。對(duì)于具有參考基因組信息的物種而言，微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)相對(duì)方便，而對(duì)于目前還無(wú)參考基因組信息的物種，則可利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)大規(guī)模開發(fā)EST-SSRs，以深入開展相關(guān)物種基因的等位基因變異、重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的挖掘和精細(xì)定位研究。長(zhǎng)江刀鱭作為中國(guó)具有較高經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)和養(yǎng)殖價(jià)值的江海洄游性魚類，其可用于分子標(biāo)記的資源相對(duì)匱乏，鑒于全基因組測(cè)序的成本相對(duì)較高，因此，亟需開展長(zhǎng)江刀鱭的轉(zhuǎn)錄學(xué)研究以獲得大量的可用分子標(biāo)記。

3.1 長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組EST-SSRs特征分析

本研究中，基于長(zhǎng)江刀鱭雌、雄個(gè)體的腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法挖掘其腦轉(zhuǎn)錄組中的EST-SSRs，結(jié)果在雌、雄長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組中分別獲得了95 905條和88 774條EST-SSRs，這些EST-SSRs的種類較為豐富，且6類核苷酸重復(fù)基序均有不同程度的數(shù)量分布差異，均以二核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹?63.87%和62.60%)，其次是單核苷酸重復(fù)基序(22.94%和23.67%)，三核苷酸重復(fù)基序亦較為豐富(9.34%和9.93%)，其他類型的核苷酸重復(fù)基序相對(duì)較少。研究表明，多數(shù)水產(chǎn)物種EST-SSRs中的重復(fù)基序均以二核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹鱗21]，本研究中亦獲得了與此相一致的結(jié)果；而其余類型的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序則有較大的差異，這可能與不同物種轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建的組織來(lái)源、不同物種的種間特異性、位點(diǎn)突變頻率及選擇性進(jìn)化機(jī)制有關(guān)[5]。本研究中，不同重復(fù)基序的堿基優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型表現(xiàn)出不同程度的偏倚性，單核苷酸重復(fù)基序以A/T類型為主，可能是由于富含A/T的微衛(wèi)星退火溫度相對(duì)較低，有利于雙鏈DNA的解鏈，通過(guò)DNA復(fù)制的重組和滑動(dòng)機(jī)制而增加A/T重復(fù)基序的概率[5，21]；二核苷酸重復(fù)基序以AC/GT為主，這與魚類基因組微衛(wèi)星中以AC/GT重復(fù)為主相符；其余重復(fù)基序的優(yōu)勢(shì)重復(fù)堿基類型在不同物種間差異較大，可能與不同物種的種間差異性有關(guān)。

3.2 水產(chǎn)動(dòng)物多態(tài)性EST-SSRs的開發(fā)

近年來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖物種中成功鑒定到多態(tài)性較好的EST-SSRs。蔡磊等[22]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)肝臟轉(zhuǎn)錄組中獲得了6 225個(gè)EST-SSRs，并從76對(duì)引物中篩選獲得了32對(duì)多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為42.10%。龔詩(shī)琦等[23]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從黃姑魚(Nibeaalbiflora)轉(zhuǎn)錄組中獲得了12 254個(gè)EST-SSRs，并從80對(duì)引物中篩選獲得了18個(gè)多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為22.5%。岳華梅等[24]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從興國(guó)紅鯉(Cyprinuscarpio)的垂體和性腺轉(zhuǎn)錄組中獲得了13 652個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，并從30對(duì)引物中篩選獲得了9個(gè)多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為30%。本研究中，從20對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選獲得了18對(duì)多態(tài)性較好的EST-SSRs，多態(tài)率為90%，引物多態(tài)率顯著高于其他魚類的研究結(jié)果，本課題組前期從長(zhǎng)江刀鱭肌肉和肝臟轉(zhuǎn)錄組中隨機(jī)篩選的EST-SSRs，多態(tài)率僅為16%，而轉(zhuǎn)錄組中通常具有數(shù)萬(wàn)個(gè)EST-SSRs，如果利用傳統(tǒng)方法將多態(tài)性的位點(diǎn)全部篩選出來(lái)，往往需要花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力。本研究中所使用的方法效果較好，特別是針對(duì)基因組信息比較匱乏的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物較為實(shí)用，不僅能夠借助相關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物研究中已公開發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，且隨著高通量測(cè)序成本的降低，建立轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)的成本也相對(duì)低廉，因此，能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速獲得多態(tài)性較好的EST-SSRs，用于相關(guān)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種的種質(zhì)資源評(píng)估。

3.3 刀鱭養(yǎng)殖群體與野生群體遺傳多樣性比較

群體遺傳多樣性是評(píng)估水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源現(xiàn)狀的重要理論依據(jù)，亦是水產(chǎn)動(dòng)物在分子水平上開展遺傳改良的重要遺傳基礎(chǔ)。遺傳多樣性越高，適應(yīng)能力越強(qiáng)，遺傳改良的潛力越大，而觀測(cè)雜合度和期望雜合度則是評(píng)估水產(chǎn)動(dòng)物不同群體遺傳多樣性高低的重要參考指標(biāo)[11]?；谖⑿l(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，一些學(xué)者陸續(xù)對(duì)不同水域刀鱭的野生群體開展了遺傳多樣性研究。Ma等[11]利用12對(duì)基因組SSR引物，對(duì)30尾長(zhǎng)江水域(武漢)野生長(zhǎng)江刀鱭的遺傳多樣性評(píng)估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.675和0.650；Chen等[12]利用34對(duì)基因組SSR引物，對(duì)30尾鴨綠江水域(丹東)野生刀鱭的遺傳多樣性評(píng)估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.53和0.77；Rong等[13]利用20對(duì)基因組SSR引物，對(duì)60尾黃河流域野生刀鱭的遺傳多樣性評(píng)估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.49和0.68；Xuan等[25]利用11對(duì)基因組SSR引物，對(duì)31尾長(zhǎng)江江口野生刀鱭的遺傳多樣性評(píng)估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.807 4和0.854 2；本課題組前期利用12對(duì)基因組SSR引物，對(duì)30尾靖江水域野生長(zhǎng)江刀鱭的遺傳多樣性評(píng)估顯示，該群體的平均Ho和He分別為0.516 7和0.738 1[26]。以上結(jié)果表明，中國(guó)不同水域刀鱭野生群體的遺傳多樣性差異較大，而刀鱭養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的報(bào)道相對(duì)較少。本課題組前期利用12對(duì)G-SSR引物，評(píng)估了長(zhǎng)江刀鱭選育世代(F1～F3)的遺傳多樣性，F(xiàn)1群體的平均Ho和He分別為0.480 6和0.711 2、F2群體為0.444和0.693 3，F(xiàn)3群體為0.400 0和0.684 4；之后又利用16對(duì)四核苷酸重復(fù)的EST-SSRs引物，評(píng)估了長(zhǎng)江刀鱭選育世代F3的遺傳多樣性，獲得其平均Ho和He分別為0.341 4和0.397 7。本研究中，2019養(yǎng)殖群體樣本為前期研究中選育世代F3的繁育子代(即F4)，其平均Ho和He分別為0.451 4和0.498 3，均低于其他野生刀鱭群體的遺傳多樣性。究其原因，一方面是由于本研究中主要是針對(duì)所開發(fā)的EST-SSRs進(jìn)行多態(tài)性和有效性的初步驗(yàn)證，所選用的試驗(yàn)樣本相對(duì)較少，且EST-SSRs相對(duì)于基因組SSR更加保守，多態(tài)性相對(duì)較低；另一方面是由于試驗(yàn)群體經(jīng)過(guò)數(shù)年的人工養(yǎng)殖，已經(jīng)受到了較大的人工選擇壓力，有效繁育群體的數(shù)量亦遠(yuǎn)小于野生群體，因此，養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性相對(duì)于野生群體有所降低。

4 結(jié)論

1)利用MISA軟件分別從雌、雄長(zhǎng)江刀鱭腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中成功鑒定到95 905個(gè)和88 774個(gè)EST-SSRs，利用SSRMMD軟件成功鑒定到1 082個(gè)多態(tài)性EST-SSRs；隨機(jī)選取20個(gè)EST-SSRs進(jìn)行有效性和多態(tài)性驗(yàn)證，獲得了18個(gè)多態(tài)性較好的EST-SSRs，表明本研究中所用方法能夠顯著提高養(yǎng)殖長(zhǎng)江刀鱭多態(tài)性EST-SSRs的檢出效率。

2)基于18個(gè)多態(tài)性EST-SSRs評(píng)估不同年份長(zhǎng)江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源現(xiàn)狀，結(jié)果顯示，隨著繁育年份的增加，3個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)呈逐年降低的趨勢(shì)，暗示在長(zhǎng)江刀鱭后續(xù)生產(chǎn)繁育過(guò)程中，在增加有效繁育親本數(shù)量的同時(shí)，應(yīng)挑選親緣關(guān)系和遺傳分化適宜的繁育親本，以保證繁育后代仍然具有豐富的遺傳多樣性。本研究結(jié)果不僅豐富了長(zhǎng)江刀鱭分子標(biāo)記的數(shù)量，而且對(duì)于長(zhǎng)江刀鱭后續(xù)選育群體的育種效果評(píng)估、分子標(biāo)記輔助育種實(shí)踐及通用性長(zhǎng)江刀鱭微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。