付馨余 梅 希 李君艾 劉 暢

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是眼科常見的慢性眼病之一,是世界范圍內(nèi)工作年齡人群最主要的致盲疾病[1]。DR以視網(wǎng)膜早期缺血缺氧,后期引起病理性新生血管形成為主要特點(diǎn),病程長(zhǎng),分期多,發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明,目前認(rèn)為DR不僅是一種微血管病變,也牽涉到慢性炎癥及神經(jīng)免疫等諸多方面[2]。DR分為增生型DR(PDR)和非增生型DR(NPDR),PDR可形成大量病理性新生血管及纖維增生膜,進(jìn)而引起玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離、新生血管性青光眼等一系列并發(fā)癥。有效控制DR的發(fā)展,阻止病理性新生血管形成是目前研究DR機(jī)制迫在眉睫的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。Takahashi等[3]研究表明,組織缺血狀態(tài)下可激發(fā)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs),參與角膜新生血管的生成;Toshinori等[4]研究表明,誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管大鼠外周血中的EPCs明顯增高,這提示我們EPCs可能在眼部新生血管相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在血管內(nèi)皮細(xì)胞及EPCs、膠質(zhì)細(xì)胞等均可低表達(dá)。既往研究表明,DR小鼠VEGF含量為對(duì)照組的4～10倍[5],這提示我們VEGF在PDR中發(fā)揮了作用。既往有研究報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)能控制血管內(nèi)皮細(xì)胞異常遷移和增生,是血管內(nèi)皮生成機(jī)制中的重要因子[6],為了探討EPCs在DR發(fā)生發(fā)展中的作用,尤其是在以病理性新生血管為特征的PDR中是否發(fā)揮作用,我們進(jìn)行了不同時(shí)期DR患者EPCs測(cè)定,同時(shí)研究了與EPCs密切相關(guān)的MMP-9及VEGF蛋白在PDR中的表達(dá)水平,以期探討PDR的可能發(fā)展機(jī)制,為阻止PDR發(fā)生發(fā)展以及治療手段提供新的思路及視角。

1 資料與方法

1.1 臨床資料前瞻性研究。選擇2020年1月至2021年12月在我院診斷為視網(wǎng)膜疾病不伴有糖尿病的患者35例(35眼)為空白對(duì)照組(A組);另選擇同期在我院內(nèi)分泌科診斷為II型糖尿病不伴有視網(wǎng)膜病變患者37例(37眼)為單純對(duì)照組(B組);選擇同期在我院診斷為DR的患者共78例(78眼),根據(jù)DR診斷標(biāo)準(zhǔn)分為NPDR 36例(C組)和PDR 42例(D組)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn):于我院診斷為單純性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體積血、特發(fā)性黃斑裂孔需行玻璃體切割手術(shù),均不伴有II型糖尿病者納入A組;根據(jù)2001年世界衛(wèi)生組織修改的糖尿病最新診斷標(biāo)準(zhǔn)及2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科分會(huì)制定的最新DR診斷及分期標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)臨床癥狀體征、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)、熒光素眼底血管造影(FFA)、OCT掃描等確診為II型糖尿病不伴有視網(wǎng)膜疾病者納入B組;II型糖尿病伴NPDR者納入C組;II型糖尿病伴PDR者納入D組。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):感染性疾病患者;既往有眼部手術(shù)史;有其他眼部疾病;合并全身重要器官疾病;精神或認(rèn)知障礙;妊娠及哺乳期女性;3個(gè)月內(nèi)服用過影響EPCs的藥物,如非甾體類、皮質(zhì)醇類等;半年內(nèi)曾行視網(wǎng)膜光凝術(shù)或玻璃體內(nèi)注藥抗VEGF治療。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過,患者及家屬均知情并簽署知情同意書,玻璃體切割術(shù)前所有患者均簽署手術(shù)同意書,并同意將玻璃體用于本次研究。

1.3 方法

1.3.1 收集血液標(biāo)本晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取四組患者肘靜脈血3 mL,加入乙二胺四乙酸抗凝劑充分搖勻,采用密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞[7]。具體操作如下:室溫下離心機(jī)(15 000 r·min-1)離心20 min分離細(xì)胞,吸取中間白膜層,PBS反復(fù)洗滌、吹打、混勻、再次室溫下重復(fù)離心,取100 μL分離洗滌好的核細(xì)胞,加入CD34-FITC和CD133-PE抗體,室溫下避光孵育20 min,再次PBS洗滌2次,加入5 g·L-1牛血清白蛋白(BSA)緩沖液混勻,室溫下離心(15 000 r·min-1)10 min,過濾后置于EP管中保存。

1.3.2 收集玻璃體標(biāo)本A組及D組患者于玻璃體切割手術(shù)中獲得玻璃體。手術(shù)方式相同,均為玻璃體切割術(shù),均使用同一臺(tái)玻璃體切割機(jī)器(美國愛爾康公司 Constellation Vision System 25G TSV),均由同一位眼科醫(yī)生操作。手術(shù)開始前放置灌注頭,關(guān)閉灌注開關(guān),使用1 mL注射器人工抽取玻璃體0.5 mL,12 000 r·min-1離心5 min,取上清液置于EP管中,-80 ℃冰箱保存。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 EPCs數(shù)量檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀(FCM,美國BD公司)檢測(cè)EPCs數(shù)量。根據(jù)前向角散射(FSC)/側(cè)向角散射(SSC)設(shè)置第1個(gè)細(xì)胞門,在散點(diǎn)圖中圈選單個(gè)核細(xì)胞區(qū)域,排除細(xì)胞碎片等;依據(jù)CD34-FITC/SSC設(shè)置第2個(gè)細(xì)胞門,圈定CD34陽性細(xì)胞群區(qū)域;依據(jù)CD34-FITC/CD133-FITC設(shè)置第3個(gè)細(xì)胞門,圈定兩者雙陽性區(qū)域?yàn)镋PCs,分析2×105個(gè)細(xì)胞,觀察并比較四組患者EPCs數(shù)量。

1.4.2 玻璃體內(nèi)MMP-9、VEGF的蛋白表達(dá)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè),按照MMP-9和VEGF試劑盒(RapidBio Lab 公司)說明書仔細(xì)操作。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD)值,使用專業(yè)軟件(Curve Expert1.3)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)MMP-9和VEGF的蛋白相對(duì)濃度(mg·L-1)。MMP-9和VEGF的蛋白濃度分別與各標(biāo)本的總蛋白濃度的比值即為MMP-9和VEGF的蛋白表達(dá)水平,為減少誤差,每份樣本均重復(fù)測(cè)量2次。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,四組患者間年齡、EPCs數(shù)量比較采用單因素方差分析,MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率(%)描述,組間比較采用卡方檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 四組患者EPCs數(shù)量比較四組患者EPCs數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。A組及D組患者EPCs數(shù)量均顯著高于B組、C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與A組相比,D組患者EPCs數(shù)量略有增加,但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);B組與C組患者EPCs數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 四組患者EPCs數(shù)量及玻璃體內(nèi)MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平

2.2 A組、D組患者玻璃體內(nèi)MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平D組患者玻璃體內(nèi)MMP-9的蛋白表達(dá)明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),D組患者玻璃體內(nèi)VEGF的蛋白表達(dá)明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

3 討論

Asahara等[8]于1997年從外周血中分離出表達(dá)CD34+表面標(biāo)記的單核細(xì)胞,在體外,這些細(xì)胞可以促進(jìn)缺血組織的血管再生,被稱之為EPCs,EPCs主要定位于骨髓及外周血,在某些條件影響下可將骨髓中的EPCs動(dòng)員遷移至外周血發(fā)揮相應(yīng)作用[9]。CD34+、CD133+和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)視為EPCs的特征性表面標(biāo)志[10-11],本研究以CD34和CD133為抗體標(biāo)記EPCs,獲得了良好的單核細(xì)胞群,這驗(yàn)證了密度梯度離心法具有可靠的效果。

DR是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,早期即發(fā)生全身微血管的缺血缺氧反應(yīng),既往研究證明在機(jī)體處于缺血、缺氧的環(huán)境中時(shí),EPCs可分泌VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)等激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路,通過釋放MMP-9來促進(jìn)EPCs的動(dòng)員、遷移[12]。Igato等[13]研究表明,糖尿病患者EPCs數(shù)量有明顯變化,同時(shí)EPCs與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,A組無糖尿病患者EPCs數(shù)量明顯較B組、C組高,提示單純糖尿病及NPDR時(shí)體內(nèi)EPCs較無糖尿病患者明顯減少,分析原因可能為:雖然高血糖狀態(tài)下體內(nèi)缺血缺氧會(huì)刺激EPCs激活eNOS通路促進(jìn)骨髓中的EPCs向血液內(nèi)遷移,但EPCs凋亡速度仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于遷移速度,這可能與高血糖狀態(tài)下機(jī)體氧化應(yīng)激能力明顯增強(qiáng),氧化應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡速度有關(guān),同時(shí)原血液中的EPCs早期積極發(fā)揮對(duì)缺血組織血管內(nèi)皮修復(fù)功能,加快了EPCs自身消耗及衰竭[14]。

PDR是DR進(jìn)展后期較為嚴(yán)重的階段,主要以形成病理性新生血管為標(biāo)志,進(jìn)而引起玻璃體積血、纖維增生膜生成、牽拉性視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重后果。NPDR中EPCs的血管內(nèi)皮修復(fù)能力只能發(fā)揮局限性積極作用,后期隨著缺血缺氧進(jìn)一步加劇,大量微血管內(nèi)皮功能障礙,血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障被破壞,宏觀表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管不斷出血、滲出、閉塞甚至脫離,微觀表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞邊界斷裂,從而刺激病理性新生血管代償性增生,進(jìn)而進(jìn)入PDR。探討PDR病理性新生血管的發(fā)生機(jī)制以阻止其發(fā)生發(fā)展已成為目前眼科研究的前沿與焦點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)D組患者EPCs數(shù)量較B組、C組明顯增多,與A組患者相比略有升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這提示我們DR進(jìn)入PDR后氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強(qiáng),視網(wǎng)膜血管EPCs更加積極被遷移至血管內(nèi),并參與了病理性新生血管生成。

VEGF是一種可特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的自分泌性生長(zhǎng)因子,在體內(nèi)可增加血管的通透性及促進(jìn)新生血管的形成[15]。VEGF在PDR中表達(dá)明顯升高,但VEGF參與PDR視網(wǎng)膜新生血管的形成機(jī)制尚未完全清楚。有研究表明,VEGF可誘導(dǎo)細(xì)胞膠原酶的合成及釋放,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖,改變內(nèi)皮細(xì)胞基因的激活狀態(tài)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),D組患者玻璃體內(nèi)MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平明顯高于A組,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這說明在PDR中MMP-9及VEGF均有異常高表達(dá)[17],我們猜測(cè)可能是因?yàn)镋PCs遷移到缺血缺氧的視網(wǎng)膜后刺激eNOS通路,大量釋放MMP-9及VEGF,VEGF反作用于EPCs表面受體VEGFR,進(jìn)一步誘導(dǎo)EPCs增生、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá),MMP-9本身可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分,在高糖狀態(tài)下可激發(fā)促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。此外,MMP-9可通過釋放VEGF以參與血管生成,MMP-9結(jié)合CD44可釋放儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β),TGF-β是已被證明的血管形成促進(jìn)因子[19],這些都提示MMP-9及VEGF可能與EPCs互相影響,在PDR新生血管形成中發(fā)揮作用。

綜上, EPCs的發(fā)現(xiàn)成為突破糖尿病長(zhǎng)期慢性血管并發(fā)癥的窗口,這使逆轉(zhuǎn)和改善微血管障礙及影響糖尿病并發(fā)癥成為可能。EPCs在DR不同時(shí)期的變化均有重要意義,尤其參與了PDR病理性新生血管的形成,在DR早期積極上調(diào)EPCs數(shù)量并改善其功能,對(duì)預(yù)防新生血管的發(fā)生發(fā)展有重要意義,應(yīng)用EPCs作為預(yù)防及治療DR新生血管的靶點(diǎn),聯(lián)合VEGF等相關(guān)因子干預(yù),或?qū)⒊蔀樾碌闹委熕悸?。本研究仍有不足之?因B組、C組患者均不需要手術(shù)治療,無法無創(chuàng)性獲取患者玻璃體,故對(duì)B組、C組患者M(jìn)MP-9、VEGF蛋白無法測(cè)定,后期計(jì)劃開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。同時(shí)EPCs在DR不同時(shí)期發(fā)揮作用時(shí),自身遷移、黏附及修復(fù)功能是否有變化也暫未進(jìn)行深層次探討,后期可加大樣本量進(jìn)行研究。