魏小春，原玉香，趙艷艷，楊雙娟，蘇賀楠，王志勇，王曉青，冉 冉，李 林，牛劉靜，張曉偉

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

國(guó)家歷來(lái)重視農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，自2004 年以來(lái)，中央“一號(hào)文件”把種業(yè)發(fā)展提升到國(guó)家戰(zhàn)略高度。近年來(lái)，我國(guó)種業(yè)發(fā)展勢(shì)頭良好，取得了一些突破，水稻、玉米、小麥等三大主糧高效育種技術(shù)體系逐漸完善，主要農(nóng)作物自主選育品種占比在95%以上，基本實(shí)現(xiàn)主要糧食作物良種全覆蓋。但很多種子的進(jìn)口量遠(yuǎn)大于出口量[1]，抗根腫病耐抽薹十字花科蔬菜品種就是其中一個(gè)例子，而且大都是雄性不育系制種，利用雄性不育系材料進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，最有效的辦法就是篩選對(duì)應(yīng)合適的恢復(fù)系。然而，在大白菜類蔬菜中尚未發(fā)現(xiàn)Ogura 雄性不育恢復(fù)基因材料。

Ogura 雄性不育系是日本科學(xué)家Ogura 首次在蘿卜中發(fā)現(xiàn)的天然雄性不育類型，雄性敗育徹底，為迄今發(fā)現(xiàn)的蕓薹屬作物不育源中不育性最理想的類型[2]，越來(lái)越多的Ogura 雄性不育系被用于生產(chǎn)白菜類蔬菜雜交種，雜交種純度可達(dá)到100%。但由于Ogura 是一種典型的母系遺傳性狀，降低了種質(zhì)資源的多樣性，如日本大白菜AKIMEKI 是一個(gè)抗根腫病的品種，含有3 個(gè)抗性基因，但由于其為Ogura 胞質(zhì)雄性不育系雜交種，不能直接用于種質(zhì)資源創(chuàng)新。降低Ogura 胞質(zhì)帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用，可以通過(guò)實(shí)現(xiàn)胞質(zhì)多樣化來(lái)開發(fā)新的胞質(zhì)資源，如CMS-Pol、CMS-Nap、CMS-Hau、CMS-orf 220[3]，也可以創(chuàng)制Ogura 胞質(zhì)不育恢復(fù)系，恢復(fù)不育材料的育性。國(guó)內(nèi)外現(xiàn)已有甘藍(lán)類蔬菜Ogura 恢復(fù)系創(chuàng)制的報(bào)道[4-5]。主要是通過(guò)芥藍(lán)（CC 基因組）與攜帶恢復(fù)基因（Rfo）的油菜（AACC 基因組）遠(yuǎn)緣雜交后，利用胚挽救技術(shù)獲得種間雜種F1，利用恢復(fù)基因標(biāo)記檢測(cè)，以不育系為母本、恢復(fù)基因陽(yáng)性單株為父本，進(jìn)行連續(xù)回交后得到BC3代，獲得染色體數(shù)為18、遺傳背景接近于芥藍(lán)Ogura CMS 的恢復(fù)材料[5]。

遠(yuǎn)緣雜交在創(chuàng)制新的作物類型、利用外來(lái)屬種的特殊有利性狀豐富作物變異類型、創(chuàng)制新的雄性不育源、探索和研究生物進(jìn)化等方面具有重要意義。在十字花科作物中，為了克服遠(yuǎn)緣雜交中幼胚死亡或敗育，研究人員利用胚胎挽救技術(shù)獲得了結(jié)球甘藍(lán)×大白菜、蘿卜×大白菜、大白菜×蘿卜等遠(yuǎn)緣雜交種[6-7]。為了促進(jìn)兩屬作物間的優(yōu)良基因交換，Bannerot 等[8]利用Ogura 蘿卜不育胞質(zhì)材料轉(zhuǎn)育成甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜不育系。方智遠(yuǎn)等[9]利用胚挽救技術(shù)將蘿卜雄性不育系轉(zhuǎn)移至結(jié)球甘藍(lán)。程雨貴等[10]對(duì)蘿卜和甘藍(lán)正反雜交后的雜種胚進(jìn)行胚挽救，結(jié)果表明，以蘿卜作為母本較容易成功，而以甘藍(lán)為母本則很難成功。利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)進(jìn)行恢復(fù)基因轉(zhuǎn)移，首先要知道恢復(fù)基因所在的染色體位置。蘿卜中Ogura 胞質(zhì)不育恢復(fù)基因所在的位置為R9 染色體[11]。將恢復(fù)基因?qū)氲礁仕{(lán)型油菜后，通過(guò)原位雜交等技術(shù)將Rfo基因定位到甘藍(lán)型油菜C9 染色體上[12]。恢復(fù)基因的成功定位及克隆[11，13]也為定向轉(zhuǎn)移恢復(fù)基因及分子標(biāo)記開發(fā)提供了背景及序列基礎(chǔ)。

迄今尚未發(fā)現(xiàn)白菜類作物中存在Ogura 雄性不育系的恢復(fù)系，因此迫切需要?jiǎng)?chuàng)制白菜類作物Ogura 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)材料。由于油菜與蘿卜中恢復(fù)基因分別在C9 及R9 染色體上，相對(duì)于甘藍(lán)類蔬菜（CC 基因組）恢復(fù)系材料的創(chuàng)制，白菜類蔬菜（AA 基因組）會(huì)更加困難。通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交將甘藍(lán)型油菜育性恢復(fù)基因Rfo導(dǎo)入到大白菜中，然后將種間雜種進(jìn)行連續(xù)回交，獲得回交BC1、BC2和BC3代育性恢復(fù)材料。然而，這些回交材料的遺傳背景與大白菜仍存在一定差異，還需進(jìn)一步回交。在保留恢復(fù)基因Rfo的同時(shí)，需盡可能消除甘藍(lán)型油菜的遺傳背景，這對(duì)最終實(shí)現(xiàn)Ogura CMS 白菜類蔬菜的育性恢復(fù)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 雄性不育系恢復(fù)系材料選擇

Ogura 雄性不育系大白菜Tyms（Brassica rapassp.pekinensis，AA 基因組）由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜課題組提供；含恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜P1755（Brassica napusL.，AACC 基因組），由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所張書芬研究員饋贈(zèng)。

Ogura CMS 大白菜雜交商品種AKIMEKI（Brassica rapassp.pekinensis，AA 基因組），購(gòu)自日本農(nóng)林社株式會(huì)社（Norin）。

以大白菜Tyms 為母本、甘藍(lán)型油菜P1755 為父本，制備種間雜交組合。蕾期進(jìn)行套袋、人工授粉。雜交前2～3 d，摘除父本花序上已經(jīng)開放的花朵，套袋隔離。套袋父本開花當(dāng)天取花藥，與母本植株適宜大小的花蕾進(jìn)行剝蕾授粉。授粉后，套袋進(jìn)行隔離，以防外來(lái)花粉污染。

雜交F1：Tyms×P1755。

第1 代回交：母本為Ogura 雄性不育系大白菜Tyms，父本為種間雜交F1代育性恢復(fù)Rfo單株（AAC+基因組）。

第2 代回交：母本為Ogura 雄性不育系大白菜Tyms，父本為BC1代回交后通過(guò)標(biāo)記篩選獲得的具有良好育性的恢復(fù)單株（AA+基因組）。

第3 代回交：母本為Ogura 雄性不育系大白菜Tyms，父本為BC2代回交后通過(guò)標(biāo)記篩選獲得的具有良好育性恢復(fù)、遺傳背景更接近大白菜母本的優(yōu)良單株（AA 基因組）。

上述材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜課題組提供，均定植于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，常規(guī)栽培管理，2018 年春季開始，2021年獲得BC3、BC4株系。

1.2 染色體觀察

試驗(yàn)前期在試驗(yàn)田分別選取Ogura CMS 不育系（Tyms）大白菜母本、恢復(fù)系（P1755）油菜父本及F1、BC1、BC2、BC3代中育性不同的植株，分別標(biāo)號(hào)，并取其花蕾，分別用卡諾氏液固定保存，定期更換卡諾氏液。

之后在純水中選擇固定好的適當(dāng)大小的花蕾，2 倍顯微鏡下解剖，取出一粒完整花藥放入1 mol·L-1鹽酸中，并在60 ℃烤片機(jī)上預(yù)熱2 min。酸解完成后，取出花藥，機(jī)械敲碎，用改良的苯酚品紅染液染色，并在40 倍鏡下篩選處于減數(shù)分裂時(shí)期的花藥，分別標(biāo)記保存。將已篩選出的花蕾進(jìn)行酶解、低滲與熒光染色制片等一系列操作，并對(duì)育性不同的各世代植株進(jìn)行染色體細(xì)胞學(xué)分析，熒光顯微鏡（型號(hào)：LEICA CTR4000）觀察（花粉粒染色體各個(gè)時(shí)期配對(duì)情況），觀察并記錄染色體數(shù)，比較染色體形態(tài)與分裂是否異常，計(jì)算恢復(fù)基因的傳遞效率[14]。

1.3 植物細(xì)胞學(xué)倍性鑒定及細(xì)胞分裂過(guò)程觀察

流式細(xì)胞儀用于鑒定遠(yuǎn)緣雜交雜種后代的倍性，取雜種后代植株葉片，利用流式細(xì)胞儀（Cy-Flow Cube 8）（德國(guó)PARTEC 公司）檢測(cè)植株倍性。在本試驗(yàn)中，以大白菜（Tyms）、甘藍(lán)（CC）、甘藍(lán)型油菜（P1755）為模板，將電壓調(diào)節(jié)至523 V，根據(jù)圖中峰值位置判斷植株倍性[15]。利用大白菜Ogura 雄性不育系Tyms 為母本、含有恢復(fù)基因的油菜P1755 為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，獲得種間雜交種，觀察各個(gè)時(shí)期染色體減數(shù)分裂的變化，即細(xì)線期、粗線期、終變期、減I中期、減I后期、減Ⅱ中期、減Ⅱ后期[16]。

1.4 引物開發(fā)及恢復(fù)基因的PCR檢測(cè)

以蘿卜Ogura 胞質(zhì)不育恢復(fù)基因Rfo序列信息（NCBI 登錄號(hào)：AJ550021.1）為目標(biāo)序列，在大白菜與油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.brassicadb.cn/#/Download/）進(jìn)行Blast 比對(duì)。蘿卜Ogura 細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfo位于R09 染色體上，甘藍(lán)型油菜A09 染色體、C09 染色體以及大白菜A09 染色體上存在Rfo同源序列。根據(jù)Rfo基因與親本的序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)開發(fā)出2 對(duì)引物，即RsRfo-F/RsRfo-R 及Rfo-105F/Rfo-545R。

恢復(fù)基因PCR 所用引物為Rfo特異引物（表1）。采用的PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，體系中的具體成分含量為：PCR 酶TaqMix 10 μL，F(xiàn)-primer 1 μL，R-primer 1 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存PCR 產(chǎn)物5 min。以此進(jìn)一步確定Rfo特異分子標(biāo)記篩選結(jié)果與花粉育性表現(xiàn)一致，從而選擇出一株遺傳背景與回交母本大白菜最相似，且含有Rfo恢復(fù)基因的育性恢復(fù)單株，用于下一步的回交轉(zhuǎn)育。

1.5 回交后代恢復(fù)基因傳遞效率及檢測(cè)

回交后代恢復(fù)基因Rfo的傳遞效率（transmission rate，TR）的計(jì)算，TR/%=Rfo陽(yáng)性單株數(shù)目/群體總單株數(shù)×100。

恢復(fù)系新種質(zhì)的檢測(cè)：利用所創(chuàng)制的BC3陽(yáng)性單株對(duì)Ogura CMS 大白菜商品雜交種AKIMEKI進(jìn)行恢復(fù)試驗(yàn)，材料種植于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，恢復(fù)基因Rfo及不育基因Orf138檢測(cè)引物見(jiàn)表1。

表1 本項(xiàng)目中所涉及到引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)雜交后代F1（AAC）進(jìn)行形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

Ogura 雄性不育系大白菜Tyms 抱莖生長(zhǎng)，葉片較薄、葉色較綠。甘藍(lán)型油菜P1755 葉色較深，主花序明顯，抱莖生長(zhǎng)葉片較厚且有蠟質(zhì)層。雜種一代的生長(zhǎng)勢(shì)較旺，花枝發(fā)達(dá)，葉色濃綠，蠟粉較多，雜種一代在形態(tài)上有很明顯的區(qū)別，更接近于普通的甘藍(lán)型油菜（圖1）。

圖1 親本以及子代花、葉、植株的表型形態(tài)

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)，對(duì)高速流動(dòng)的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行了多項(xiàng)參數(shù)測(cè)量并對(duì)DNA 含量進(jìn)行分析，經(jīng)信號(hào)處理后繪制出DNA 含量分布曲線，能夠直觀地觀察到植株的倍性。觀察發(fā)現(xiàn)，大白菜Tyms 在減數(shù)分裂間期的DNA 熒光強(qiáng)度峰值位于橫坐標(biāo)35 位置，P1755 位于橫坐標(biāo)75位置，F(xiàn)1代植株減數(shù)分裂間期DNA 的熒光強(qiáng)度峰值的橫坐標(biāo)位置與雙親峰值對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)位置的平均值55 接近，此檢測(cè)結(jié)果表明，AAC 雜交成功（圖2）。

圖2 大白菜Tyms 與油菜P1755 雜交后代的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2.2 親本及雜交種F1細(xì)胞分裂過(guò)程觀察

由圖3-a4 可知，Tyms 染色體數(shù)目為20 條，由圖3-b4 可以看出，P1755 染色體數(shù)目為38 條，由圖3-c4 可以看出，減數(shù)分裂一代F1染色體數(shù)目為29 條；由圖3-a1～a7 可知Tyms 染色體為二倍體并且減數(shù)分裂正常；由圖3-b1～b7 可知，P1755 染色體為四倍體并且減數(shù)分裂正常；由圖3-c1～c7 可知，F(xiàn)1為三倍體并且減數(shù)分裂正常。F1為真雜種，所以經(jīng)過(guò)染色體鑒定可以進(jìn)一步確定雜交成功。

圖3 大白菜與油菜雜交后代減數(shù)分裂染色觀察

選取BC1、BC2、BC3回交后代處于終變期、減數(shù)第一次分裂后期和減數(shù)第二次分裂時(shí)期的花粉母細(xì)胞進(jìn)行染色體細(xì)胞學(xué)觀察（圖4）。結(jié)果表明，大多數(shù)花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂后期不均等分離，也有落后染色體（圖4-a）、染色體排列混亂（圖4-b）、單價(jià)體（圖4-c）、三價(jià)體（圖4-d）等異常行為頻繁出現(xiàn)，從而導(dǎo)致不育株常出現(xiàn)非整倍染色體的現(xiàn)象。說(shuō)明回交后代育性不同很大程度上由減數(shù)分裂時(shí)期異常的染色體行為所致，A 基因組和C 基因組間的種間雜種在減數(shù)分裂過(guò)程中，常存在A-C 基因組間的非同源染色體配對(duì)和異源聯(lián)會(huì)的現(xiàn)象。

圖4 回交世代單株減數(shù)分裂時(shí)期染色體行為觀察

2.3 回交后代染色體數(shù)統(tǒng)計(jì)

筆者試驗(yàn)的母本為二倍體Ogura-CMS 不育系Tyms 大白菜（AA 基因組），父本為含恢復(fù)基因Rfo的四倍體甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系P1755（AACC基因組），它們所對(duì)應(yīng)的染色體數(shù)分別為20 條和38 條。在前期獲得種間雜交F1代育性恢復(fù)Rfo單株（AAC+基因組）的前提下，結(jié)合Rfo特異分子標(biāo)記輔助篩選，繼續(xù)進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，結(jié)合田間花粉發(fā)育情況，通過(guò)對(duì)BC1、BC2、BC3回交后代的染色體觀察，發(fā)現(xiàn)隨著回交代數(shù)的增加，回交后代染色體數(shù)接近母本（表2）。同時(shí)，筆者已經(jīng)在BC3代中發(fā)現(xiàn)有染色體為20 條的、育性恢復(fù)的、表型接近母本大白菜的Rfo陽(yáng)性恢復(fù)材料F10（表2），下一步應(yīng)將其作為重點(diǎn)單株進(jìn)行BC4代的回交轉(zhuǎn)育。

表2 回交世代后代可育及不育單株的染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)

2.4 回交后代中恢復(fù)基因的分子標(biāo)記快速檢測(cè)

以蘿卜Ogura 細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的Rfo序列為目標(biāo)序列，通過(guò)與大白菜和油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)型油菜A09 染色體、C09 染色體以及大白菜A09 染色體上存在Rfo同源序列，蘿卜Rfo基因與其同源率分別達(dá)到89.61%、89.66%及89.61%。根據(jù)Rfo基因與親本的序列比對(duì)結(jié)果（圖5），設(shè)計(jì)開發(fā)Rfo基因檢測(cè)引物并用于檢測(cè)（圖6）。

圖5 不同來(lái)源Rfo 基因多序列比對(duì)

圖6 恢復(fù)基因Rfo 的PCR 分子標(biāo)記檢測(cè)

利用Rfo特異標(biāo)記對(duì)獲得的37 株BC3回交后代進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，37 株大白菜-甘藍(lán)型油菜BC3后代中有17 株能擴(kuò)增出清晰明亮的特異性目的條帶，這17 株BC3回交后代中含有Rfo基因。該Rfo特異性分子標(biāo)記篩選結(jié)果與花粉育性相一致，可以作為Ogura CMS 大白菜恢復(fù)植株Rfo基因的分子特異性標(biāo)記。結(jié)合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)染色體觀察及恢復(fù)基因Rfo全長(zhǎng)特異分子標(biāo)記技術(shù)，在BC3回交群體中發(fā)現(xiàn)1 株染色體數(shù)為20、遺傳背景類似大白菜的單株。

2.5 回交后代中恢復(fù)基因的傳遞效率及檢測(cè)

結(jié)合Rfo特異標(biāo)記篩選結(jié)果對(duì)所有回交Rfo陽(yáng)性單株育性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出特異目的條帶的17 株Rfo陽(yáng)性單株均出現(xiàn)花粉，與Rfo標(biāo)記篩選結(jié)果相一致。但是，對(duì)所有Rfo陽(yáng)性單株花粉飽滿程度進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果顯示，有些單株花粉飽滿，有些單株花藥細(xì)小，僅有少量花粉。未擴(kuò)增出明顯條帶的20 株，開花后仍表現(xiàn)為不育，可能由異源染色體障礙造成非整倍染色體現(xiàn)象所致。這17 株BC3代Rfo陽(yáng)性株的Rfo基因的傳遞效率為46%，相對(duì)于BC2代Rfo陽(yáng)性株40%的Rfo基因傳遞效率有所提高。該結(jié)果進(jìn)一步表明，Rfo基因在BC1、BC2、BC3回交后代中可以穩(wěn)定傳遞，傳遞效率正常且逐代增加，能夠保證回交后代的育性穩(wěn)定，花粉質(zhì)量也有所提高。

利用所創(chuàng)制的大白菜Ogura CMS 不育系恢復(fù)系對(duì)Ogura CMS 大白菜商品雜交種AKIMEKI 進(jìn)行育性恢復(fù)，結(jié)果表明，在43 個(gè)雜交后代中，發(fā)現(xiàn)11 個(gè)植株有花粉，通過(guò)恢復(fù)基因分子標(biāo)記Rfo 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該11 個(gè)單株含有Rfo基因；同時(shí)，由于Ogura CMS 為胞質(zhì)線粒體缺陷與核基因互作的雄性不育，因此，在43 個(gè)雜交后代中，均會(huì)存在線粒體缺陷orf138，發(fā)現(xiàn)43 個(gè)單株中均存在胞質(zhì)線粒體，與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致（圖7），證明所創(chuàng)制的恢復(fù)系恢復(fù)基因有效。

圖7 對(duì)AKIMEKI 進(jìn)行育性恢復(fù)的43 個(gè)雜交后代花藥器官觀察、恢復(fù)基因及胞質(zhì)基因Orf138 檢測(cè)

3 討論與結(jié)論

3.1 遠(yuǎn)緣雜交中種間三倍體的成功創(chuàng)制及利用

筆者將大白菜Tyms 作為母本和甘藍(lán)型油菜品種P1755 作為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，使大白菜具有Rfo恢復(fù)基因，用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行前景及背景的篩選，從而得到具有再生能力的雜種后代。研究中還對(duì)種間雜種的形態(tài)學(xué)、倍性、染色體做了觀察分析，最終確定了種質(zhì)資源AAC 的成功創(chuàng)制，為進(jìn)一步優(yōu)化種質(zhì)資源提供了基礎(chǔ)。

Ogura 胞質(zhì)雄性不育為十字花科作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的一個(gè)重要途徑，而且它具有不育性穩(wěn)定的特點(diǎn)[17]。但是，Ogura 胞質(zhì)雄性不育是一種典型的母性遺傳特征，其F1都是雄性不可育，無(wú)法自交分離，這對(duì)種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有一定的局限性。研究和創(chuàng)制Ogura CMS 恢復(fù)系是一種行之有效的途徑。因此，開發(fā)利用Ogura CMS 恢復(fù)材料，不僅有助于種質(zhì)資源的多元性而且有利于種質(zhì)資源的重復(fù)利用，對(duì)于提高我國(guó)十字花科蔬菜育種國(guó)際地位有著至關(guān)重要的作用。迄今為止，在白菜類蔬菜中尚未發(fā)現(xiàn)Ogura 胞質(zhì)雄性不育系的恢復(fù)系，急需引入Ogura CMS 的恢復(fù)系，創(chuàng)制出白菜類蔬菜的Ogura CMS 不育系恢復(fù)材料。

甘藍(lán)型油菜是由甘藍(lán)和白菜通過(guò)自然種間雜交后雙二倍化后形成的，遠(yuǎn)緣雜交已成為擴(kuò)大其遺傳背景、改良種質(zhì)資源的重要手段。然而，由于雜交后代存在生殖障礙等問(wèn)題，需要進(jìn)行多代回交，甚至于多輪胚挽救工作[18]。徐書法等[19]在研究大白菜、芥菜和甘藍(lán)型油菜的遠(yuǎn)緣雜交時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜與白菜間的雜交親和性較強(qiáng)，且存在單側(cè)雜交不親和性。筆者的研究將Ogura CMS 大白菜Tyms與含有恢復(fù)基因的甘藍(lán)型油菜P1755 雜交，一定程度上克服了遠(yuǎn)緣雜交障礙，相比甘藍(lán)類蔬菜，白菜類蔬菜與甘藍(lán)型油菜親和性較強(qiáng)，較易獲得種間雜交種。本試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)1后代AAC 育性較高，且在減數(shù)分裂時(shí)期，A 染色體間配對(duì)穩(wěn)定，整倍體配子出現(xiàn)頻率較高。在F1種間雜交種，可將蘿卜源的Rfo基因穩(wěn)定固定并遺傳，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育，可成功將Rfo基因?qū)隣gura CMS 大白菜的基因組中，是Ogura CMS 大白菜遺傳背景拓展的重要手段之一。

3.2 遠(yuǎn)緣雜交后代染色體行為配對(duì)影響花粉育性

由于遠(yuǎn)緣雜種的親本來(lái)源于不同的種或?qū)?，其后代相?yīng)就含有2 套或2 套以上的染色體組，育性通常較低或高度不育，染色體行為異常常發(fā)生在配子形成、胚胎發(fā)育和植物生長(zhǎng)過(guò)程中。崔輝梅等[20]、喬海云等[21]在蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜交種間雜種的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期染色體觀察中均發(fā)現(xiàn)，雜交后代染色體間配對(duì)、重組、分離通常較為混亂，常產(chǎn)生不減數(shù)配子，使得配子遺傳多樣化，分離世代長(zhǎng)，理想基因型不易出現(xiàn)。筆者通過(guò)對(duì)回交后代減數(shù)分裂染色體細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂后期多為不均等分離，也有染色體排列混亂、三價(jià)體、單價(jià)體、落后染色體等異常行為頻繁出現(xiàn)，從而導(dǎo)致不育株常出現(xiàn)非整倍染色體的現(xiàn)象，說(shuō)明回交后代育性不同很大程度上是由減數(shù)分裂時(shí)期異常的染色體行為所致。

3.3 恢復(fù)基因分子標(biāo)記提高回交育種效率

相對(duì)于傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀選擇方法，分子標(biāo)記輔助選擇具有顯著縮短育種進(jìn)程、加快新品種選育的優(yōu)越性[22]。筆者課題研究人員在前期研究中，通過(guò)甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜遠(yuǎn)緣雜交和胚挽救獲得F1代雜交種，通過(guò)回交獲得BC1代植株。然而，BC1代的花粉活力、育性穩(wěn)定性較差，人工授粉難以結(jié)實(shí)，無(wú)法直接利用[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大白菜和羽衣甘藍(lán)雜交后的回交過(guò)程中，BC4世代親和指數(shù)顯著增大[23]。

筆者利用Ogura 胞質(zhì)雄性不育系大白菜為母本，用獲得的BC1代中攜帶有Rfo陽(yáng)性的植株進(jìn)行回交。通過(guò)Rfo特異分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，結(jié)合育性檢測(cè)、形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)觀察對(duì)遺傳背景進(jìn)行分析，分別篩選獲得了BC2、BC3代Rfo單株，用于下一代回交轉(zhuǎn)育。雖然筆者已經(jīng)在BC3代中初步獲得了育性穩(wěn)定、染色體數(shù)為20、含有Rfo恢復(fù)基因、形態(tài)學(xué)性狀總體偏向大白菜的陽(yáng)性單株，進(jìn)一步對(duì)Ogura CMS 商品種進(jìn)行恢復(fù)測(cè)試，結(jié)果表明，所創(chuàng)制恢復(fù)系恢復(fù)基因有效；但仍需進(jìn)行大量回交和篩選，從而進(jìn)一步消除恢復(fù)材料甘藍(lán)類油菜基因的背景。隨著進(jìn)一步BC4代的回交轉(zhuǎn)育，Rfo基因有望穩(wěn)定固定在Ogura CMS 大白菜基因組，為大白菜Ogura 雄性不育恢復(fù)系材料的創(chuàng)制提供了材料基礎(chǔ)。