范鵬飛，趙麗君，王月玲，許娜娜，胡瑞坤，陳明月，張夢瑤，楊路明，楊 森

（河南農業(yè)大學園藝學院 鄭州 450002）

堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉錄因子家族是規(guī)模最大、種類最多的家族之一。bZIP 轉錄因子（bZIP-TFs）具有保守的bZIP 結構域，由2 個結構特征組成：特異結合DNA 的基本區(qū)域和亮氨酸拉鏈二聚基序的基本區(qū)域[1]。除了bZIP 結構域外，bZIP 轉錄因子還有其他一些結構域，如富含谷氨酰胺的基序和磷酸化位點[R/KxxS/T][2]。為了與DNA 結合，基本區(qū)域的N 端一半與雙鏈DNA 的主槽結合，而Leu 拉鏈的C 端一半通過二聚作用形成重疊的卷曲結構。目前，bZIP 家族成員已在植物、動物和酵母等多種真核生物基因組中得到鑒定或預測。據(jù)報道，bZIP 轉錄因子參與了脅迫生長條件下的發(fā)育和生理過程，被認為是應對各種非生物脅迫的重要調節(jié)因子，如擬南芥[3]、水稻[4]、小麥[5]、番茄[6]、辣椒[7]、大豆[8]和玉米[9]中的干旱、高鹽和低溫脅迫。此外，bZIP 轉錄因子在響應信號通路也發(fā)揮著重要作用，包括ABA 信號、光信號、滲透和病原體感染[10]。因此，它們對各種植物抵御不利的環(huán)境條件非常重要[1]。在植物中，bZIP 蛋白除了響應各種生物/非生物脅迫外，還在生長和發(fā)育中發(fā)揮重要作用[11]。在發(fā)育過程中，bZIP-TFs 在器官和組織分化、細胞伸長、氮/碳和能量代謝、未折疊蛋白應答、種子貯藏蛋白基因調控體細胞胚胎發(fā)生等方面起著關鍵作用[12-17]。

黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，在全世界范圍內廣泛種植，同時也是我國設施栽培的主要蔬菜種類之一。華北型黃瓜、華南型黃瓜和歐洲溫室型黃瓜是我國市面上常見的幾類黃瓜品種。相對于光滑無刺的歐洲溫室黃瓜果實，華北型和華南型黃瓜果實表面密集著生大量果刺。“頂花帶刺”是中國消費者挑選華北型黃瓜的一大標準，因此，果刺密度及大小逐漸成為黃瓜果實重要的外觀品質性狀，已經(jīng)成為改善黃瓜果實商品品質的主要目標[18-19]。就黃瓜果刺形成而言，其發(fā)育過程可分為果刺的起始、基座膨大、成熟和衰老等4 個階段，其中，每個階段都可能會涉及不同的基因參與調控[20]。目前為止，已被報道的調控黃瓜果刺發(fā)育的基因涉及HD-ZIP 家族、MYB 家族、C2H2 鋅指蛋白、WD-repeat 蛋白以及bHLH 家族基因等不同基因家族的成員[21-23]。植物激素也被報道調節(jié)黃瓜果刺性狀起始和分化階段，包括赤霉素、細胞分裂素、生長素和乙烯途徑都參與了黃瓜果刺的發(fā)育[21]。黃瓜果刺性狀已然挖掘到許多相關基因和激素通路，但光照、溫度以及水肥等外界因素對果刺的影響仍然不清楚。bZIP 轉錄因子在生物/非生物脅迫以及響應信號通路中發(fā)揮著重要作用，但黃瓜bZIP家族基因的研究還較少，有關其功能還不清楚。筆者通過全基因組分析鑒定出黃瓜bZIP家族基因，結合果刺突變體材料的轉錄組測序數(shù)據(jù)分析和異源轉化回補擬南芥突變體表型觀察，表明黃瓜bZIP基因家族中CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530基因在黃瓜表皮毛發(fā)育過程中可能具有調控作用，研究結果可為后續(xù)開展CsbZIPs對黃瓜表皮毛調控的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和處理方法

黃瓜大果刺基座L-SB 及近等基因系小果刺基座S-SB 材料均由河南農業(yè)大學瓜類分子育種實驗室提供。擬南芥突變體從突變體庫（http：//www.arashare.cn/index/Product/index.html）購買獲得。

試驗于2022 年5－10 月在河南農業(yè)大學園藝學院分子瓜類育種實驗室進行。擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col 及突變體材料，均使用酒精消毒30～60 s 后，清水清洗2～3 遍，然后使用3%NaClO 溶液消毒15 min，期間不?；蝿樱鬁缇逑?～5 遍，播種于MS 培養(yǎng)基中。4 ℃冰箱放置3 d 后放入組培室（光照16 h，黑暗8 h，恒溫25 ℃）中培養(yǎng)，待長至2～4 片真葉時挑選根系健壯的幼苗移栽至基質中。光照培養(yǎng)箱中（日溫24 ℃，夜溫16 ℃，光照16 h，黑暗8 h）正常生長，每隔1周澆水1 次[24]。

1.2 黃瓜bZIP基因家族成員鑒定

將擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org）中已知的20 個bZIP基因保守序列，通過TBtools軟件Blast 搜索獲得黃瓜bZIP候選基因。此外，在葫蘆科數(shù)據(jù)庫（http：//www.cucurbitgenomics.org/）使用關鍵詞bZIP檢索。從PFAM 數(shù)據(jù)庫下載bZIP結構域的HMMER 文件，從黃瓜基因組中提取具有bZIP結構域的蛋白序列。三者結合，最終確定黃瓜bZIP家族成員。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

分別從葫蘆科數(shù)據(jù)庫和擬南芥數(shù)據(jù)庫下載了bZIP 蛋白序列，利用MEGA 7.0 構建系統(tǒng)進化樹，其中聚類分析使用鄰接法Neighbor-Joining，進行Bootstrap 測試，重復數(shù)為1000，進化距離的計算方法為Poisson model。利用AI 工具進行美化。

1.4 保守結構域分析

應用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）預測分析bZIP 蛋白序列的結構域，搜尋Motif 值設置為10，結構域寬度設定為最小10、最大100，其他參數(shù)為默認值。再利用TBtools 對保守結構域進行篩選和可視化[25]。

1.5 染色體定位

從葫蘆科數(shù)據(jù)庫下載黃瓜bZIP基因文件，根據(jù)基因組注釋文件中提供的位置信息，將所有黃瓜bZIP基因定位到相應的染色體上。利用TBtools軟件繪制出染色體分布圖[26]。根據(jù)bZIP基因在每條染色體上分布個數(shù)進行量化統(tǒng)計。

1.6 黃瓜bZIP基因家族qRT-PCR分析

根據(jù)黃瓜bZIP基因的 CDS 序列設計qRT-PCR 引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用華越洋RNA 提取試劑盒提取總RNA，并使用諾維贊反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA。使用NCBI 中的primer-blast 功能設計CsbZIPs的特異性定量引物，按照諾維贊熒光定量PCR 試劑盒步驟，以黃瓜cDNA 為模板檢測CsbZIPs成員的表達量?；蛳鄬Ρ磉_量按照2-△△Ct方法計算[27]。其中，內參基因為CsACTIN，每個檢測的樣本都設置了3 個生物學重復和3 個技術重復，繪圖使用GraphPad Prism 軟件。

表1 引物序列信息

1.7 擬南芥遺傳轉化

過量表達載體的構建：從黃瓜cDNA 中克隆得到CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530CDS 序列，將此片段連接到pFGC5941 載體酶切位點AscI和PacI之間，構建35S：：CsaV3_2G031960和35S：：CsaV3_3G046530過量表達載體，將載體轉化農桿菌感受態(tài)GV3101。

擬南芥遺傳轉化[28]：根據(jù)上述擬南芥播種方法播種擬南芥Atbzip56突變體，待擬南芥長出5 cm主莖時剪去主莖，促使擬南芥長出更多的側枝，等擬南芥長至10～15 cm 時剪去所有露白和開放的花以及莢果，按照花序侵染法流程，侵染擬南芥。黑暗18～22 h 后正常生長，約30 d 后收獲T1種子。將T1代種子根據(jù)上述擬南芥播種方法播種在質量濃度為20 mg·L-1Basta 的MS 培養(yǎng)基上，待長至2～4片真葉時仍然生長健壯的幼苗移栽至基質中，隨后進行DNA 鑒定，獲得的陽性苗可在顯微鏡下進行表型觀察。

2 結果與分析

2.1 黃瓜基因組中bZIP 基因家族TFs 的鑒定及染色體分布

利用生物信息學方法，在黃瓜全基因組中鑒定得到75 個黃瓜bZIP 轉錄因子。Basic region 和Leucine zipper 是bZIP 轉錄因子都具有的2 個保守結構域（圖1-A）。利用TBtools 軟件繪制出黃瓜bZIP基因家族的染色體分布圖。75 個CsbZIPs 轉錄因子不均勻地分布在7 個染色體上（圖1-B）。在6 號染色體上bZIP 轉錄因子分布最多，占總數(shù)的21.3%；在1 號染色體上bZIP 轉錄因子分布最少，占總數(shù)的6.7%，其中3 個bZIP 轉錄因子沒有組裝到任何一條染色體上（圖1-C）。CsbZIPs基因在個體染色體上的分布模式也表明某些物理區(qū)域具有相對較多的基因簇積累。除了1 號染色體外，其他染色體的bZIP 轉錄因子更多地聚集在臂的上端或者下端。

圖1 黃瓜bZIP 基因家族染色體的分布

2.2 黃瓜基因組中bZIP基因家族系統(tǒng)進化分析

為確定黃瓜bZIP基因家族成員系統(tǒng)進化關系，利用MEGA 7.0 軟件，采用鄰接法（NJ）進行了黃瓜和擬南芥2 個物種95 條bZIP 蛋白質序列系統(tǒng)發(fā)育分析。與擬南芥相比，黃瓜bZIPs 轉錄因子同樣可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I 和S 共10 組（圖2），每組bZIP 蛋白的數(shù)量分別為11、2、4、16、6、5、4、2、9、15。

圖2 黃瓜與擬南芥bZIP 轉錄因子家族系統(tǒng)進化分析

2.3 黃瓜bZIP家族保守基序分析

利用MEME 網(wǎng)站對黃瓜bZIP基因家族的蛋白序列進行保守Motif 分析，利用NCBI 對黃瓜bZIP基因家族進行結構域分析（圖3-A）。在Motif分析中，除包含bZIP 轉錄因子保守的結構域外，還有其他的保守基序，共測出了包括bZIP 結構域（Motif 1 和Motif 7）在內的10 個基序（圖3-B）。在結構域分析中，bZIP 成員不僅具有bZIP 相關的功能，也具有其他的潛在功能，被系統(tǒng)進化分析分為同一組的bZIP 成員都預測到了相同的功能。綜上所述，除了bZIP 結構域區(qū)域外，有一些bZIP 轉錄因子通常還含有額外的保守基序，這些基序可能指示潛在的功能位點或參與激活bZIP 蛋白的功能。

圖3 黃瓜bZIP 基因家族蛋白保守結構域及bZIP 轉錄因子保守結構域Motif 1 和Motif 7

2.4 黃瓜不同果刺突變體及關鍵調控基因轉基因植株的轉錄組數(shù)據(jù)分析

GLABROUS 1（CsGL1）是果刺形態(tài)建成的關鍵基因，Csgl1突變體植株地上部分表現(xiàn)為“光滑無毛”的表型，通過細致觀察可發(fā)現(xiàn)其子房等地上部位組織器官表面密集覆蓋著大量體積變小的、發(fā)育畸形的表皮毛。WD-Repeat 轉錄因子CsTTG1和SPINE BASE SIZE 1（CsSBS1）被發(fā)現(xiàn)能夠與CsGL1形成三聚體復合物共同調控果刺形態(tài)建成。因此，為了解bZIP 轉錄因子在調節(jié)表皮毛發(fā)育中的潛在作用，首先對Csgl1突變體轉錄組數(shù)據(jù)進行了分析，共篩選出CsaV3_1G039550、CsaV3_1G014770和CsaV3_4G005470等3 個bZIP差異基因；同樣，在CsTTG1過表達植株子房轉錄組測序中也篩選到bZIP差異基因，包括CsaV3_1G014770、CsaV3_5G033640、CsaV3_3G000600、CsaV3_2G004160、CsaV3_7G003290和CsaV3_3G045480（表2）。另外，筆者課題組前期構建了一對果刺大小不同的近等基因系材料L-SB 和S-SB，利用其F2群體，挖掘得到果刺大小基因CsSBS1。對大果刺基座材料L-SB 和小果刺基座材料S-SB 幼嫩子房進行轉錄組分析，篩選得到CsaV3_1G039550、CsaV3_2G029010、CsaV3_3G000600、CsaV3_4G004890、CsaV3_5G033640、CsaV3_6G014980和CsaV3_7G003290等7 個bZIP差異基因。之后又對CsSBS1-RNAi 轉基因植株的子房轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選得到CsaV3_2G029010、CsaV3_4G005470、CsaV3_4G033330、CsaV3_5G033640和CsaV3_7G029950等5 個bZIP差異基因，其中，CsaV3_2G029010、CsaV3_5G033640和CsaV3_7G029950基因在親本和CsSBS1-RNAi 轉基因植株中均被篩選到，表明三者可能參與到了黃瓜表皮毛發(fā)育過程中（表2，圖4）。

圖4 轉錄組上bZIP 轉錄因子差異表達基因的熱圖

表2 不同轉錄組中篩選bZIP 差異基因

2.5 黃瓜bZIP基因的相對表達量分析

為了進一步確定bZIP 轉錄因子在L-SB 和S-SB 黃瓜材料中的表達差異，利用實時熒光定量PCR 技術，檢測了上述篩選出的bZIP差異基因在L-SB 和S-SB 子房中的差異表達，結果表明，CsaV3_3G000600、CsaV3_7G003290、CsaV3_2G029010、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530等6 個bZIP基因在親本中表達量有顯著差異，與轉錄組數(shù)據(jù)一致，表明這6 個基因可能參與調控黃瓜表皮毛發(fā)育過程（圖5）。

圖5 黃瓜bZIP 轉錄因子在果刺中的的相對表達量

2.6 擬南芥bzip 突變體量化統(tǒng)計及黃瓜bZIP 基因的異源轉化

為進一步確定CsaV3_3G000600、CsaV3_7G003290、CsaV3_2G029010、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530等6 個bZIP差異基因是否參與表皮毛的發(fā)育，筆者首先對CsaV3_7G003290、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530的擬南芥同源基因突變體進行了表型觀察（圖6-A～B），其中，Atbzip61（CsaV3_7G003290同源基因突變體）、Atbzip47（CsaV3_4G004890的同源基因突變體）以及Atbzip56（CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530共同的同源基因突變體）三種突變體與野生型相比（圖6-C），Atbzip47和Atbzip56兩個突變體植株主莖上表皮毛數(shù)量明顯減少，表皮毛外觀形態(tài)沒有明顯改變，Atbzip61突變體植株主莖上表皮毛數(shù)量未發(fā)生改變，表皮毛外觀形態(tài)發(fā)生了明顯變化，含有兩個分支的表皮毛數(shù)量顯著增加（圖6-D）。以上結果表明，AtbZIP47和AtbZIP56促進擬南芥主莖表皮毛的發(fā)育，而AtbZIP61則抑制擬南芥主莖表皮毛分支的形成。另外，筆者構建了黃瓜bZIP基因CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530的過表達載體，分別轉化到其對應的擬南芥同源基因突變體Atbzip56中，對篩選得到的轉基因植株進行表型觀察，結果表明兩個基因的過量表達均回補了Atbzip56突變體莖表皮毛減少的表型（圖6-D）。以上結果表明，擬南芥和黃瓜bZIP 轉錄因子對表皮毛發(fā)育具有保守功能，同時預示著黃瓜CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530兩個基因在黃瓜表皮毛發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。

圖6 擬南芥突變體的表型觀察與量化統(tǒng)計

3 討論與結論

筆者的研究從黃瓜全基因組中分析鑒定得到75 個bZIP基因，與擬南芥（Arabidopsis thaliana75）[29]、黃花蒿（Artemisia annua78）[30]中bZIP 轉錄因子數(shù)量相近。系統(tǒng)進化分析，黃瓜bZIP 家族可分為10 個亞族和一個未分組成員，除個別亞族外，每組成員數(shù)量占家族總成員的百分比與擬南芥相近，這可能預示著2 個物種同一組別的bZIP基因有相似的功能。黃瓜bZIP 家族進化過程比較保守，正如一些早期研究中所報道的，在擬南芥[29]、蓖麻[31]、玉米[32]和水稻[33]中發(fā)現(xiàn)了bZIP 結構域以外的多種保守基序，在黃瓜中也具有相同的研究結果。在結果域分析中，被系統(tǒng)進化分析分為同一組的bZIP 成員都預測到了相同的功能，這也說明同組的bZIP 成員在某些方面可能發(fā)揮著同樣的作用。

bZIP 蛋白在生物/非生物脅迫和信號通路中發(fā)揮著重要作用。目前，也陸續(xù)報道了bZIP 轉錄因子參與調控表皮毛的研究結果。在擬南芥Atbzip25和Atbzip53突變體中，與野生型相比，表皮細胞（PC）和毛狀體細胞（TC）的密度分別增加和減少[34]。AtbZIP25和AtbZIP53在擬南芥系統(tǒng)進化樹中分別屬于C 組和S 組，黃瓜bZIP 家族與擬南芥有著高度的相似性，在黃瓜bZIP 家族的C 組和S組可能也具有調控表皮細胞和毛狀體細胞的功能，但是否具有其他功能還需進一步驗證。筆者的研究通過果刺突變體材料的轉錄組測序數(shù)據(jù)分析篩選出了CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530兩個bZIP差異基因，兩個基因表達量在不同果刺材料中具有顯著差異，在進化樹中屬于H 組與AtbZIP56（HY5）分于同一小支。在擬南芥中，AtHY5不僅能直接調節(jié)CHS、F3H 和F3′H 等花青素結構基因的表達[35]，還可以與MYB 等轉錄因子的啟動子結合，間接調控花青素相關基因的表達[36]；在青蒿中，Aa-HY5被發(fā)現(xiàn)能夠通過影響表皮毛的發(fā)育進而影響青蒿素的分泌量[37]。

筆者試驗中的差異基因均是在果刺突變體材料的轉錄組中篩選得到的，對差異基因擬南芥同源基因表型應觀察角果處表皮毛的變化，但擬南芥野生型和突變體植株角果處均未發(fā)現(xiàn)表皮毛的存在，早期研究表明，GLABROUS INFLORESCENCE STEMS 3（AtGIS3）、ZINC FINGER PROTEIN 6（AtZFP6）等在擬南芥中主要調節(jié)莖稈表皮毛發(fā)育[38]，因此，筆者主要觀察了莖稈處表皮毛的變化。筆者研究發(fā)現(xiàn)，CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530兩個基因的過表達均回補了擬南芥bzip56突變體主莖表皮毛數(shù)量減少的表型，證明二者均有可能參與到對黃瓜表皮毛發(fā)育的調控。但現(xiàn)在黃瓜轉基因技術還不成熟，由于轉化效率低、嵌合率高等問題，黃瓜轉基因，尤其是基因編輯載體轉化仍面臨著較大的挑戰(zhàn)。后期也將對篩選得到的bZIP 轉錄因子進行黃瓜轉基因驗證，以期明確其在黃瓜表皮毛發(fā)育中的具體功能。

筆者利用生物信息學方法對黃瓜bZIP家族基因進行鑒定，并分析了他們的染色體定位、保守基序、功能預測以及進化關系等，對黃瓜bZIP家族基因有了初步了解。結合果刺突變體材料的轉錄組測序數(shù)據(jù)分析和異源轉化回補擬南芥突變體表型觀察，篩選到了在黃瓜表皮毛發(fā)育過程中可能具有調控作用的2 個基因CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530。黃瓜bZIP基因家族的鑒定和基因篩選不僅有助于深入了解黃瓜表皮毛的分子機制，而且為未來研究bZIP 轉錄因子對黃瓜表皮毛的調控奠定了基礎。