祁澤文黃銘涵張佳卉劉 藝韓烈保何 航,*

1北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 北京 100083;2北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院, 北京 100081

真核生物的基因組DNA在細(xì)胞核中與組蛋白結(jié)合形成核小體, 核小體是構(gòu)成染色質(zhì)的基本單位,染色質(zhì)通過(guò)緊密折疊高度壓縮形成螺旋化的染色體結(jié)構(gòu)[1-2]。在染色體進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄時(shí), 需要暴露DNA與轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件相結(jié)合, 這些可以與轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件結(jié)合的DNA區(qū)域稱為染色質(zhì)的可及性區(qū)域, 或者染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)[3-4]。對(duì)染色質(zhì)可及性的測(cè)定可以幫助獲取開(kāi)放區(qū)域信息、核小體定位信息以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合信息等[5]。

至今已有報(bào)道的染色質(zhì)可及性測(cè)定方法主要有4種, 分別為脫氧核糖核酸酶敏感位點(diǎn)測(cè)序(deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing,DNase-seq)、微球菌核酸酶輔助分離核小體測(cè)序(micrococcal nuclease assisted isolation of nucleosomes sequencing, MNase-seq)、甲醛輔助性調(diào)控元件分離測(cè)序(formaldehyde assisted isolation of regulatory elements followed by sequencing, FAIRE-seq)和染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATACseq)[6-9]。ATAC-seq在了解生物發(fā)育分化、疾病發(fā)生等過(guò)程和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究中占據(jù)非常重要的地位, ATAC-seq技術(shù)可通過(guò)測(cè)定染色質(zhì)的開(kāi)放區(qū)域直接獲得染色質(zhì)的可及性情況, 具有細(xì)胞核需求量少、高效靈敏、易重復(fù)等優(yōu)勢(shì), 因此逐漸被科研人員廣泛使用[9-11]。

目前, 雖然ATAC-seq的應(yīng)用較為成熟、廣泛,但該技術(shù)大部分運(yùn)用在動(dòng)物和疾病等方面的研究上,在植物方面的應(yīng)用報(bào)道較少, 這與植物本身特性有很大關(guān)系[3,12-13]。植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物等方面與動(dòng)物細(xì)胞存在很大差異, 因此, 植物提取細(xì)胞核仍沒(méi)有一個(gè)很完善的方法。植物細(xì)胞不但具有細(xì)胞壁,而且還具有胞間連絲、次生代謝物等, 這些對(duì)植物細(xì)胞核的制備增加了許多困難[14]。提取植物的細(xì)胞核時(shí), 通常采用植物愈傷組織或幼苗等鮮嫩組織作為材料, 如已報(bào)道的玉米提核是采用幼苗和花粉組織[15-16]。在研究中本課題組發(fā)現(xiàn)這種針對(duì)新鮮幼嫩植物組織的提核方法很難適用于其他物種, 可能是與植物類型和植物苗齡不同有關(guān)。為應(yīng)對(duì)不同的科研需求, 本課題組通過(guò)摸索、探究, 成功建立包括小麥(Triticum aestivumL.)、水稻(Oryza sativaL.)和結(jié)縷草(Zoysia japonicaSteud.)在內(nèi)的非幼苗、禾本科植物及不同組織的細(xì)胞核提取方法, 該方法可為更多的植物染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序提核及建庫(kù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻(O. sativa‘Nipponbare’)由北京大學(xué)鄧興旺實(shí)驗(yàn)室何航課題組提供, 結(jié)縷草(Z. japonica‘Compdare’)由北京林業(yè)大學(xué)草坪所提供, 小麥(T. aestivum‘W7984’)由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所李義文課題組提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

細(xì)胞核提取緩沖液(NEB)為200 μL的MOPS溶液(1 mol L-1, pH 7.0), 80 μL的NaCl溶液(5 mol L-1),300 μL的KCl溶液(3 mol L-1), 50 μL的EDTA溶液(500 mmol L-1), 50 μL的EGTA溶液(100 mmol L-1),5 μL的精胺溶液(400 mmol L-1), 13 μL的亞精胺溶液(400 mmol L-1)和200 μL的蛋白酶抑制劑溶液,NEB溶液總體積為10 mL。

細(xì)胞器去除緩沖液(ORB)為1 mL的蔗糖溶液(2.5 mol L-1), 100 μL的Tris-HCl (1 mol L-1, pH 8.0),1 mL的MgCl2溶液(100 mmol L-1), 500 μL的Triton X-100 (20%)和200 μL的蛋白酶抑制劑溶液, ORB溶液總體積為10 mL。

蔗糖緩沖液(SCB)為6.8 mL的蔗糖溶液(2.5 mol L-1), 100 μL的Tris-HCl (1 mol L-1, pH 8.0), 200 mL的MgCl2(100 mmol L-1), 50 μL的Triton X-100 (20%)和200 μL的蛋白酶抑制劑溶液, SCB溶液總體積為10 mL。

1 μg mL-1DAPI溶液, Percoll細(xì)胞分離液(Sigma,貨號(hào) 0219536925)和臺(tái)盼藍(lán)溶液(Eallbio, 貨號(hào)03.13007A)。

1.3 提核方法

參考玉米幼苗提核方法[15], 在此基礎(chǔ)優(yōu)化條件,使其適用于禾本科非幼苗的提核與建庫(kù)。具體試驗(yàn)方法如下: (1) 試驗(yàn)1 h前制備Percoll細(xì)胞分離液梯度緩沖液, 根據(jù)需求將ORB緩沖液與Percoll細(xì)胞分離液按體積2∶3混合制成60%的Percoll混合溶液并靜置; (2) 在冰上的培養(yǎng)皿上放置一片5 cm×5 cm的薄膜, 用移液管將500 μL NEB移到膜上并用刀片在NEB緩沖液中切碎幼苗的葉片, 切碎的組織出現(xiàn)粗漿狀為佳, 此過(guò)程大約需要5 mL NEB緩沖液; (3) 將漿液轉(zhuǎn)移到冰上的小培養(yǎng)皿中, 輕輕攪動(dòng)放置5 min, 在預(yù)冷玻璃漏斗上放置4層過(guò)濾布, 過(guò)濾泥漿至5 mL離心管, 用20 μm的濾池器過(guò)濾粗核懸浮液2次, 去除大的碎片; (4) 將濾液倒入5 mL離心管, 4℃ 800×g離心10 min, 輕輕去除上清液而保留沉淀; (5) 向每個(gè)試管中加入200 μL ORB溶液,靜置2 min, 使沉淀稍分離, 用一把精細(xì)的尼龍刷輕輕地去除沉淀上的綠色層, 保持淺白色的底層不受干擾, 使用移液管輕輕地把綠色沉淀轉(zhuǎn)移到新的試管中, 將綠色沉淀材料重新懸浮在ORB溶液中,用20 μm濾池器過(guò)濾細(xì)胞核懸浮液2次, 去除聚集的細(xì)胞核和碎片; (6) 將400 μL 60% Percoll的混合溶液(步驟3)添加到新的1.5 mL離心管的底部, 使用移液槍小心地將200 μL SCB置于Percoll層下方, 確保2層之間有清晰的界限, 在該P(yáng)ercoll的混合梯度緩沖液中加入約400 μL步驟5中綠色的細(xì)胞核懸浮液, 4 ℃ 1000×g離心15 min; (7) 在Percoll/SCB界面上可以觀察到一層棕白色的沉積層, 它代表了核的量, 小心地將這些細(xì)胞核(約200 μL)轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中, 加入1 mL NEB細(xì)胞核懸浮液, 以500×g離心約10 min, 使細(xì)胞核成團(tuán)沉淀下來(lái); (8)將離心后的沉淀溶解在20 μL NEB溶液中得到最終的分離核溶液, 取離核溶液2 μL, 用NEB溶液稀釋,用DAPI (終濃度: 0.3 μg mL-1)染色, 用臺(tái)盼藍(lán)溶液檢查細(xì)胞核完整性并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分離細(xì)胞核懸浮液中的細(xì)胞核數(shù)量, 計(jì)數(shù)重復(fù)3次, 細(xì)胞核的密度(個(gè) mL-1) = 大方格(0.1 mm3, 即0.1 μL)的細(xì)胞核數(shù)×104; (9) 吸取2500～5000個(gè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL離心管中, 準(zhǔn)備接下來(lái)的文庫(kù)構(gòu)建。

1.4 提核方法優(yōu)化

設(shè)計(jì)試驗(yàn), 確定適用于禾本科植物提核建庫(kù)的方法, 每組試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。具體方案如下:(1) 對(duì)組織處理方法優(yōu)化, 步驟2中分別采用切鮮組織, 研磨新鮮組織和液氮研磨組織的方法提核,步驟4離心速度為800×g, 步驟5使用200 μL ORB緩沖液去除細(xì)胞器; (2) 離心速度優(yōu)化, 步驟2使用液氮研磨組織的方法提核, 步驟4中離心速度分別為800、1000、1200、1400和1600×g提核, 步驟5使用200 μL ORB緩沖液去除細(xì)胞器; (3) 細(xì)胞器去除優(yōu)化, 步驟2使用液氮研磨組織的方法提核, 步驟4中離心速度為1200×g, 步驟5先后按照使用1次200 μL ORB緩沖液去除細(xì)胞器, 使用1次10 mL ORB緩沖液去除細(xì)胞器和使用2次且用量分別為10 mL, 200 μL ORB緩沖液去除細(xì)胞器的方式進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建及庫(kù)檢方法

方法如下: (1) 使用Novoprotein Chromatin Profile Kit for Illumina試劑盒(貨號(hào): N248)進(jìn)行細(xì)胞核片段化及終止, 按說(shuō)明書(shū)配制片段化混合液40 μL重懸5 μL洗滌和裂胞過(guò)的細(xì)胞核, 用移液器輕柔吹打10次混勻細(xì)胞核, 將液體轉(zhuǎn)移到200 μL的PCR管中, PCR儀上37℃反應(yīng)30 min; 片段化結(jié)束后, 向片段化產(chǎn)物中加入10 μL Stop buffer, 移液器吹打5次混勻, 55℃反應(yīng)5 min; (2) 使用Novoprotein Tagment DNA Extract Beads試劑盒(貨號(hào): N245)進(jìn)行純化片段化終止產(chǎn)物, 提前將Tagment DNA Extract Beads從4℃冰箱取出, 渦旋振蕩混勻磁珠, 室溫放置15 min后再次渦旋振蕩混勻磁珠, 并向每管終止后的樣品中加入其2倍體積(100 μL)的磁珠, 吹打混勻, 室溫放置5 min, 將反應(yīng)管短暫離心后置于磁力架上, 使磁珠與液體分離(約5 min,待溶液澄清), 小心吸去上清, 加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠, 加乙醇時(shí)不要擾動(dòng)磁珠, 室溫靜置4 min后,小心吸去上清, 此過(guò)程仍保持反應(yīng)管置于磁力架上(該步驟重復(fù)1次), 保持反應(yīng)管置于磁力架上, 打開(kāi)管蓋, 室溫晾干(4～6 min), 使乙醇充分揮發(fā), 切記磁珠不可干燥過(guò)度, 將反應(yīng)管從磁力架上取下, 每管中加入37 μL Elution buffer, 吹打混勻后室溫放置3 min;通常情況下磁珠均勻的分布于水相中, 如果細(xì)胞數(shù)量比較多, 可能會(huì)出現(xiàn)小粒狀磁珠沉積于管底, 多次吹打之后, 靜置2 min, 再次吹打混勻, 將反應(yīng)管置于磁力架上, 使磁珠與液體完全分離(約2 min,待溶液澄清), 小心吸取35 μL上清至新的無(wú)菌PCR管內(nèi);(3) 使用Novoprotein NovoNGS Index Kit for Illumina試劑盒(貨號(hào)N239)進(jìn)行PCR富集, 按說(shuō)明書(shū)配制試劑與純化后的產(chǎn)物混勻后快速離心, 將管蓋上的液體離心至管中, 放入PCR儀中擴(kuò)增, 水稻進(jìn)行14個(gè)或15個(gè)循環(huán), 小麥進(jìn)行18個(gè)循環(huán), 結(jié)縷草進(jìn)行14個(gè)循環(huán), PCR擴(kuò)增設(shè)置如下: 72℃ 3 min, 98℃ 30 s后進(jìn)入循環(huán)過(guò)程, 循環(huán)數(shù)為8～18次, 循環(huán)設(shè)定為98℃15 s, 60℃ 15 s, 72℃ 8 s, 循環(huán)結(jié)束后72℃ 2 min, 最后10℃保存?zhèn)溆? (4) 使用Novoprotein DNA Clean Beads試劑盒(貨號(hào)N240)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化及文庫(kù)大小分選, 具體操作如說(shuō)明書(shū)所示; (5) 文庫(kù)檢查及測(cè)序, 用Qubit對(duì)文庫(kù)進(jìn)行濃度檢測(cè)、安捷倫2100檢測(cè)文庫(kù); 對(duì)合格文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序, 根據(jù)基因組大小設(shè)計(jì)測(cè)序數(shù)據(jù)量, 水稻測(cè)序數(shù)據(jù)量為10 G, 小麥測(cè)序數(shù)據(jù)量為30 G, 結(jié)縷草測(cè)序數(shù)據(jù)量為6 G (北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行此項(xiàng)操作)。

1.6 ATAC-seq數(shù)據(jù)初步分析

方法如下: (1) 獲得 FASTQ 文件后使用Trimmomatic[17]過(guò)濾掉低質(zhì)量片段, Trimmomatic的使用參數(shù)有--phred33、--LEADING:3、--TRAILING:3、--MINLEN:51; (2) 使用Bowtie 2[18]與小麥(Genome assembly IWGSC CS RefSeq v2.1)、水稻(Genome assembly IRGSP-1.0)、結(jié)縷草(為本課題組裝, 數(shù)據(jù)尚未公開(kāi))的參考基因組進(jìn)行比對(duì), 隨后利用Picard[19]和SAMtools[20]去除重復(fù)的、葉綠體和線粒體的數(shù)據(jù), Bowtie 2的使用參數(shù)有--N 1、--X 2000;Picard的使用參數(shù)有--REMOVE_SEQUENCING_DUPLICATES true; SAMtools的使用參數(shù)有--h, 線粒體葉綠體可以直接用grep -v chrM命令進(jìn)行去除(M代指基因組中的線粒體或葉綠體), 參考基因組下載網(wǎng)址: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/; (3) 使用軟件IGV[21]可對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理;(4) 使用軟件macs2 (version 2.1.0)尋找染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域, macs2的使用參數(shù)有--f BAMPE、--keep-dup all和--cutoff-analysis。

2 結(jié)果與分析

2.1 提核條件優(yōu)化

2.1.1 組織處理方法優(yōu)化 植物組織的處理方法會(huì)極大地影響細(xì)胞核的提取, 在保證初步提核離心力和ORB緩沖液使用量及使用次數(shù)不變的情況下,發(fā)現(xiàn)使用切新鮮組織制備細(xì)胞核的方法, 在提取小麥、水稻和結(jié)縷草細(xì)胞核的混合液中均無(wú)法獲取細(xì)胞核; 采用研磨新鮮組織的方法, 只有水稻的葉片可制備極少量的細(xì)胞核和一些雜質(zhì)(圖1-A); 采用液氮研磨組織制備細(xì)胞核, 發(fā)現(xiàn)小麥、水稻和結(jié)縷草的葉片及根組織均可以制備較多的細(xì)胞核, 但雜質(zhì)很多(圖1-B, 以水稻為例)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞核Fig. 1 Nuclei under optical microscopeA: 研磨新鮮水稻葉片所提取的細(xì)胞核圖(明亮的藍(lán)色小圓點(diǎn)為細(xì)胞核); B: 用液氮研磨水稻葉片所提取的細(xì)胞核圖(明亮的藍(lán)色小圓點(diǎn)為細(xì)胞核)。A: the nuclei extracted by using the leaves of fresh rice (Bright blue dots are nuclei); B: the nuclei extracted by using the leaves of rice with liquid nitrogen (Bright blue dots are nuclei).

2.1.2 離心速度優(yōu)化 離心力太小會(huì)影響細(xì)胞核的沉積, 離心力太大會(huì)造成細(xì)胞核的破碎, 因此離心力的優(yōu)化是細(xì)胞核提取的重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)采用不同的離心力測(cè)試離心力對(duì)制備細(xì)胞核的影響, 如圖所示, 當(dāng)離心力800×g時(shí), 水稻、小麥和結(jié)縷草提取到的細(xì)胞核都較少, 隨著離心力的變大而變多, 當(dāng)離心力達(dá)到1200×g時(shí), 提取的細(xì)胞核的數(shù)量最多, 隨后因細(xì)胞核的破碎細(xì)胞核的數(shù)量又開(kāi)始減少(圖2)。

(圖2)

圖2 不同離心力下提取的細(xì)胞核個(gè)數(shù)Fig. 2 Number of the nuclei extracted under different centrifugal fourcesA: 利用水稻組織提取的細(xì)胞核; B: 利用小麥組織提取的細(xì)胞核; C: 利用結(jié)縷草組織提取的細(xì)胞核。A: the nuclei extracted by using rice tissues; B: the nuclei extracted by using wheat tissues; C: the nuclei extracted by using zoysia tissues.

2.1.3 細(xì)胞器去除優(yōu)化及文庫(kù)構(gòu)建 采用液氮研磨植物組織, 初步提取細(xì)胞核的離心力為1200×g,使用200 μL ORB緩沖液去除細(xì)胞器, 細(xì)胞核經(jīng)提純之后選取適量的細(xì)胞核建庫(kù), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)18個(gè)樣品庫(kù)檢的濃度及文庫(kù)峰圖均不合格, 所制備的細(xì)胞核不符合進(jìn)一步的試驗(yàn)要求, 這可能和提取的核液中雜質(zhì)過(guò)多有關(guān)。

獲得含雜質(zhì)較少的細(xì)胞核是之后試驗(yàn)順利進(jìn)行的必要條件, 去除細(xì)胞器和碎片等雜質(zhì)顯得尤為重要。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在處理樣本方法和離心力一致的條件下, 若多次使用ORB溶液去除細(xì)胞器等雜質(zhì)會(huì)提升細(xì)胞核的純度。以使用水稻葉片提取細(xì)胞核為例, 使用單次200 μL ORB溶液去除細(xì)胞器等雜質(zhì)所獲得的細(xì)胞核溶液中雜質(zhì)含量非常多(圖3-A), 使用單次10 mL ORB溶液去除細(xì)胞器等雜質(zhì)所獲得的細(xì)胞核溶液中雜質(zhì)含量有所減少(圖3-B), 使用2次ORB溶液處理的方法可獲得含雜質(zhì)更少的細(xì)胞核溶液(圖3-C), 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 使用2次ORB溶液處理的細(xì)胞核出現(xiàn)破碎的情況非常少, 符合進(jìn)一步試驗(yàn)要求(圖3-D)。

圖3 不同純化方法下提取的細(xì)胞核Fig. 3 Nucleus extracted by different purification methodsA: 使用單次20 μL ORB緩沖液純化細(xì)胞核; B: 使用單次10 mL ORB緩沖液純化細(xì)胞核; C: 使用2次ORB緩沖液純化細(xì)胞核; D: 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)破碎細(xì)胞。A: the nuclei purified with 20 μL ORB buffer; B: the nuclei purified with 10 mL ORB buffer; C: the nuclei purified with ORB buffer twice; D:the detection of broken nuclei with trypan blue.

選取適量純化后的細(xì)胞核進(jìn)行片段化及DNA提取, 經(jīng)PCR擴(kuò)增和文庫(kù)純化后進(jìn)行文庫(kù)檢查, 結(jié)果表明使用2次ORB溶液去除細(xì)胞器和雜質(zhì)所獲得的細(xì)胞核可以成功建庫(kù)。

綜上所述, 通過(guò)綜合分析影響細(xì)胞核提取的主要因素并進(jìn)行逐一優(yōu)化, 成功確定了適合于非幼苗、禾本科植物的不同組織的提核方法。選用液氮研磨植物樣本, 初步提取細(xì)胞核離心力為1200×g,使用2次ORB溶液進(jìn)行細(xì)胞器去除的提核方法效果最佳, 基于上述優(yōu)化所得到的細(xì)胞核數(shù)量多、活性強(qiáng)、雜質(zhì)少, 滿足建庫(kù)條件且構(gòu)建的文庫(kù)可進(jìn)一步上機(jī)測(cè)序。

2.2 ATAC-seq數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)得的ATAC-seq數(shù)據(jù)初步分析發(fā)現(xiàn), 葉綠體和線粒體等雜質(zhì)的影響較小, 小麥葉片及根部數(shù)據(jù)所鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)目多于已發(fā)表的中國(guó)春小麥(T. aestivum‘Chinese Spring’)鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域[22]的數(shù)目, 染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的位置與已發(fā)表的中國(guó)春小麥鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的位置具有一定的重疊, 所獲得的數(shù)據(jù)滿足進(jìn)一步的分析需求(圖4-A, D, F); 水稻葉片和根部數(shù)據(jù)鑒定到染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)目多于已發(fā)表的水稻定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域[23]的數(shù)目, 染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的位置與已發(fā)表的水稻中鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的位置具有一定的重疊, 所獲得的數(shù)據(jù)滿足進(jìn)一步的分析要求(圖4-B, E, F); 結(jié)縷草葉片和根部數(shù)據(jù)找到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)目及分布也滿足進(jìn)一步的分析要求(圖4-C, F)。

(圖4)

圖4 染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)量及分布情況Fig. 4 Numbers and the distribution patterns of chromatin accessible regionsA: 小麥染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的分布情況; B: 水稻染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的分布情況; C: 結(jié)縷草染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的分布情況; D: 小麥染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的韋恩圖; E: 水稻染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的韋恩圖; F: 鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域數(shù)目。A: the distribution patterns of chromatin accessible regions in wheat; B: the distribution patterns of chromatin accessible regions in rice; C:the distribution patterns of chromatin accessible regions in zoysia; D: Wayne diagram of chromatin accessible regions in wheat; E: Wayne diagram of chromatin accessible regions in rice; F: the number of chromatin accessible regions.

3 討論

提取植物細(xì)胞核是進(jìn)一步研究植物基因的重要基礎(chǔ), 在植物研究中扮演著極為重要的作用。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展, 染色質(zhì)可及性研究的重要性日益凸顯, 染色質(zhì)可及性測(cè)序分析對(duì)于研究表觀遺傳信息調(diào)控過(guò)程有重要意義[24-26]。目前, 已經(jīng)有很多領(lǐng)域都在應(yīng)用ATAC-seq技術(shù), 如通過(guò)該技術(shù)與RNA-seq等其他技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析, 從而從不同角度獲取染色質(zhì)相關(guān)信息, 各分析之間相互補(bǔ)充驗(yàn)證, 更加深入地挖掘基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制,但ATAC-seq的相關(guān)技術(shù)在植物上的應(yīng)用報(bào)道仍舊很少[12-13,15,27-28]。

植物的各個(gè)器官如根、莖、葉及種子等都可以制備細(xì)胞核,但本試驗(yàn)參考的試驗(yàn)方法是適用于玉米幼苗的, 針對(duì)不同的研究目的應(yīng)選用不同的植物組織進(jìn)行提核, 此方法具有一定的局限性。另外當(dāng)面臨大量研究對(duì)象需要提核時(shí), 為了保證處理及取樣時(shí)間一致性, 大多科研工作者會(huì)將研究對(duì)象先保存至-80℃的條件下, 此時(shí)新鮮組織制備細(xì)胞核的方法便不如液氮研磨組織制備細(xì)胞核的方法方便、有效。因此本課題組決定建立一個(gè)適用于非幼苗、非新鮮樣本及不同組織的提核體系。

本試驗(yàn)以水稻、小麥和結(jié)縷草為研究對(duì)象, 這3種植物在禾本科植物里具有一定的代表性, 水稻是一種非常重要的禾本科經(jīng)濟(jì)作物, 是我國(guó)的主要糧食作物, 種植面積比較大, 分布范圍比較廣, 被世界各地廣泛研究[29-30]; 小麥?zhǔn)侨虻闹饕?jīng)濟(jì)糧食作物, 有著極為重要的研究?jī)r(jià)值, 但作為禾本科異源六倍體植物, 其龐大的基因組導(dǎo)致在許多方面研究都會(huì)比其他植物困難[31-32]; 結(jié)縷草是一種重要的草坪草, 因其耐性強(qiáng), 耐踐踏, 無(wú)汁液滲出等特性而廣泛應(yīng)用在高爾夫球場(chǎng)、足球場(chǎng)以及固土護(hù)坡、道路綠化等方面, 但其葉片結(jié)構(gòu)特殊導(dǎo)致其在提取原生質(zhì)體時(shí)較為困難[33]。

使用植物組織提核和建庫(kù)受多因素影響, 包括處理樣本的方式、所提核的狀態(tài)以及溶液中雜質(zhì)的數(shù)量等[14]。處理樣本的方式直接決定是否能制備出細(xì)胞核, 核的狀態(tài)是衡量細(xì)胞核是否可用于后續(xù)研究的重要指標(biāo), 由于ATAC-seq建庫(kù)中的Tn5轉(zhuǎn)座酶非常敏感, 所提核的數(shù)量不合適或核液中葉綠體、線粒體等其他雜質(zhì)過(guò)多都會(huì)造成建庫(kù)的失敗[34]。

在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)本方法同樣適用于擬南芥等非禾本科植物提取細(xì)胞核和構(gòu)建文庫(kù), 對(duì)獲取其他植物染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域信息和深入研究基因表達(dá)調(diào)控方式有一定幫助作用。

4 結(jié)論

在提取多種禾本科植物細(xì)胞核的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用液氮研磨禾本科組織獲得的細(xì)胞核狀態(tài)最佳,在初步提核時(shí)使用1200×g離心力獲得的細(xì)胞核數(shù)量最多, 先后分別使用10 mL、200 μL的ORB緩沖液去除細(xì)胞器所獲得的細(xì)胞核溶液中雜質(zhì)含量最少;對(duì)測(cè)得的ATAC-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), 使用本方法獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高, 葉綠體和線粒體等雜質(zhì)對(duì)數(shù)據(jù)影響較小, 鑒定到的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)目及分布滿足進(jìn)一步分析要求。綜上所述, 本試驗(yàn)所建立的細(xì)胞核提取和建庫(kù)體系適用于多種禾本科植物的染色質(zhì)轉(zhuǎn)座酶可及性測(cè)序研究。