陸夢(mèng)琪謝若涵李 想楊明沖何紫薇高 杰趙曉燕沈祥陵陳 燕王繼斌,5胡利華段明政,*王令強(qiáng),*

1亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 廣西南寧 530004;2廣西大學(xué)計(jì)算機(jī)和信息學(xué)院, 廣西南寧 530004;3貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 / 貴州省旱糧研究所, 貴州貴陽(yáng) 550006;4三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心,湖北宜昌 443002;5貴州茅臺(tái)學(xué)院, 貴州仁懷 564507

高粱(Sorghum bicolor(L.) Moench)是禾本科一年生草本植物, 是C4植物的模式生物, 是全球農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的糧食和飼料作物。高粱用途廣泛,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 是食品、飼料和加工業(yè)的重要原料。全球高粱年種植面積4000多萬(wàn)公頃, 總產(chǎn)約6000萬(wàn)噸[1]。

維管束是指維管植物的維管組織, 由木質(zhì)部和韌皮部成束狀排列形成。維管束為植物體輸送水分、無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì), 在“庫(kù)-源-流”系統(tǒng)中扮演“流”的重要角色[2]。另外, 維管束也為植物提供機(jī)械支撐,與莖稈強(qiáng)度密切相關(guān), 影響作物的抗倒伏性[3-5]。倒伏是影響飼草高粱和甜高粱的穩(wěn)定高產(chǎn)的因素之一[6-7]。在甜高粱中, 倒伏多發(fā)生在開(kāi)花期至成熟期,導(dǎo)致籽粒產(chǎn)量下降并影響莖稈內(nèi)含物的積累, 也不利于收割[7]。在水稻中的研究認(rèn)為, 改善莖葉維管束系統(tǒng)特征, 有利于莖葉同化物轉(zhuǎn)運(yùn)和產(chǎn)量提高[2]。維管束系統(tǒng)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境的脅迫反應(yīng)具有重要作用, 影響作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性[8-10]。

由于大規(guī)模測(cè)定細(xì)胞壁化學(xué)組成和獲取維管束參數(shù)存在困難, 作物的倒伏研究主要局限在莖稈的形態(tài)學(xué)性狀和力學(xué)指標(biāo), 對(duì)莖稈細(xì)胞壁化學(xué)組成和組織解剖學(xué)維管束特征研究較少[5,7]。近年來(lái), 在小麥[11-13]、玉米[14-15]和水稻[16-17]中相繼開(kāi)發(fā)了一些高通量獲取維管束參數(shù)的辦法, 但是高粱中尚未見(jiàn)類似報(bào)道。Kanbar等[10]比較甜高粱KIT1和籽粒高粱Razinieh發(fā)現(xiàn), 大維管束的木質(zhì)部和韌皮部腔面積及其比值存在差異, 可能和甜高粱莖稈的糖分積累有關(guān)。但局限于技術(shù), 該研究只用了2份材料, 也沒(méi)有考慮莖稈本身大小、維管束數(shù)目、類型和分布等因素。高粱莖稈的組織解剖學(xué)特征及其遺傳學(xué)基礎(chǔ)尚缺乏研究, 其主要原因在于缺乏相關(guān)技術(shù)。本研究首次利用Labelme軟件結(jié)合Python語(yǔ)言, 建立高通量獲取高粱維管束數(shù)目、大小和位置相關(guān)的參數(shù)的方法。在此基礎(chǔ)上, 以92份高粱為材料, 初步探討高粱維管束參數(shù)和一些農(nóng)藝學(xué)性狀的關(guān)系, 為深入研究作物維管束的生物學(xué)功能其遺傳機(jī)制建立方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和田間種植

高粱種質(zhì)資源材料共92份, 收集自中國(guó)(四川、貴州、湖南、吉林、遼寧)、美國(guó)和印度等國(guó)家或地區(qū), 具有較好的代表性(表1)。材料在2021年9月12日播種, 育苗移栽后種植于廣西大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)田。每份材料種植2行, 行距0.6 m, 株距0.3 m, 行長(zhǎng)3 m, 3次重復(fù), 水肥管理同大田生產(chǎn)。

表1 本研究種質(zhì)資源材料Table 1 Germplasm resources of this study

1.2 高粱農(nóng)藝性狀的考察

高粱植株成熟后, 考察株高、單株鮮重、穗長(zhǎng)、穗重、一級(jí)枝梗分枝數(shù)和千粒重。考察方法為每個(gè)小區(qū)每份材料選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的10株高粱, 測(cè)量從地面到植株穗頂部的自然高度, 記為株高(cm)。穗尖至穗下葉痕處的距離記為穗長(zhǎng)(cm)。稱量單株鮮重(g)以及穗重(g)。將從主莖上著生的枝梗定為一級(jí)枝梗分枝, 并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。高粱穗人工脫粒后用計(jì)數(shù)板隨機(jī)分出種子數(shù)目, 稱重并計(jì)算千粒重(g)。

1.3 高粱莖稈組織切片染色和圖片獲取

在孕穗期, 截取高粱莖稈上部倒數(shù)第2節(jié)節(jié)間中部徒手切片, 厚度0.2～0.4 mm, 用5%間苯三酚和濃鹽酸染色, 染色時(shí)間15 s, 然后利用OLYMPUS SZ61體視顯微鏡拍照, 放大倍數(shù)為6.7×到15×。獲取圖片數(shù)量為196張, 圖片儲(chǔ)存格式為BMP, 分辨率為1790像素×1370像素。

1.4 利用Labelme標(biāo)注高粱莖稈橫切圖片

使用軟件Labelme對(duì)高粱莖稈切片圖中的維管束以及截面進(jìn)行標(biāo)注。圖片經(jīng)Labelme 標(biāo)注后形成對(duì)應(yīng)的 json 格式文件。該文件將保存每一個(gè)受標(biāo)注對(duì)象的相關(guān)屬性, 包括對(duì)象標(biāo)簽(label)、對(duì)象形狀(shape_type)以及對(duì)象輪廓點(diǎn)(points)。在本次研究中,對(duì)象標(biāo)簽有大維管束、小維管束、莖和空腔4類; 對(duì)象形狀有多邊形和圓形2種; 對(duì)象輪廓點(diǎn)為人工標(biāo)注點(diǎn)對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)集。每個(gè)對(duì)象均為封閉曲線。

1.5 Python代碼處理提取莖稈橫切片參數(shù)

用 Python 導(dǎo)入數(shù)據(jù)后, 先識(shí)別切片圖中的比例尺, 統(tǒng)計(jì)其長(zhǎng)度方向上的像素?cái)?shù)。以比例尺的固定物理長(zhǎng)度除以像素?cái)?shù), 即可得到圖片物理尺寸與像素尺寸的比例, 該比例將用于之后的單位換算。之后, 調(diào)用OpenCV對(duì)json文件進(jìn)行處理。使用OpenCV庫(kù)中的函數(shù)獲得對(duì)象的各項(xiàng)參數(shù), 在像素尺度上用cv2.arcLength()計(jì)算對(duì)象的周長(zhǎng), 用cv2.contourArea()計(jì)算對(duì)象面積, 用cv2.minEnclosingCircle()擬合對(duì)象的最小包圍圓計(jì)算形狀中心與半徑等。由此獲得維管束指標(biāo)初級(jí)數(shù)據(jù), 進(jìn)行單位換算得到包括維管束數(shù)目、面積、距離等性狀的一級(jí)指標(biāo), 并在此基礎(chǔ)上運(yùn)算得到二級(jí)指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)分析與作圖

用Python (版本3.9.12, 下同)與Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析。用Python載入的matplotlib (版本3.5.1)和seaborn (版本0.11.2)繪制熱力圖、散點(diǎn)圖和箱線圖。用R (版本4.1.0)載入的prcomp計(jì)算主成分, FactoMineR (版本2.4)提取主成分方差貢獻(xiàn)率和變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)率, ape (版本5.6-2)繪制環(huán)狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于“LabelmeP1.0”的高粱種質(zhì)資源維管束參數(shù)導(dǎo)出及其描述統(tǒng)計(jì)

利用Labelme標(biāo)注圖片結(jié)合Python編程語(yǔ)言, 建立了高通量導(dǎo)出莖稈組織切片區(qū)域和維管束相關(guān)的參數(shù)的方法, 并命名為“LabelmeP1.0”。具體代碼過(guò)程見(jiàn)鏈接: https://github.com/Joannxxxxx/bioinformatics/blob/main/Sorghum/Labelme_data_output_v1.ipynb。共計(jì)導(dǎo)出27個(gè)指標(biāo), 包括一級(jí)指標(biāo)16個(gè)及其在此基礎(chǔ)上計(jì)算得到的二級(jí)指標(biāo)11個(gè)(表2)。

表2 利用“LabelmeP1.0”導(dǎo)出的參數(shù)和指標(biāo)Table 2 Stem vascular bundle parameters generated by “LabelmeP1.0”

(續(xù)表2)

對(duì)92份高粱種質(zhì)資源的27個(gè)維管束性狀進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)(表3)。一級(jí)指標(biāo)中, 大維管束數(shù)目在89～390個(gè)(平均209), 小維管束數(shù)目在65～282個(gè)(平均173), 大(小)維管束平均面積均值分別為0.023 mm2和0.010 mm2。大(小)維管束離心距均值分別為3.5 mm和4.5 mm。莖直徑均值為9.7 mm, 周長(zhǎng)29.6 mm, 去腔莖面積68.9 mm2?？涨幻娣e均值為1.8 mm2, 近一半材料存在空腔。除大(小)維管束離心距(CV=18%)和小維管束面積(CV=45.4%)外, 大部分一級(jí)指標(biāo)的變異系數(shù)在30%左右, 材料間差異明顯。

表3 高粱種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀和維管束參數(shù)描述統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of vascular bundle parameters and agronomic traits of sorghum germplasm resources

二級(jí)指標(biāo)中, 大維管束數(shù)目占比(占總維管束)在43.8%到65.2%, 絕大部分材料大維管束數(shù)目多于小維管束。大維管束大小是小維管束的1.5～5.0倍。高粱大維管束大而多, 因此其總面積在維管束總面積中占比達(dá)74.7%。皮(周邊厚壁組織)厚度平均0.5 mm,皮面積平均9.2 mm2。大維管束面積占莖比與大維管束面積占內(nèi)環(huán)比2個(gè)性狀相關(guān)性高, 分布相似, 均值分別為7.2%和7.6%。小維管束面積占莖和皮面積的均值分別為2.6%和19.8%。盡管占比較低, 但是材料間小維管束變異大, 疏密不同。大(小)維管束相對(duì)離心距分別為71.6%和93.4%, 材料間差異較小。小維管束周長(zhǎng)密度5.8, 平均每毫米周長(zhǎng)5.8個(gè)。大(小)維管束面積密度均值分別為3.3和19.9。每平方毫米內(nèi)環(huán)區(qū)域平均分布3.3個(gè)大維管束?？涨幻娣e占莖面積的比例較小, 均值為2.7%。大(小)維管束相對(duì)離心距以及大維管束數(shù)目和面積占比的變異系數(shù)均很小(CV=1.6%～10.5%), 說(shuō)明在高粱中不同材料的維管束相對(duì)莖稈中心的位置相對(duì)固定, 大小維管束的比例相對(duì)恒定。推斷莖稈、大小維管束表現(xiàn)出生長(zhǎng)的同步和一致性。其余的二級(jí)指標(biāo)中, 除小維管束面積占莖比變異系數(shù)較大外(CV=52.7%),穩(wěn)定在20%～30%, 表現(xiàn)了適當(dāng)?shù)亩鄻有浴?/p>

考察高粱的主要農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn), 農(nóng)藝性狀數(shù)值分布范圍均較大, 材料間差異顯著。穗重變異系數(shù)最高(CV=72%), 其次為單株鮮重(CV=38.2%), 再次為株高、穗一級(jí)枝梗數(shù)和千粒重(CV=22%～28%), 穗長(zhǎng)離散程度最小(CV=20%)。在維管束性狀的變異系數(shù)和農(nóng)藝性狀基本持平, 但在小維管束性狀上(平均面積、面積占莖比和面積占皮比)都大于除穗重外的農(nóng)藝性狀。性狀基本服從正態(tài)分布, 穗重和空腔出現(xiàn)偏態(tài)分布。

2.2 高粱維管束指標(biāo)相關(guān)性分析和核心指標(biāo)提取

分析了高粱莖稈組織橫切片參數(shù)一級(jí)指標(biāo)的相關(guān)性(圖1)。結(jié)果表明, 莖稈橫切片的直徑、周長(zhǎng)、去腔面積以及大、小維管數(shù)量和離心距顯著正相關(guān)(r=0.97～1.00,P＜0.001)。說(shuō)明莖稈越粗, 維管束數(shù)目也越多, 莖稈和維管束表現(xiàn)橫向同步生長(zhǎng)。大、小維管束也表現(xiàn)較高的一致性, 其數(shù)目間和面積間的相關(guān)系數(shù)分別為0.86 (P＜0.001)和0.67 (P＜0.001)。大(小)維管束面積差別在于大維管束面積和數(shù)目趨勢(shì)一致, 和其他性狀關(guān)聯(lián)較大; 但小維管束面積和其他指標(biāo)關(guān)聯(lián)不大。除空腔面積, 各指標(biāo)間存在不同程度正相關(guān)(P＜0.05), 空腔面積只和小維管束數(shù)目負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。皮面積和皮厚度、莖稈大小、維管束性狀相關(guān), 但和維管束數(shù)目關(guān)系不大。維管束數(shù)目和莖稈粗細(xì)有關(guān), 但不同材料的維管束密度存在差異, 這也是造成維管束數(shù)目差異的原因。

圖1 高粱莖稈維管束參數(shù)一級(jí)指標(biāo)相關(guān)性Fig. 1 Correlation analysis of the primary parameters of stem vascular bundles自由度為90,r0.05=0.205。TALVB: total area of large vascular bundles; CA: cavity area; SA: stem area; LVBD: large vascular bundle distance; SD: stem diameter;NLVB: the number of large vascular bundles; TASVB: total area of small vascular bundles; RA: rind area. df = 90,r0.05= 0.205.

為了更好了解性狀間關(guān)系, 扣除莖稈和目標(biāo)區(qū)域大小的影響, 本研究計(jì)算二級(jí)相對(duì)指標(biāo)并開(kāi)展主成分分析(表4)。前五主成分貢獻(xiàn)率為40.4%、21.8%、10.2%、8.4%和7.1%, 累積方差貢獻(xiàn)率88%, 可代表維管束性狀絕大部份信息。從變量對(duì)各主成分的貢獻(xiàn)率看, 對(duì)PC1作用較大的變量是大(小、總)維管束數(shù)目、莖直徑、莖周長(zhǎng)、去腔莖面積、大維管束離心距和小維管束離心距(表4)?？梢?jiàn), PC1主要反映莖桿粗細(xì)和維管束數(shù)目信息。對(duì)PC2作用較大的變量是大(小)維管束面積占比、小維管束面積占莖(皮)百分比、小維管束相對(duì)周長(zhǎng)的密度。PC2反映小維管束面積和數(shù)量相對(duì)比例(占比)。對(duì)PC3貢獻(xiàn)較大的變量是大(小)維管束平均面積、皮厚度(面積)、大(小)維管束相對(duì)離心距以及(大)小維管束“面積密度”。大(小)維管束相對(duì)離心距與皮厚度高度相關(guān),與小維管束“面積密度”也有一定的相關(guān)性。因此,PC3反映的主要是與維管束和皮的面積, 單位面積的維管束數(shù)目以及維管束的相對(duì)位置信息。PC4主要反映了空腔面積和空腔面積占莖百分比信息。PC5主要反映了大維管束的數(shù)目占比和面積占比(“面積密度”、占莖百分比和占內(nèi)環(huán)百分比)信息。

表4 高粱莖稈維管束參數(shù)(27個(gè))的主成分分析Table 4 Principal component analysis (PCA) of vascular bundle parameters (27) in sorghum

最后, 本研究選取了維管束數(shù)目(大、小、總維管束數(shù)目)、維管束大小(大、小維管束平均面積)、區(qū)域大小(莖直徑、空腔面積和皮厚度)、大小維管束比例(大、小維管束數(shù)目占比和面積占比)、維管束相對(duì)數(shù)量(小維管束周長(zhǎng)密度、大維管束面積密度), 維管束相對(duì)面積(小維管束面積占皮面積百分比、大維管束面積占莖稈百分比)和相對(duì)位置(大維管束相對(duì)離心距)共7類15個(gè)性狀作為核心指標(biāo)(圖2)。

2.3 維管束核心參數(shù)和農(nóng)藝性狀的相關(guān)性

農(nóng)藝性狀之間相關(guān)分析表明, 產(chǎn)量相關(guān)性狀千粒重、一級(jí)枝梗數(shù)和穗重互為顯著正相關(guān)(圖2)。產(chǎn)量性狀也和單株鮮重顯著正相關(guān), 特別是穗重和單株鮮重相關(guān)密切(r=0.73,P＜0.001)。株高和穗長(zhǎng)極顯著正相關(guān), 但和產(chǎn)量性狀顯著負(fù)相關(guān)。穗長(zhǎng)和一級(jí)枝梗數(shù)顯著負(fù)相關(guān), 和株(穗)重極顯著正相關(guān)。

圖2 高粱莖稈維管束核心參數(shù)和農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析熱力圖Fig. 2 Heat map of the correlation between core parameters of stem vascular bundles and agronomic traits in sorghum stem自由度為90,r0.05=0.205。NLVB: the number of large vascular bundles; TALVB: total area of large vascular bundles; LVBD: large vascular bundle distance; SD: stem diameter; NSVB: the number of small vascular bundles; SC: stem circumference; TASVB: total area of small vascular bundles; RA: rind area;CA: cavity area; SA: stem area; PA: parenchyma area. df = 90,r0.05= 0.205.

維管束核心性狀和農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析表明,株高和大(小)維管束數(shù)量、小維管束密度極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01) (圖2和圖3)。株高和空腔面積極顯著正相關(guān)(P＜0.001), 表明株高增加空腔發(fā)生概率。莖稈直徑和維管束數(shù)目與產(chǎn)量重量類性狀(穗重、單株鮮重和千粒重)顯著正相關(guān), 與株高顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.26)。這說(shuō)明維管束數(shù)目越多或莖桿越粗對(duì)產(chǎn)量有利。穗重和單株鮮重均與直徑、大(小)維管束數(shù)目和總維管束數(shù)目顯著正相關(guān)(圖2)。千粒重和空腔面積和一級(jí)枝梗顯著負(fù)相關(guān), 和大(小、總)維管束數(shù)目、小維管束“周長(zhǎng)密度”顯著正相關(guān)。這說(shuō)明維管束大小, 單位周長(zhǎng)和單位皮面積的小維管束數(shù)目與產(chǎn)量相關(guān)性狀密切相關(guān)。值得一提的是, 小維管束與一級(jí)枝梗數(shù)和粒重均密切相關(guān), 而大維管束只和粒重相關(guān)。這可能和大(小)維管束、一級(jí)枝梗的發(fā)育及其物質(zhì)運(yùn)輸功能的差異有關(guān)。

圖3 高粱莖稈維管束參數(shù)和產(chǎn)量相關(guān)性狀的顯著性散點(diǎn)圖Fig. 3 Scatter plots of the significant correlations between vascular bundles parameter and agronomic traits in sorghum stem***、**和*分別表示在0.001、0.01和0.05概率水平差異顯著。***, **, and * indicate significant correlations at the 0.001, 0.01, and 0.05 probability levels, respectively. LVB: large vascular bundles; SVB:small vascular bundles; TVB: total vascular bundles; SC: stem circumference; TASVB: total area of small vascular bundles; RA: rind area.

2.4 品種聚類分析和差異分析

以6個(gè)農(nóng)藝性狀與15個(gè)維管束核心參數(shù)的數(shù)據(jù)正則化處理后聚類分析, 本研究的高粱種質(zhì)資源可分為三大類(圖4)。

圖4 高粱種質(zhì)資源材料聚類分析和代表性材料維管束示例Fig. 4 Clustering analysis of sorghum resources and the vascular bundle of representative materials

第1類材料44份, 表現(xiàn)為株高最矮, 穗重、一級(jí)枝梗數(shù)和千粒重都較小, 維管束數(shù)目較多, 大(小)維管束平均面積都最大, 大維管束數(shù)目和面積占比都最小, 但大維管束面積占莖比與小維管束面積占皮比都最高, 大維管束相對(duì)離心距和莖直徑都較大,皮厚度低, 小維管束“周長(zhǎng)密度”和大維管束“面積密度”都最大, 普遍無(wú)空腔。概括來(lái)說(shuō), 第1類材料矮個(gè)粗莖薄皮, 種子少且輕, 維管束既多又大且密。這其中25份收集自美國(guó)和印度, 10份來(lái)自貴州, 9份來(lái)自中國(guó)北方。第2類材料38份, 除穗重、一級(jí)枝梗數(shù)和千粒重也都較小外, 其他性狀趨勢(shì)正好和第一類材料相反。表現(xiàn)為高個(gè)細(xì)莖, 種子少且輕, 維管束少又小且稀疏, 莖稈普遍有空腔。來(lái)自貴州21份,四川13份。第3類材料10份, 株高較矮, 單株鮮重大、穗重、一級(jí)枝梗數(shù)、粒重最大, 維管束數(shù)目最多, 莖直徑最大, 皮厚度最厚, 小維管束“周長(zhǎng)密度”,最大空腔面積最小?？梢?jiàn), 特點(diǎn)是矮個(gè)粗莖厚皮、種子多而重, 維管束數(shù)目較多、密度較高、面積適中, 普遍無(wú)空腔。7份由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育, 其余均為釀酒型材料(圖5)。

(圖5)

圖5 3類高粱種質(zhì)資源材料性狀差異比較箱線圖Fig. 5 Boxplots for the comparison of the characters of three classes of sorghum resources縮寫(xiě)同表3。Abbreviations are the same as those given in Table 3.

3 討論

3.1 首次建立了基于Labelme標(biāo)注和Python編程導(dǎo)出維管束參數(shù)的方法

莖稈解剖學(xué)特征對(duì)于作物的生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)運(yùn)輸和機(jī)械支撐具有重要作用, 進(jìn)而影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究的主要目的是建立莖稈橫切片維管束和區(qū)域相關(guān)參數(shù)的導(dǎo)出方法。本研究建立的方法穩(wěn)定可靠。如莖面積、莖半徑和莖周長(zhǎng)是用不同的思路不同的函數(shù)獨(dú)立計(jì)算, 但三者呈極顯著相關(guān), 這同時(shí)也證實(shí)了方法的可靠性。在計(jì)算皮的相關(guān)參數(shù)時(shí), 考慮到皮內(nèi)緣不規(guī)則界限不清, 本研究以最外大維管束和最里小維管束的界線作為皮內(nèi)側(cè)邊界的估計(jì)。研究表明皮和產(chǎn)量性狀有關(guān), 取得了較好的研究效果。

此外, 還對(duì)計(jì)算和數(shù)據(jù)進(jìn)行了優(yōu)化。如比較各種面積計(jì)算函數(shù)的優(yōu)劣, 發(fā)現(xiàn)使用幾何方法(通過(guò)cv2.contourArea()函數(shù)基于格林公式進(jìn)行計(jì)算)和使用物理方法(通過(guò)cv2.countNonZero()函數(shù)計(jì)算像素點(diǎn)之和)得到的結(jié)果有所差異。前者精度依賴于輪廓標(biāo)注的精細(xì)程度, 后者更適用于方形輪廓。因此, 可通過(guò)提高標(biāo)注的質(zhì)量, 并根據(jù)對(duì)象形狀選擇合適的函數(shù)可以達(dá)到較好的效果。另外, 由于高粱的維管束數(shù)目眾多, 容許在必要時(shí)可去掉一定比例極端值,去除圖片質(zhì)量和人工誤差等不確定因素引起的可能異常值的干擾, 以得到對(duì)維管束面積的準(zhǔn)確估計(jì)。本方法Labelme標(biāo)注需要一定的工作量, 在以后的研究中可以考慮建立基于深度學(xué)習(xí)的預(yù)測(cè)模型。

3.2 維管束參數(shù)和和農(nóng)藝性狀的關(guān)系

為系統(tǒng)研究參數(shù)間的關(guān)系, 本研究首先盡可能考慮各種參數(shù)可能性, 系統(tǒng)、全面的涵蓋了數(shù)目、大小、位置、相對(duì)比例等各種屬性。除維管束外, 還計(jì)算了空腔、內(nèi)環(huán)、皮厚度、莖稈等各類區(qū)域的面積, 并通過(guò)計(jì)算二級(jí)指標(biāo)扣除莖稈和區(qū)域本身大小影響。隨后, 本研究通過(guò)PCA闡明參數(shù)間關(guān)系, 去除冗余指標(biāo), 最終確定了15個(gè)核心指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)維管束指標(biāo)和農(nóng)藝性狀普遍相關(guān)。如穗重和單株鮮重均與直徑、大(小, 總)維管束數(shù)目、皮厚等指標(biāo)正相關(guān), 說(shuō)明了維管束特征對(duì)于產(chǎn)量性狀的重要性。研究還發(fā)現(xiàn)二級(jí)指標(biāo)具有明確的生物學(xué)意義。如千粒重和小維管束“周長(zhǎng)密度”的相關(guān)極顯著, 超過(guò)和維管束數(shù)目(一級(jí)指標(biāo))的相關(guān)性。一級(jí)枝梗數(shù)也與二級(jí)指標(biāo)小維管束“周長(zhǎng)密度”和小維管束面積占皮百分比顯著正相關(guān), 但和一級(jí)指標(biāo)維管束數(shù)目只有弱相關(guān)。聚類分析發(fā)現(xiàn), 一些二級(jí)指標(biāo)(如大小維管束比例)對(duì)材料具有很好的區(qū)分度。顯然, 本研究開(kāi)發(fā)的指標(biāo), 對(duì)于理解產(chǎn)量的形成具有積極意義。

目前在高粱中缺乏維管束結(jié)構(gòu)特征和產(chǎn)量相關(guān)性狀的研究。最近, Kanbar等[10]比較了甜高粱KIT1和籽粒高粱Razinieh的差異發(fā)現(xiàn), 大維管束韌皮部腔面積、韌皮部腔面積和木質(zhì)面腔面積的比值與甜高粱莖稈的糖分積累正相關(guān)。在小麥中發(fā)現(xiàn), 主莖穗下節(jié)間維管束數(shù)均與籽粒產(chǎn)量、蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)[8]。在水稻中發(fā)現(xiàn), 穗頸中的大(小)維管束數(shù)量與莖葉非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)轉(zhuǎn)運(yùn)顯著正相關(guān),穗頸和劍葉大(小)維管束數(shù)量、橫截面積和韌皮部面積與產(chǎn)量顯著正相關(guān)[2]。整體而言, 本研究結(jié)果和以上水稻和小麥的結(jié)果類似。另外, 前人在水稻中發(fā)現(xiàn)小維管束的數(shù)量、總橫截面積分別與莖鞘NSC轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)實(shí)率、千粒重和產(chǎn)量顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)高于大維管束[9]。而且, 莖鞘NSC和小維管束韌皮部面積顯著正相關(guān), 而和大維管束無(wú)關(guān)。本研究在高粱中也發(fā)現(xiàn), 小維管束對(duì)一級(jí)枝梗數(shù)和粒重均有顯著影響, 大維管束只影響粒重, 推測(cè)小維管束對(duì)產(chǎn)量更為重要。這可能和大(小)維管束發(fā)育和功能差異有關(guān), 值得進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)髓的空腔面積和千粒重和一級(jí)枝梗數(shù)均負(fù)相關(guān), 是產(chǎn)量不利因素, 需要引起關(guān)注。

需要指出, 核心指標(biāo)的選取及其相關(guān)性與作物和材料的類型有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)類I材料盡管莖稈粗、維管束數(shù)目相對(duì)多, 但籽粒產(chǎn)量不大, 可能這一類高粱適合做青儲(chǔ)飼料。而在類II中, 莖稈大小、維管束數(shù)目與籽粒重和一級(jí)枝梗有顯著正相關(guān)。因此, 在分析維管束和農(nóng)藝性狀的關(guān)系時(shí), 收集更多不同類型高粱材料并分類研究, 將有助于得出更加合理的結(jié)論。

4 結(jié)論

基于Labelme標(biāo)注圖片和Python編程語(yǔ)言的方法“LabelmeP1.0”可實(shí)現(xiàn)對(duì)高粱莖稈區(qū)域和維管束相關(guān)的26個(gè)參數(shù)的高通量提取。評(píng)價(jià)了92份高粱種質(zhì)資源的莖稈維管束參數(shù)多樣性及其相互關(guān)系, 總結(jié)了和維管束大小、位置、比例和密度相關(guān)的15個(gè)核心指標(biāo)。維管束性狀(數(shù)目和密度)和農(nóng)藝學(xué)性狀(穗重、粒重和一級(jí)枝梗數(shù))密切相關(guān)。根據(jù)形態(tài)學(xué)、農(nóng)藝性狀和維管束參數(shù)的差異, 本研究將高粱種質(zhì)資源分為三大類, 有助于了解材料的育種前景和用途。