項嘉銘 戴 茜 劉立軍

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖北武漢 430070

大麻(Cannabis sativaL.)是大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)的一年生草本植物, 工業(yè)大麻是指四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol, THC)的含量低于0.3%的大麻, 多用于纖維用途, 也稱火麻或漢麻。中國是世界上最早開始栽培并使用工業(yè)大麻纖維的國家之一, 工業(yè)大麻的纖維產(chǎn)品及其副產(chǎn)品仍在國民生活中發(fā)揮著重要作用[1]。目前, 黑龍江、云南2省均可合法種植工業(yè)大麻, 吉林、山西、安徽等省份的工業(yè)大麻種植面積也很大。

銅(copper, Cu)是一種與人類生活息息相關(guān)的金屬元素, 其延展性、導(dǎo)熱性和導(dǎo)電性極佳, 在自然界中廣泛存在。銅是植物生長的必需元素, 參與植物光合作用、線粒體建成及呼吸作用、碳氮代謝等重要生理過程, 還是乙烯受體的一部分, 有研究指出,植物體內(nèi)超過一半的銅存在于葉綠體中, 參與光合作用[2]。植物體中, 銅與鐵(iron, Fe)的代謝密切相關(guān),都以多種氧化還原態(tài)存在, 可作為電子傳遞鏈的重要輔助因子, 但過量的銅也會對植物造成氧化性損傷[3]。中國是世界上最大的銅生產(chǎn)和消費國[4], 隨著銅的過量開采和使用, 銅尾礦砂及采礦廢水等對銅礦周圍農(nóng)田和土壤均造成極大的重金屬污染, 對作物生長產(chǎn)生惡劣的影響[5]: 環(huán)境中過量的Cu2+會抑制植株生長[6]; 并通過破壞內(nèi)囊體膜結(jié)構(gòu), 影響色素合成等途徑阻礙植株的光合作用[7]。在銅脅迫下,植物在不利的外界條件下生長, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)極易大量累積; 同時, 過量的銅可以通過銅類芬頓反應(yīng)產(chǎn)生ROS, 并與細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器膜發(fā)生膜質(zhì)過氧化反應(yīng)(lipid peroxidation),造成丙二醛(malondialdehyde, MDA)的累積, 產(chǎn)生氧化損傷[8-9]。

黑龍江的銅資源儲量占全國的6.81%, 山西和安徽分別占3.55%和2.17%, 而云南則占了全國的16.60%, 居全國第2位, 這些銅礦資源豐富的省份也恰好是我國工業(yè)大麻的主種植區(qū), 因此, 從云南,甚至是全國范圍來看, 工業(yè)大麻的種植受銅金屬逆境脅迫的影響較大, 探究如何利用栽培措施增強工業(yè)大麻耐銅性具有重要意義。

水楊酸(Salicylic acid, SA)是一種在植物體內(nèi)普遍存在的酚類化合物, 化學(xué)名稱為“鄰羥基苯甲酸”, 生物合成主要包括異分支酸合成酶(isochorismate synthase, ICS)途徑和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase, PAL)途徑2種[10-11]。SA屬于植物的次級代謝產(chǎn)物, 但其能調(diào)控和影響植物的眾多生理過程[12], 施用SA可以促進(jìn)小米的開花過程[13]; 在某些植物的花結(jié)構(gòu)中, SA快速累積,并刺激產(chǎn)熱[14]。SA不僅在植物抗病蟲方面有重要作用, 也參與抵御植物非生物逆境脅迫(如鹽漬、干旱、低溫、重金屬和紫外線等)[15], 提高作物對重金屬脅迫耐性是第一個被證實的SA增強作物應(yīng)對非生物脅迫耐受能力的案例[16]。研究表明, 外源SA可以降低銅脅迫下細(xì)胞液的電導(dǎo)率和透性, 保護細(xì)胞膜的完整性[17], 其機制可能是SA緩解銅脅迫下葡萄糖轉(zhuǎn)入細(xì)胞壁的抑制效應(yīng), 減輕木質(zhì)化, 促進(jìn)植物生長[18], 同時, SA下調(diào)了質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá), 抑制Cu2+的進(jìn)入[19]。此外, 外源SA可誘導(dǎo)銅脅迫下植物體內(nèi)的游離氨基酸和原兒茶酸(protocatechuic acid, PCA)大量累積[20-21], 增強植物的螯合作用; 并增強抗氧化系統(tǒng)[22], 從多維度增強植株對銅脅迫的耐受性。利用SA緩解作物的重金屬毒害作用已成為植物抗逆的熱點之一, 在鎘(cadmium, Cd)、鋅(zinc, Zn)、鎳(nickel, Ni)等重金屬脅迫下進(jìn)行了大量的研究[23-25]。本研究通過對Cu脅迫下云麻1號進(jìn)行外源SA葉面噴施, 探究SA對工業(yè)大麻銅耐性和銅富集能力的影響, 并通過轉(zhuǎn)錄組測序分析外源SA作用的生理生化機制, 篩選、克隆工業(yè)大麻抗銅脅迫基因, 為工業(yè)大麻在銅污染土壤中種植和利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗根據(jù)前人的研究[26], 選擇銅敏感型品種云麻1號(Yunma 1, Y1), 由云南大學(xué)提供。

1.2 試驗方案

1.2.1 外源水楊酸緩解銅脅迫下苗期云麻1號生長抑制試驗 選取均勻飽滿的云麻1號種子, 在水中浸泡12 h后育苗, 當(dāng)大麻苗長至1對真葉時, 將麻苗移入營養(yǎng)液中水培生長, 營養(yǎng)液根據(jù)劉飛虎等[27]的方法配置。麻苗在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中鍛煉至4對真葉時, 進(jìn)行銅-SA雙因素試驗, 其中銅脅迫濃度為50 mg L-1, 即設(shè)置處理為C0S0(無銅處理, 無SA處理)、C0S1(無銅處理, 有SA處理)、C1S0(有銅處理, 無SA處理)和C1S1(有銅處理, 有SA處理),每個處理設(shè)置3次重復(fù)。SA處理濃度為300 μmol L-1,由預(yù)試驗確定, 處理方法為在麻苗脅迫1周后噴施在葉片上, 以葉片滴水為標(biāo)準(zhǔn), 每3 d噴施1次, 共3次, 對照用純水進(jìn)行噴施。在SA處理1周后取樣,測定植株的MDA含量、SOD、POD、CAT活性等指標(biāo)。

留取上述試驗中4個處理葉片鮮樣若干, -80℃冰箱中留存待提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。將各處理葉片RNA作等量混樣, 作為1個生物學(xué)重復(fù),每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 外源水楊酸影響銅脅迫下工業(yè)大麻盆栽試驗

利用銅尾礦砂和普通土壤進(jìn)行盆栽對照試驗,銅尾礦砂取自湖北省陽新縣赤馬山銅礦, 土壤基本信息見表1, 設(shè)置處理為C0S0(普通土, 無SA處理)、C0S1(普通土, 快速生長期SA噴施)、C1S0(銅尾礦砂,無SA處理)和C1S1(銅尾礦砂, 快速生長期SA噴施)。

表1 銅尾礦砂和普通土壤基本信息Table 1 Basic information of copper tailings and common soil

本試驗選用種植盆種植, 在播種前施基肥, 每盆播15粒種子, 留苗5株, 每個處理15盆。在栽培期間的澆水、追肥、除草等皆按照工業(yè)大麻的栽培技術(shù)要點執(zhí)行; SA處理方式為到達(dá)快速生長期時噴施4周, 每周1次, 每次以葉片滴水為標(biāo)準(zhǔn), 其他處理由純水進(jìn)行噴施, 噴施濃度為300 μmol L-1。待工業(yè)大麻達(dá)到工藝成熟期, 收獲麻纖維并測定地上部和地下部干重, 并按地上部、地下部與麻纖維分別烘干、粉碎過篩, 測定銅含量, 計算銅的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)。

1.3 測定方法

1.3.1 抗氧化指標(biāo)測定 本試驗選用蘇州格銳思生物科技有限公司提供的試劑盒, 利用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測定丙二醛(MDA)含量[28]; 利用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[29]: 利用過氧化氫顯色法測定過氧化氫酶(CAT)活性[30]; 利用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[31]。

1.3.2 銅含量及相關(guān)指標(biāo) 銅含量利用硝酸消煮法測定: 植物樣本于消解管中, 每管加入H2O2溶液和硝酸并在微波消解儀中消解干凈, 將消解管內(nèi)剩余溶液用ddH2O定容, 利用安捷倫(Aglient)公司的240FS AA火焰原子吸收光譜儀測定銅含量。

富集系數(shù)(Germination index, GI)=工業(yè)大麻全株銅含量/土壤銅含量

轉(zhuǎn)運系數(shù)(vigor index, VI)=地上部銅含量/地下部銅含量

1.3.3 工業(yè)大麻RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 本試驗利用TRIzol法提工業(yè)大麻的RNA: 葉片在TRIzol下磨勻, 加入氯仿劇烈震蕩后靜置, 離心后吸上層相于異丙醇中, 混勻后靜置; 離心后倒去上清液,加入乙醇, 輕柔混勻后離心; 倒去上清液, 加DEPC水溶解RNA。

選用 Roche公司的 Transcriptor first strand cDNA synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成工業(yè)大麻RNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4 熒光定量PCR 利用前期選定CsCIPK25、CsWRKY32兩個基因進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證抗逆基因表達(dá)分析, 內(nèi)參基因選用CsUBQ, 通過NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)網(wǎng)頁在線設(shè)計qRT-PCR所需的特異性引物, 所用引物見表2。

表2 qRT-PCR所用引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3.5 cDNA文庫構(gòu)建及測序 利用TRIzol法提取滿足測序條件的RNA后, 委托上海派森諾生物科技有限公司對相關(guān)RNA樣品進(jìn)行文庫構(gòu)建, 并在Illumina NovaSeq平臺上進(jìn)行測序, 本試驗選用的參考基因組來自本研究室提供的工業(yè)大麻全長基因組。轉(zhuǎn)錄組測序完成后, 先對原始下機數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行過濾, 將過濾得到的高質(zhì)量序列(Clean data)與工業(yè)大麻參考基因組比對, 進(jìn)一步分析各基因表達(dá)水平的差異, 并作富集分析與聚類分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel、SPSS 16等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析, 采用最小顯著差法(Least significant difference, LSD)以及雙側(cè)t檢驗法比較處理間的差異性。利用GraphPad Prism軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源水楊酸對銅脅迫下苗期云麻1號根系生長的影響

在云麻1號(Y1)苗期水培試驗中, 對脅迫2周(SA噴施1周)的Y1根系進(jìn)行掃描, 結(jié)果如圖1-A,在沒有銅脅迫毒害下, SA的施用對根的生長沒有較大影響; 當(dāng)環(huán)境中存在銅脅迫時, Y1根系生長受強烈抑制, 表現(xiàn)在主根萎縮, 側(cè)根和根毛稀疏; 當(dāng)在銅脅迫下施用SA, 極大地緩解了Cu2+對根生長的毒害作用, 根系生長向正常情況恢復(fù), 主根伸長、側(cè)根和根毛也恢復(fù)生長。

銅脅迫下, 苗期Y1的根長、根表面積、根體積及根尖數(shù)均受到顯著抑制, 而外源SA的施用可以緩解這種抑制效應(yīng), 其中SA施用對銅脅迫下Y1根表面積生長有顯著影響, C1S1根表面積比C1S0增大41.6%; 對根長、根體積及根尖數(shù)影響未達(dá)到顯著,但仍提高87.8%、3.4%及26.8% (圖1-B, C)。

圖1 銅脅迫及水楊酸噴施對苗期云麻1號根系生長的影響Fig. 1 Effects of copper stress and SA spraying on root growth of Yunma 1 at seedling stageC0: 無Cu處理; C1: Cu脅迫; S0: 無SA處理; S1: SA處理。不同小寫字母表示處理間在0.05概率水平差異顯著。C0: no Cu treatment; C1: copper stress; S0: no SA treatment; S1: SA treatment. Different lowercase letters indicate significant differences between the treatments atP＜ 0.05.

2.2 外源水楊酸對銅脅迫下全生育期云麻1號生長的影響

在快速生長期對Y1葉面噴施SA, 在工藝成熟期收獲全株。由圖2可知, 銅脅迫抑制了Y1的生長,植株外觀矮小, 葉片稀疏, 根系生長受抑制; 在無銅脅迫下, SA處理組C0S1外觀與對照C0S0并無明顯差異, 但在銅脅迫下, SA處理組C1S1的生長情況優(yōu)于C1S0, 表明外源SA可以促進(jìn)工業(yè)大麻地上部生長, Cu2+的毒害效應(yīng)得到緩解。

圖2 水楊酸處理對銅脅迫下云麻1號生長的影響Fig. 2 Effects of SA treatment on the growth of Yunma 1 under copper stressC0: 普通土壤; C1: Cu污染土壤; S0: 無SA處理; S1: SA處理。不同小寫字母表示處理間在0.05概率水平差異顯著。C0: the ordinary soil; C1: copper tailings sand; S0: no SA treatment; S1: SA treatment. Different lowercase letters indicate significant differences between the treatments atP＜ 0.05.

由表3可知, 在相同的SA處理下, 種植于銅污染土壤的Y1所有指標(biāo)均小于種植于普通土壤的,大部分差異顯著, C0S0與C1S0的株高和地上部干重差異達(dá)到極顯著, 表明銅脅迫對工業(yè)大麻的生長具有較強的抑制作用。

表3 外源水楊酸對銅脅迫下云麻1號生長的影響Table 3 Effects of exogenous SA on the growth of Yunma 1 under copper stress

對種植于普通土壤的處理進(jìn)行分析, 噴施SA處理的Y1株高、莖粗、地上與地下部干重分別提高0.68%、9.46%、4.85%、9.09%, 但差異不顯著。對種植于銅污染的處理進(jìn)行分析, 外源SA處理緩解了因銅脅迫帶來的生長抑制效應(yīng), Y1株高、莖粗、地上與地下部干重分別提高33.31%、20.92%、116.57%、34.55%, 顯著提高工業(yè)大麻銅耐性。

2.3 外源水楊酸對銅脅迫下云麻1號活性氧清除系統(tǒng)的影響

在Y1苗期水培試驗中, 對4個處理工業(yè)大麻的MDA含量進(jìn)行測定, 結(jié)果如圖3。銅脅迫下C1S0處理的MDA含量顯著高于其他3個處理, 約為對照的2.26倍; C0S1與對照的MDA含量無顯著差異, 表明外源施用SA不會對工業(yè)大麻造成損傷。而銅脅迫下利用外源SA處理能顯著降低作物體內(nèi)的MDA水平, C1S1的MDA含量與無脅迫組無顯著差異, 處于同一水平。

圖3 外源水楊酸對銅脅迫下苗期云麻1號活性氧清除系統(tǒng)的影響Fig. 3 Effects of exogenous SA on reactive oxygen species scavenging system of Yunma 1 at seedling stage under copper stress處理同圖1。不同小寫字母表示處理間在0.05概率水平差異顯著。Treatments are the same as those given in Fig. 1. Different lowercase letters indicate significant differences between the treatments atP＜ 0.05.

對苗期Y1體內(nèi)SOD、POD和CAT活性進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn), 銅脅迫下苗期Y1的SOD活性顯著高于無脅迫組, 且C0S0和C0S1無顯著差異, 表明在銅脅迫下SOD活性提高以消除過量的ROS; 在SA處理下,Y1體內(nèi)SOD活性進(jìn)一步提高, 達(dá)到C1S0的1.13倍,差異顯著。相比于其他3組處理, 脅迫組C1S0的POD和CAT活性都顯著降低, 其中POD活性為對照的23.6%, CAT活性僅為對照的19.3%。C0S1與對照相比, 其POD和CAT活性沒有顯著差異, 表明在沒有脅迫的情況下, 外源施用SA不會對作物的活性氧清除系統(tǒng)有太大影響。在銅脅迫下施用SA可以顯著提高活性氧清除系統(tǒng)的清除能力, 是C1S0的4.82倍; 而CAT活性顯著低于無脅迫組, 但仍高于C1S0,是其的2.02倍, 達(dá)到顯著。

2.4 外源水楊酸對銅脅迫下云麻1號銅富集的影響

盆栽條件下, 收獲工藝成熟期Y1全株, 并分別測定各部位含量, 結(jié)果如圖4。C1S0處理地上部銅含量顯著高于其他處理, 約為對照的1.85倍, 而其他處理之間無顯著差異, 可見外源SA處理可以顯著降低工業(yè)大麻地上部銅含量, C1S1僅為C1S0處理的55.1%。從地下部銅含量來看, 銅脅迫下生長的工業(yè)大麻根系累積了高濃度的Cu2+, C1S0處理的銅含量約為對照的14.8倍; 而外源SA處理可以進(jìn)一步增強工業(yè)大麻根系在銅尾礦砂土中富集銅的能力,C1S1相比無SA處理組(C1S0)提高113.0%; 而在普通土壤種植的工業(yè)大麻SA處理后根系銅含量與對照無顯著差異。

圖4 外源水楊酸對銅脅迫下云麻1號銅富集的影響Fig. 4 Effects of exogenous SA on copper enrichment in Yunma 1 under copper stressACC: 地上部銅含量; UCC: 地下部銅含量; ACA: 地上部銅累積量; UCA: 地下部銅累積量; FCC: 纖維銅含量; GI: 富集系數(shù);VI: 轉(zhuǎn)運系數(shù)。處理同圖2。不同小寫字母表示處理間在0.05概率水平差異顯著。ACC: the above-ground Cu content; UCC: under-ground Cu content;ACA: the above-ground Cu accumulation; UCA: under-ground Cu accumulation; FCC: fiber Cu content; GI: the germination index; VI:vigor index. Treatments are the same as those given in Fig. 2. Different lowercase letters indicate significant differences between the treatments atP＜ 0.05.

由于各處理地上部銅含量差異不大, 而普通土壤種植的Y1生物量高于銅尾礦砂土中種植的, 因此銅累積量無明顯規(guī)律, 需結(jié)合生物量和銅含量共同分析, 其中C1S1處理地上部銅累積量最低, 是對照的59.4%, 表明快速生長期噴施SA可能通過減小地上部銅累積增強植株耐銅性。從地下部銅累積量來看, 銅脅迫下Y1根系銅累積量顯著高于無脅迫處理, C1S1銅累積量約為C1S0處理的2.27倍, 差異達(dá)顯著。該種植模式下收獲的各處理麻纖維銅含量差異不大, 僅C1S0處理顯著高于其他處理, 其余差異均未達(dá)到顯著, 以C1S1最低, 是對照C0S0處理的35.3%, 證明快速生長期噴施SA抑制了Cu2+在工業(yè)大麻麻纖維中的富集。

分析外源SA施用對Y1銅富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響: 對比C1S0, SA處理提高了工業(yè)大麻對環(huán)境中銅的富集能力, 提高富集系數(shù)到120.3%, 但未達(dá)到顯著; 對轉(zhuǎn)運系數(shù)來說, C1S1處理顯著提高工業(yè)大麻根系對環(huán)境銅的吸收和富集能力, 而地上部積累量則差異不大, 因此轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著低于C1S0。

2.5 水培條件下外源水楊酸對銅脅迫下云麻1號轉(zhuǎn)錄組的影響

2.5.1 外源水楊酸影響銅脅迫下云麻1號差異基因表達(dá)分析 利用DESeq對差異基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖5-B: 與對照處理C0S0相比, 僅用SA處理組C0S1有4115條基因顯著上調(diào), 2711條基因顯著下調(diào), 而銅脅迫組C1S0、C1S1顯著上調(diào)的基因分別有6111條和5817條, 顯著下條的基因有4971條和4370條。同為銅脅迫下的處理, C1S0和C1S1相比有2910條基因顯著上調(diào), 2640條基因顯著下調(diào)。

總的來看, 對照組與C1S0和C1S1兩組處理間的差異基因較多, 而這2組處理相比差異基因則少于其他處理的對比, 說明造成基因表達(dá)差異的首要誘因是外界過量的銅毒害造成的。

利用維恩圖對不同處理間差異基因表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖5-A, C)發(fā)現(xiàn), 僅因SA處理而特有的差異基因數(shù)為576; 在銅脅迫下特有的差異基因數(shù)為951; 在銅脅迫下, 由SA處理誘導(dǎo)的差異基因數(shù)為384; 在外源SA處理下, 由銅脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的差異基因數(shù)為456; 所有處理間共有的差異基因數(shù)量為147。

圖5 銅脅迫及水楊酸噴施對苗期云麻1差異基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of copper stress and SA spraying on the differentially expressed genes of Yunma 1 at seedling stageA: 轉(zhuǎn)錄組測序各處理間差異基因表達(dá)情況; B: 外源水楊酸對銅脅迫下工業(yè)大麻差異基因表達(dá)的影響; C: 轉(zhuǎn)錄組測序所有處理間差異基因表達(dá)情況。處理同圖1。A: Differential gene expression among treatments in transcriptome; B: Effects of exogenous SA on differential gene expression of industrial hemp under copper stress; C: Differential gene expression among all treatments in the transcriptome. Treatments are the same as those given in Fig. 1.

2.5.2 差異表達(dá)基因GO功能富集分析 對照組與C1S0之間的差異表達(dá)基因共注釋富集到4651個GO條目, 結(jié)果如圖6-A。其中在上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15個GO條目中, 細(xì)胞組分有7個, 主要涉及核糖體; 分子功能有2個, 主要涉及結(jié)構(gòu)分子活性和核糖體結(jié)構(gòu)成分; 生物過程有6個, 主要涉及肽代謝、翻譯及生物合成等過程。在下調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15個GO條目中, 細(xì)胞組分有5個, 主要涉及光系統(tǒng)II析氧復(fù)合物; 分子功能有3個, 主要涉及焦磷酸酶活性、?；o酶A脫氫酶活性和磷酸酯水解酶活性; 生物過程有7個, 主要涉及支鏈氨基酸分解代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)以及去磷酸化。

對C0S0vs C1S0間的差異表達(dá)基因顯著性最強的部分條目作topGO分析發(fā)現(xiàn), 在銅脅迫作用下,差異表達(dá)基因主要富集在α-氨基酸分解代謝和4-磷酸赤蘚糖/磷酸烯醇丙酮酸家族氨基酸代謝, 并共同指向L-苯丙氨酸代謝過程; 其次, 富集結(jié)果顯示工業(yè)大麻的銅抗性與肉桂酸生物合成和核糖體相關(guān);第三, 分子功能中差異表達(dá)基因顯著富集在苯丙氨酸解氨酶活性與氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性條目上。

C1S0與C1S1之間的差異表達(dá)基因共注釋富集到3731個GO條目, 結(jié)果如圖6-B。其中在上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15個GO條目中, 分子功能有5個, 主要涉及葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性、木葡聚糖: 木葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性; 生物過程有10個, 主要涉及木葡聚糖代謝、光合作用、半纖維素代謝和細(xì)胞壁大分子代謝。在下調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15個GO條目中, 細(xì)胞組分有7個, 主要涉及無膜細(xì)胞器;生物過程有6個, 主要涉及核糖體生物合成、核糖核蛋白復(fù)合物生物合成和有機氮化合物生物合成。

圖6 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig. 6 GO analysis of differentially expressed genesA: C0S0vs C1S0-GO; B: C1S0vs C1S1-GO。處理同圖1。Treatments are the same as those given in Fig. 1.

對C1S0vs C1S1間的差異表達(dá)基因顯著性最強的部分條目作topGO分析發(fā)現(xiàn), 在銅脅迫作用下,外源SA處理下的工業(yè)大麻差異表達(dá)基因主要通過影響半纖維素和木葡聚糖代謝調(diào)控細(xì)胞壁的多糖代謝過程, 對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)造成改變; 其次富集在葉黃素代謝和磷脂酰膽堿生物合成過程條目; 在MF中差異表達(dá)基因顯著富集在果糖二磷酸醛縮酶活性、葡萄糖苷酶活性、木葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性和氧化還原酶活性條目上。

2.5.3 差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析 對照組與C1S0之間的差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中共注釋富集到126條代謝通路, 其中在上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15條代謝通路中(圖7-A), 3條屬于遺傳信息處理, 主要涉及核糖體以及RNA降解;12條屬于新陳代謝, 主要涉及苯丙氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝以及異喹啉生物堿合成。在下調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15條代謝通路中, 1條屬于遺傳信息處理, 涉及泛素介導(dǎo)的蛋白水解; 2條屬于細(xì)胞過程, 主要涉及過氧化物酶體和細(xì)胞自噬;12條屬于新陳代謝, 主要涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解以及乙醛酸和二羧酸代謝。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig. 7 KEGG analysis of differentially expressed genesA: C0S0vs C1S0-KEGG; B: C1S0vs C1S1-KEGG。處理同圖1。Treatments are the same as those given in Fig. 1.

C1S0與C1S1之間的差異表達(dá)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中共注釋富集到121條代謝通路, 結(jié)果如圖7-B。其中在上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15條代謝通路中(圖7-B), 1條屬于組織系統(tǒng), 涉及植物晝夜節(jié)律; 14條屬于新陳代謝, 主要涉及苯乙醛酸和二羧酸代謝、光合生物中的碳固定以及類胡蘿卜素生物合成。在下調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集的15條代謝通路中, 4條屬于遺傳信息處理, 主要涉及核糖體及RNA降解; 新陳代謝中主要涉及半胱氨酸和蛋氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝以及氨基糖和核苷酸糖代謝。

2.6 水培條件下外源水楊酸處理對銅脅迫下苗期云麻1號抗性基因表達(dá)的影響

CIPKs是指作物CBL互作絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 與鈣調(diào)磷酸酶B蛋白CBLs互作, 調(diào)節(jié)作物Ca2+的信號傳導(dǎo), 通過對離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、植物激素和轉(zhuǎn)錄因子等的調(diào)控增強作物應(yīng)對非生物脅迫的耐受性[32]。由圖8可知,CsCIPK25在C0S1和C1S1中表達(dá)水平接近, 分別為對照的4.2倍和3.8倍, 在C1S0中表達(dá)水平僅為對照的2.2倍。表明外源SA和銅脅迫均能提高工業(yè)大麻CsCIPK25的表達(dá)水平,且SA對其表達(dá)水平的提高更大。

圖8 水楊酸處理對銅脅迫下云麻1號基因表達(dá)影響Fig. 8 Effects of SA treatment on the differentially expressed genes of Yunma 1 under copper stress處理同圖1。不同小寫字母表示處理間在0.05概率水平差異顯著。Treatments are the same as those given in Fig. 1. Different lowercase letters indicate significant differences between the treatments atP＜ 0.05.

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一, 除對作物生長發(fā)育的調(diào)控外[33], WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以增強作物對多種生物或非生物脅迫的耐受性[34]。在無銅脅迫情況下, 施用SA對CsWRKY32基因表達(dá)水平無顯著影響; 銅脅迫逆境下,CsWRKY32表達(dá)水平下調(diào), 僅為對照的59.0%, 但仍未達(dá)到顯著差異。銅脅迫下施用SA使工業(yè)大麻CsWRKY32基因表達(dá)水平顯著提高, 是對照的2.3倍,C1S0處理的3.9倍, 表明CsWRKY32基因可能是銅脅迫下特異性響應(yīng)SA表達(dá)的抗性基因。

3 討論

3.1 云麻1號對銅毒害的生理響應(yīng)

銅作為人類歷史發(fā)展和科技進(jìn)步中不可或缺的重金屬材料, 其多年來的廣泛使用也帶來廣域性的嚴(yán)重銅污染; 銅是植物生長所需的基礎(chǔ)元素, 但過度的銅污染將嚴(yán)重阻礙高等植物對其他營養(yǎng)元素的吸收利用, 破壞植物體內(nèi)正常的組織結(jié)構(gòu)和功能,抑制植物生長[35], 銅也將經(jīng)可食用作物被人體富集,帶來健康風(fēng)險[36]。

水培條件下, 銅脅迫導(dǎo)致工業(yè)大麻主根縮小、變細(xì), 大部分根毛凋亡、零落, 整體根系呈淺灰色,根尖淡藍(lán)色。盆栽試驗表明根系是Cu2+吸收和儲存的主要場所, 因此, 銅脅迫下工業(yè)大麻根系的損傷極有可能是儲存在根系的過量Cu2+引發(fā)的毒害。此外, 有研究指出[37-38], 作物應(yīng)對重金屬脅迫的重要機制是加強根系對Cu2+的固定作用, 通過螯合作用等途徑降低Cu2+的生物毒性, 并阻止Cu2+向地上部運輸, 這也與本試驗結(jié)論不謀而合。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步猜想, 吸收器官在積蓄大量Cu2+后, 作物可能通過控制其凋亡來有效降低總銅含量, 防止銅造成更深的傷害, 并減少對環(huán)境中Cu2+的吸收, 保護其余組織正常生長。盆栽試驗中的根系生長也符合這一規(guī)律。

在銅脅迫下, 植株吸收的Cu2+除部分被螯合運輸進(jìn)液泡外, 其他將對細(xì)胞膜、細(xì)胞器及蛋白質(zhì)、DNA等大分子造成損傷, 并產(chǎn)生ROS, 造成氧化損傷[39]。在水培試驗中, 當(dāng)ROS產(chǎn)生速率大于抗氧化系統(tǒng)的清除速率, ROS在植株體內(nèi)積郁, 并造成進(jìn)一步的損傷; 在長時間的氧化損傷后, 作物抗氧化系統(tǒng)受損, ROS清除能力變?nèi)? 抗氧化酶活性顯著降低。當(dāng)植株處于重金屬脅迫時, 體內(nèi)ROS發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用, 產(chǎn)生MDA, 因此MDA的含量可作為作物受環(huán)境脅迫程度的標(biāo)志[40]。在銅脅迫下, 苗期工業(yè)大麻POD和CAT活性顯著低于對照, MDA大量累積, 這也是銅脅迫下工業(yè)大麻生長發(fā)育受抑制, 各項生理指標(biāo)及生長情況顯著低于對照的內(nèi)在原因之一。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋表明, 銅脅迫顯著抑制了焦磷酸酶和?；o酶A脫氫酶的活性,并抑制工業(yè)大麻的光合作用: 焦磷酸酶被證實與磷運輸和代謝相關(guān), 并通過調(diào)控磷對植物生長發(fā)育和抗逆產(chǎn)生影響[41], 在苧麻中發(fā)現(xiàn), 一種液泡膜質(zhì)子焦磷酸酶基因表達(dá)受鎘脅迫誘導(dǎo), 促進(jìn)作物對Cd2+的區(qū)隔化作用, 增強鎘耐性[42]; ?；o酶A脫氫酶與脂肪酸降解和線粒體的電子傳遞鏈相關(guān)[43]。工業(yè)大麻應(yīng)對銅脅迫的重要機制之一即促進(jìn)4-磷酸赤蘚糖/磷酸烯醇丙酮酸家族氨基酸代謝, 而4-磷酸赤蘚糖是苯丙氨酸合成的底物, 因此苯丙氨酸的合成和代謝受調(diào)控, 并提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性,PAL特異性催化苯丙氨酸生成反式肉桂酸, 由肉桂酸轉(zhuǎn)化的肉桂醛是木質(zhì)素的重要底物[44], 綜上, 工業(yè)大麻可能通過改變木質(zhì)素的含量和組分, 影響對Cu2+的固化和運輸來抵御銅脅迫。此外, 研究表明作物體內(nèi)PAL活性受外源SA調(diào)控[45], 青稞中發(fā)現(xiàn)PAL基因可與其他抗性基因協(xié)同增強作物鎘耐性[46]。

3.2 外源水楊酸對云麻1號銅毒害的緩解效應(yīng)

水楊酸(SA)是植物重要的激素和信號分子, 參與調(diào)控植物從生長發(fā)育到抗逆免疫的眾多生理過程。在外源SA增強鎘耐性的研究中指出, 外源SA對耐性影響具有劑量依賴性, 且不同處理方法所需劑量和效果各有差異, 其中以根系吸收效果較好,浸種及葉面噴施所需劑量更大[23]。本研究為貼近實際生產(chǎn)情況, 選用葉面噴施法。對銅脅迫下Y1作外源SA處理, 其生長抑制情況得到明顯緩解。

許多研究指出, 外源SA增強作物重金屬脅迫耐受性的重要機制是調(diào)節(jié)根系對環(huán)境中重金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運, 依據(jù)作物種類不同一般有2種調(diào)節(jié)機制。第一種機制是外源SA抑制作物對重金屬離子的吸收和貯存, 如用外源SA噴施銅脅迫下菊芋幼苗, 根、莖、葉中的銅含量顯著下降, 生長抑制得到緩解[47], 細(xì)胞壁是作物固定重金屬離子的重要場所, 外源SA可以促進(jìn)細(xì)胞壁的多糖合成, 調(diào)節(jié)果膠甲基化, 使細(xì)胞壁變厚, 阻止重金屬進(jìn)入植物細(xì)胞[48]。另一種調(diào)節(jié)機制正好相反, Zhang等[49]發(fā)現(xiàn)在對鎘脅迫下的油菜施加外源SA后, 谷胱甘肽和其他植物螯合素的生物合成途徑被激活, 對鎘的螯合固定增強, 油菜鎘耐性和鎘累積量顯著提高。盆栽試驗中, 在快速生長期噴施SA, 增強工業(yè)大麻根系對Cu2+的吸收和固定, 這種固定作用可能通過激活螯合作用實現(xiàn); 并促進(jìn)植株生長。

外源SA應(yīng)對重金屬脅迫的另一有效機制是增強作物ROS清除系統(tǒng)能力, 減少氧化損傷[50]。在本試驗中, 外源SA促使銅脅迫下苗期工業(yè)大麻POD活性恢復(fù)到正常水平, CAT和SOD活性也有顯著提高; 當(dāng)抗氧化酶活性升高后, ROS被清除, MDA水平顯著降低, 作物受銅脅迫引起的氧化損傷得到緩解。

外源SA處理可以增強工業(yè)大麻對銅毒害的耐性, topGO分析表明, 外源SA顯著影響半纖維素和木葡聚糖的代謝, 而這兩者是組成細(xì)胞壁的重要多糖, 研究表明, 細(xì)胞壁中的多糖是應(yīng)對重金屬脅迫和固定重金屬離子的重要組分, 半纖維素的上升極大促進(jìn)作物對Cd2+的固定效應(yīng), 增強作物鎘耐性[51],因此, 外源SA可能通過改變細(xì)胞壁多糖含量, 促進(jìn)胞壁對Cu2+的吸收固定來增強銅耐性。此外外源SA顯著影響果糖二磷酸醛縮酶和葡萄糖苷酶活性,其中果糖二磷酸醛縮酶與光合作用和非生物脅迫相關(guān)[52], 而葡萄糖苷酶參與細(xì)胞壁形成, 并可增強作物對逆境的耐性[53]。最后, 外源SA顯著增強了氧化還原酶活性, 消除累積的ROS。除此之外, 有意思的是僅用外源SA處理同樣顯著增強PAL活性, 而PAL途徑是植物內(nèi)源SA合成的重要途徑, 因此, 外源SA的施用可能促進(jìn)工業(yè)大麻內(nèi)源SA的合成, 類似現(xiàn)象也在El-tayeb等[20]的研究中被觀測到。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn),銅脅迫顯著抑制過氧化物酶體條目, 而過氧化物酶體不僅可以消除植株體內(nèi)ROS, 同時是ROS水平的感受器和ROS信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)物質(zhì)[54], 故銅脅迫下工業(yè)大麻受到更大氧化損傷。銅脅迫下施用外源SA顯著促進(jìn)光合作用中的碳固定以及類胡蘿卜素生物合成通路, 提高光合作用效率和物質(zhì)累積速率, 增強銅耐性。

3.3 外源水楊酸對銅脅迫下抗性基因表達(dá)的影響

外源SA和銅脅迫對作物的影響是復(fù)雜而多層次的, 且都能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)對作物生長產(chǎn)生影響。本試驗篩選出CsCIPK25和CsWRKY32這2個響應(yīng)外源SA增強工業(yè)大麻銅耐性的抗性基因。有報道稱在擬南芥中過表達(dá)AtCIPK2或HsCIPK2可以增強種子及根系對重金屬汞、銅、鎘的耐受性[55]。本試驗中, 所有處理下CsCIPK25表達(dá)水平均顯著高于對照, 但外源SA處理下表達(dá)水平更高, 表明CsCIPK25可能受銅脅迫與SA雙重誘導(dǎo),且SA對其影響更強。在銅脅迫下,TaWRKY74表達(dá)顯著提高, 并誘導(dǎo)TaGST1表達(dá), 促進(jìn)作物GSH累積, 緩解銅毒害[56]; 還有研究表明,MdWRKY11可以直接促進(jìn)銅脅迫下銅轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 增強銅耐性[57]。本試驗中,CsWRKY32表達(dá)受抑制, 而施用外源SA后表達(dá)顯著提高, 表明CsWRKY32受到銅脅迫下外源SA的特異性誘導(dǎo)而表達(dá), 并可能通過調(diào)控對Cu2+的吸收、轉(zhuǎn)運和固定來增強銅耐性。

綜上所述,CsCIPK25和CsWRKY32表現(xiàn)出極大的銅脅迫抗性基因潛力, 在銅脅迫下施用外源SA,可以特異性誘導(dǎo)表達(dá), 并通過調(diào)控作物離子轉(zhuǎn)運、銅吸收固定、金屬螯合物合成等多種途徑增強銅脅迫下工業(yè)大麻的銅耐性。

3.4 外源水楊酸對云麻1號銅富集的影響

隨著金屬礦石的開采和冶煉, 重金屬污染日趨嚴(yán)重; 工業(yè)大麻具有生物量大, 抗逆性強, 不進(jìn)入食物鏈等優(yōu)良特性, 具有極大的重金屬污染土壤修復(fù)潛能[58]。有多項研究證實工業(yè)大麻可吸收土壤、污水或固體廢棄物中的Cu2+, 并富集在根系中, 有的還會被轉(zhuǎn)運至其他器官(莖、葉、種子等), Cu2+的轉(zhuǎn)運與否可能與工業(yè)大麻品種高度相關(guān)[59]。在當(dāng)前的研究中, 應(yīng)努力提高工業(yè)大麻在銅脅迫下的耐受能力, 提高對Cu2+的富集并避免Cu2+向纖維、花葉、種子等器官轉(zhuǎn)運, 增強工業(yè)大麻對銅污染土壤的修復(fù)力, 提高修復(fù)過程中的經(jīng)濟效益。許多研究者致力于利用外源物質(zhì)增強重金屬脅迫耐性和富集能力[60-61], 而外源SA可以調(diào)控作物根系對重金屬離子的吸收和固定, 因此, 利用外源SA增強工業(yè)大麻在銅污染土壤的生物修復(fù)能力具有應(yīng)用前景。

在本試驗中, 銅尾礦砂種植的工業(yè)大麻地下部銅含量遠(yuǎn)高于普通土壤種植的, 最高可達(dá)對比組的1610.1%, 可見工業(yè)大麻具有較強的銅吸收能力; 此外, 外源SA可以抑制Cu2+從地下部向地上部轉(zhuǎn)運。許艷萍等[62]發(fā)現(xiàn), 工業(yè)大麻在苗期對銅的轉(zhuǎn)運能力較強, 在工藝成熟期轉(zhuǎn)運能力較弱, 我們認(rèn)為C1S1處理中地上部銅含量低是外源SA刺激與工業(yè)大麻本身銅轉(zhuǎn)運規(guī)律共同形成的。

作物銅累積量由銅含量與干物質(zhì)量兩部分決定,由于工業(yè)大麻對銅的轉(zhuǎn)運能力較弱, 所以在不同土壤和處理下地上部銅含量差異較小。從地下部銅累積量來看, 由于快速生長期噴施SA帶來更大的生物量, 因此C1S1處理下工業(yè)大麻銅累積量更大, 這也與Zhang等[49]在外源SA增強作物鎘富集試驗中的結(jié)論類似。

對銅污染下麻纖維的銅含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),C1S1處理下麻纖維銅含量最低, 這可能是快速生長期噴施SA帶來的銅轉(zhuǎn)運抑制造成的結(jié)果。綜上所述, 外源SA處理確實能增強工業(yè)大麻在銅污染環(huán)境下的適應(yīng)能力并促進(jìn)根系對Cu2+的富集和固定,具有很好的環(huán)境修復(fù)前景。

4 結(jié)論

銅脅迫對工業(yè)大麻具有明顯毒害作用, 通過抑制根系營養(yǎng)吸收功能造成全株生長緩慢; 破壞活性氧清除系統(tǒng), 導(dǎo)致工業(yè)大麻ROS和MDA累積, 造成氧化損傷。外源SA降低了麻纖維銅含量, 并顯著增強了工業(yè)大麻根系對環(huán)境中Cu2+的吸收和固定,地下部銅含量是對比組的1610.1%, 銅累積量是對比組的857.1%, 這可能是通過提高半纖維素和木葡聚糖的代謝及葡萄糖苷酶的活性來完成的。外源SA顯著影響銅脅迫下工業(yè)大麻果糖二磷酸醛縮酶活性、光合作用中的碳固定以及類胡蘿卜素生物合成通路, 促進(jìn)作物光合作用和干物質(zhì)累積, 增強耐銅性; 外源SA顯著增強了銅脅迫下工業(yè)大麻氧化還原酶的活性, 表現(xiàn)為SOD、POD和CAT活性顯著高于銅脅迫組, 降低了工業(yè)大麻體內(nèi)ROS和MDA含量, 減少氧化損傷。在銅脅迫下施用外源SA, 可以特異性誘導(dǎo)CsCIPK25和CsWRKY32表達(dá), 并通過調(diào)控作物離子轉(zhuǎn)運、銅吸收固定、金屬螯合物合成等多種途徑增強銅脅迫下工業(yè)大麻的耐銅性。