文爽爽　王留強(qiáng)　盧孟柱

關(guān)鍵詞：PagWOX11/12a；銀腺楊；節(jié)間伸長(zhǎng)；株高；功能分析

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）01-0039-08

WUSCHEL-related homeobox（WOX）家族是真核生物中Homeobox（HB）轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員，該家族成員均含有同源異型結(jié)構(gòu)（Homeodomain， HD），且為植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）WOX家族共有15個(gè)成員，這些成員可分成3個(gè)分支：現(xiàn)代/WUS型分支（WUS、WOX1-7）、中間型分支（WOX8-9、WOX11-12）和古老型分支（WOX10、WOX13-14）。除WOX7外，現(xiàn)代/WUS型分支的成員中均含有1個(gè)特定的WUS-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在中間型分支及遠(yuǎn)古型分支成員中并不完整。

WOX基因家族的成員參與調(diào)控了植物體不同的生長(zhǎng)發(fā)育過程，它們?cè)谡{(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化方面發(fā)揮著重要功能，同時(shí)也參與了植物頂端分生組織和干細(xì)胞的維持、側(cè)生器官和花器官的形成、胚胎發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)等過程。擬南芥WUS蛋白可以通過和SHOOT MERISTEMLESS（STM）的相互作用，增強(qiáng)WUS對(duì)CLAVATA3（CLV3）基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力，二者共同調(diào)控CLV3的表達(dá)，維持干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，AtWOX1基因也可以調(diào)控CLV3基因的表達(dá)，且能通過調(diào)節(jié)脫羧酶蛋白（Decarboxylase，SAMDC）活性以及多胺的穩(wěn)態(tài)，參與擬南芥分生組織的發(fā)育。AtWOX4基因可以促進(jìn)原形成層的發(fā)育，調(diào)節(jié)植物的側(cè)向生長(zhǎng)。毛白楊Pto WOX5a基因可以調(diào)控楊樹不定根的發(fā)育，過表達(dá)該基因能夠增加轉(zhuǎn)基因楊樹不定根的數(shù)量。過表達(dá)WOX14可以促進(jìn)擬南芥體內(nèi)赤霉素的積累，促進(jìn)花序莖中的維管細(xì)胞分化及木質(zhì)化。過表達(dá)毛白楊WOX11/12a基因可以促進(jìn)形成層的發(fā)育，影響楊樹木質(zhì)部分化。

楊樹（Populus）是重要的速生造林樹種，同時(shí)也是木本植物分子生物學(xué)研究的模式植物。已有報(bào)道指出，WOX11/12基因可以調(diào)控植物的根系發(fā)育和莖部次生生長(zhǎng)，并能參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，這表明WOX11/12基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。為明確WOX11/12基因?qū)顦淦渌M織及器官生長(zhǎng)發(fā)育的作用，本研究以非轉(zhuǎn)基因銀腺楊（Populus alba×P.glandulosa，即‘84K）和PagWOX11/12a顯性抑制轉(zhuǎn)基因楊樹（35S：：Pag WOX11/12a-SRDX）為材料，研究了顯性抑制該基因后楊樹高生長(zhǎng)及莖中細(xì)胞長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)，揭示了Pag WOX11/12a基因?qū)顦淝o部生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1研究材料

本研究以84K楊和35S：：Pag WOX11/12a-SRDX（DR）轉(zhuǎn)基因楊樹為研究材料，35S：：Pag WOX11/12a-SRDX是由編碼SRDX肽的核酸序列與Pag WOX11/12a的cDNA融合構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化84K楊所得到的轉(zhuǎn)基因苗，該載體可以特異性抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，該轉(zhuǎn)基因苗由前期研究獲得，組培苗保存于中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。上述組培苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為：1/2 MS（Murashige& Skoog Basal Medium w/Vitamins）基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.05 mg·L^-13-吲哚丁酸（3-indole butyric acid，IBA）、0.02 mg·L^-1萘乙酸（Naphthylacetic acid，NAA）及5 mg·L^-1瓊脂粉（pH=5.8～6.0）。組培苗培養(yǎng)于人工氣候室（溫度：24±1℃；光周期：16 h/8 h光照，黑暗；相對(duì)濕度：50%～60%：光照強(qiáng)度：55～65μmol·m^-2·s^-1）。待生長(zhǎng)21 d后，將組培苗轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土（土壤：珍珠巖= 3：1）中，并置于溫室培養(yǎng)。

本研究中定量試劑盒SYBR PremixExTaq^TMKit及反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript^TMRT reagent Kit購自TaKaRa，RNA提取試劑盒（RNAprep pure Plant Kit）購自QIAGEN。

1.2研究方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 使用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.orglprotparaml）分析PagWOX11/12a蛋白的理化性質(zhì)。利用植物基因組網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得毛果楊（Populus trichocarpa Torr.＆Gray） WOX基因家族的氨基酸序列。84K楊基因組獲取于Figshare database（ https：//doi.org/10.6084/m9.figsh are.12369209），利用本地BLAST獲得84K楊中WOX基因家族的蛋白序列。使用MEGA 11軟件，根據(jù)鄰接法（Neighbor-joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，節(jié)點(diǎn)旁的數(shù)字表示基于1000次重復(fù)次數(shù)的自展值（Bootstrap）。

1.2.2基因組織表達(dá)特異性分析 利用RNA提取試劑盒提取生長(zhǎng)60 d的84K楊不同組織的總RNA，包括莖部木質(zhì)部、韌皮部及形成層、成熟葉、1/2株高處莖部、主根和側(cè)根，提取方法參照說明書。分別用Nanodrop8000和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度及質(zhì)量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系及條件參照說明書。通過在線網(wǎng)站（https：//sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/）設(shè)計(jì)PagWOX71/72a的定量引物PagWOX11/12a-RT-F和PagWOX11/12a-RT-R（表1）。利用SYBR Premix Ex Taq^TMKit（TaKaRa）定量試劑及實(shí)時(shí)熒光PCR儀器Light Cycler 480（Roche Applied Science， Penzberg，Germany）進(jìn)行qRT-PCR分析。選用PagActin作為內(nèi)參基因，且進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-^△△CT方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定 分別選取84K、DR1和DR9各9株長(zhǎng)勢(shì)一致的組培苗移入營(yíng)養(yǎng)土中，并將其置于溫室培養(yǎng)。拍照記錄其表型變化，測(cè)量植株在培養(yǎng)第7、14、21、28天后的株高及節(jié)間數(shù)，統(tǒng)計(jì)第28天時(shí)前9節(jié)間的節(jié)間長(zhǎng)度。上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4莖段解剖結(jié)構(gòu)分析 選取生長(zhǎng)28 d的植株第9節(jié)間莖段進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)分析。于第9節(jié)間莖段中部取約0.5～1 cm的材料，使用5%瓊脂糖包埋后，將其水平放置固定于樣品架上，通過震蕩切片機(jī)（LEICA VT1000）進(jìn)行縱切，切片厚度設(shè)置為40 pm。將切片置于去離子水中等待后續(xù)觀察。觀察莖段解剖結(jié)構(gòu)時(shí)使用0.05%甲苯胺藍(lán)O（Toluidine blue O，TBO）進(jìn)行染色，待染色結(jié)束后用去離子水對(duì)樣品進(jìn)行沖洗；隨后，用OlympusBX51顯微鏡進(jìn)行觀察并及時(shí)拍照，利用ImageJ軟件測(cè)量照片中髓心及韌皮部細(xì)胞的長(zhǎng)度。

1.2.5纖維離析 將生長(zhǎng)28 d的植株相同節(jié)間莖段切成1 cm長(zhǎng)度，去除樹皮，并將莖段置于離析液（30%過氧化氫：去離子水：冰乙酸=1：4：5）中，樣品至少在56℃金屬浴中放置72 h；隨后用去離子水將樣品洗滌3～5次，并浸泡過夜；最后將樣品搗碎，使用TBO進(jìn)行染色并吸取適量混懸液至載玻片中，置于Olympus BX51顯微鏡下觀察、拍照，通過Image J軟件測(cè)量木質(zhì)部纖維細(xì)胞的長(zhǎng)度。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用軟件IBM SPSS Statistics23對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用f檢驗(yàn)法分析差異顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1 84K楊WOX基因家族的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

毛果楊PtWOX基因家族共有18個(gè)成員。利用從Phytozome網(wǎng)站獲取的Pt WOX基因序列在84K楊基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，最后在84K楊中鑒定出18個(gè)PagWOX基因家族成員?；赑tWOX和PagWOX的蛋白序列，利用鄰接法構(gòu)建了毛果楊和84K楊WOX家族的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）。根據(jù)構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)84K楊PagWOX進(jìn)行命名。

2.2 Pag WOX11/12a序列分析

對(duì)Pag WOX11/12a基因的核酸及蛋白序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：84K楊與毛果楊WOX11/12a基因的核酸序列相似度為96.88%，蛋白序列相似度為95.29%。Pag WOX11/12a基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為768 bp，編碼的蛋白序列包含255個(gè)氨基酸，該蛋白的分子量約為28.18 kDa，等電點(diǎn)為5.30，脂肪系數(shù)為67.22，不穩(wěn)定系數(shù)為62.31，蛋白平均親水性（GRAVY）為-0.461。

2.3 Pag WOX11/12a基因組織表達(dá)特異性分析

為探究Pag WOX11/12a基因在84K楊不同組織中的表達(dá)情況，分別提取生長(zhǎng)60 d的84K楊的木質(zhì)部、韌皮部及形成層、成熟葉、1/2株高處莖部節(jié)間、主根和側(cè)根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)各部位進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：PagWOX11/12a基因在各個(gè)部位中均有不同程度的表達(dá)，在主根、側(cè)根及韌皮部和形成層中表達(dá)量較高，在葉片及莖段中也有一定的表達(dá)量，在木質(zhì)部中表達(dá)量最低（圖2）。

2.4轉(zhuǎn)基因植株表型分析

為了明確Pag WOX11/12a基因?qū)顦渖L(zhǎng)發(fā)育的影響，分別統(tǒng)計(jì)了非轉(zhuǎn)基因84K和DR轉(zhuǎn)基因植株在溫室生長(zhǎng)7、14、21和28 d后的表型（圖3）。通過統(tǒng)計(jì)不同株系的株高與節(jié)間數(shù)發(fā)現(xiàn)，DR轉(zhuǎn)基因植株的株高在第7、14、21、28天時(shí)均顯著小于非轉(zhuǎn)基因84K，而二者的節(jié)間數(shù)則無明顯差異（圖3A，F(xiàn)～G）。同時(shí)比較了非轉(zhuǎn)基因84K和DR轉(zhuǎn)基因植株在第28天時(shí)前9節(jié)間的表型（圖3B）以及第1～3、4～6、7～9節(jié)間的變化（圖3 C～E），可見DR轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度小于對(duì)應(yīng)84K的節(jié)間長(zhǎng)度。為進(jìn)一步明確各株系節(jié)間長(zhǎng)度的變化，測(cè)量了第28天時(shí)非轉(zhuǎn)基因84K和DR轉(zhuǎn)基因植株前9節(jié)間的長(zhǎng)度（圖3H）。結(jié)果表明：從第2節(jié)間開始，DR轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度均顯著小于非轉(zhuǎn)基因84K。上述結(jié)果表明，顯性抑制Pag WOX11/12a基因抑制了楊樹節(jié)間的伸長(zhǎng)。

為進(jìn)一步明確Pag WOX11/12a基因?qū)顦淝o部生長(zhǎng)發(fā)育的影響，取生長(zhǎng)28 d的非轉(zhuǎn)基因84K和DR轉(zhuǎn)基因植株第9節(jié)間莖段，通過縱切切片觀察髓心和韌皮部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征，并統(tǒng)計(jì)其長(zhǎng)度（圖4）。結(jié)果表明：DR轉(zhuǎn)基因植株的韌皮部細(xì)胞及髓心細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因84K相比，長(zhǎng)度均有不同程度的減?。▓D4A～C）。DR1和DR9的韌皮部細(xì)胞及髓心細(xì)胞長(zhǎng)度顯著小于非轉(zhuǎn)基因84K。與84K相比，DR轉(zhuǎn)基因株系DR1和DR9的韌皮部細(xì)胞分別減小了30%與21%，髓心細(xì)胞長(zhǎng)度分別縮短了25%及15%（圖4D、E）。

除了韌皮部及髓心外，木質(zhì)部也是楊樹莖段的重要組成，利用木質(zhì)部纖維離析對(duì)非轉(zhuǎn)基因84K和DR轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部纖維細(xì)胞長(zhǎng)度進(jìn)行了分析（圖5）。通過對(duì)木質(zhì)部纖維細(xì)胞的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)（圖5D）可知：DR1和DR9的木纖維細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因84K相比，分別減小了26%與20%。上述結(jié)果表明，DR轉(zhuǎn)基因植株節(jié)間縮短是由莖中細(xì)胞長(zhǎng)度減小導(dǎo)致。

3討論

楊樹是我國重要的速生造林樹種，具有繁殖容易、生長(zhǎng)快等特性，是生產(chǎn)建筑、造紙工業(yè)及生物燃料生產(chǎn)的重要材料。同時(shí)其轉(zhuǎn)基因體系相對(duì)成熟，也是最早完成全基因組測(cè)定的樹種，是木本植物進(jìn)行分子生物學(xué)研究的模式樹種。研究參與調(diào)控楊樹生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，對(duì)于楊樹的分子育種具有重要意義。本研究選取了與分生組織相關(guān)的WOX家族基因，以期明確Pag WOX11/12a基因?qū)顦涓呱L(zhǎng)發(fā)育的作用，進(jìn)而提高木材產(chǎn)量。

已有研究表明，毛果楊PtWOX基因家族共有18個(gè)成員，本研究利用84K楊的基因組信息，通過序列比對(duì)在84K中找到了18個(gè)同源序列，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，PagWOX11/12a基因與毛果楊PtWOX11/12a基因序列相似度較高。

Pag WOX11/12a基因的組織表達(dá)特異性分析結(jié)果（圖2）表明，該基因在主根中的表達(dá)量最高，在側(cè)根中表達(dá)量也相對(duì)較高，這表明PagWOX11/12a基因可能影響楊樹根系發(fā)育。已有研究表明，在楊樹中過表達(dá)WOX11/12a可以促進(jìn)植物根系發(fā)育。同時(shí)該基因在韌皮部及形成層中也有較高的表達(dá)量，暗示該基因很有可能參與韌皮部及分生組織發(fā)育的調(diào)控。

植株的高度通常由節(jié)間數(shù)量及節(jié)間長(zhǎng)度決定。本研究對(duì)非轉(zhuǎn)基因84K及DR轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型分析（圖3），發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)期內(nèi)，二者的節(jié)間數(shù)量均無明顯差異，而DR轉(zhuǎn)基因植株的株高則顯著低于非轉(zhuǎn)基因84K，表明DR轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度小于非轉(zhuǎn)基因84K。為明確PagWOX11/72a基因?qū)?jié)間長(zhǎng)度的影響，觀察并統(tǒng)計(jì)了在溫室生長(zhǎng)28d后非轉(zhuǎn)基因84K及DR轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度（圖3B～E，H），結(jié)果顯示從第2節(jié)間開始，DR轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間長(zhǎng)度均低于非轉(zhuǎn)基因84K，且差異顯著。由此可知，PagWOX11/12a基因可以通過改變節(jié)間伸長(zhǎng)來影響植株高度，節(jié)間長(zhǎng)度的降低是DR轉(zhuǎn)基因植株矮化的主要原因。為更精準(zhǔn)的分析Pag WOX11/12a基因?qū)顦涓呱L(zhǎng)的影響，對(duì)楊樹莖段進(jìn)行了解剖學(xué)分析，通過觀察對(duì)比非轉(zhuǎn)基因84K與DR轉(zhuǎn)基因植株莖段縱切切片（圖4），發(fā)現(xiàn)DR轉(zhuǎn)基因楊樹莖中韌皮部細(xì)胞及髓心細(xì)胞長(zhǎng)度小于非轉(zhuǎn)基因84K，同時(shí)纖維離析結(jié)果（圖5）表明，與非轉(zhuǎn)基因84K相比，DR轉(zhuǎn)基因植株的纖維細(xì)胞的長(zhǎng)度也顯著變短。上述結(jié)果進(jìn)一步說明，DR轉(zhuǎn)基因植株節(jié)間長(zhǎng)度的降低是由莖中細(xì)胞長(zhǎng)度縮短所致，PagWOX11/12a基因可以通過影響楊樹莖中細(xì)胞長(zhǎng)度來控制節(jié)間伸長(zhǎng)，進(jìn)而改變植株高度。已有研究表明，毛白楊PtoWOX11/12a基因可以影響楊樹莖的發(fā)育，改變轉(zhuǎn)基因植株株高及地徑，過表達(dá)毛白楊PtoWOX11/12a基因后可以促進(jìn)形成層細(xì)胞層數(shù)的增加，但會(huì)抑制木質(zhì)部的發(fā)育，表明Pto WOX11/12a基因可以影響形成層干細(xì)胞的活動(dòng)及木質(zhì)部的分化；而84K楊PagWOX11/12a基因可以通過調(diào)控韌皮部、髓心細(xì)胞及木質(zhì)部纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)，影響植株的節(jié)間長(zhǎng)度，說明了WOX11/12a基因?qū)ηo生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控途徑。前期已有研究表明，PagWOX11/12a基因可以促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物的抗旱性及耐鹽性，而本研究指出，該基因也可以調(diào)控楊樹莖的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)一步明確了PagWOX11/12a基因?qū)顦渖L(zhǎng)發(fā)育新的調(diào)控途徑。

通過了解Pag WOX11/12a基因?qū)?jié)間伸長(zhǎng)的調(diào)控作用有助于提高木材產(chǎn)量。已有研究表明，莖段節(jié)間伸長(zhǎng)主要由生長(zhǎng)素（Auxin）、赤霉素（Gibberellins，GAs）、油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）和獨(dú)角金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）等激素控制。雖然上述激素在莖段節(jié)間伸長(zhǎng)中發(fā)揮的作用不同，但它們的生物合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程均可能影響植株高度。后續(xù)可以通過測(cè)定激素含量進(jìn)一步明確PagWOX11/12a基因影響節(jié)間伸長(zhǎng)的途徑。

4結(jié)論

株高是林木遺傳育種中的重要性狀之一，本研究明確了PagWOX11/12a基因可以通過影響節(jié)間伸長(zhǎng)改變植株高度，通過統(tǒng)計(jì)韌皮部細(xì)胞、髓心細(xì)胞及木質(zhì)部纖維細(xì)胞的長(zhǎng)度可以得知，該基因?qū)?jié)間伸長(zhǎng)的抑制主要是通過控制莖中細(xì)胞長(zhǎng)度來實(shí)現(xiàn)的，上述結(jié)果對(duì)揭示PagWOX11/12a基因?qū)顦涞纳L(zhǎng)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。