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長(zhǎng)鏈非編碼RNA Linc00645在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能研究

2023-04-29 00:44:03王宇杰李晨龍鄭宏山劉清艾思奇王英杰肖旭蘇天崎付天嬌梁鵬
臨床神經(jīng)外科雜志 2023年2期
關(guān)鍵詞:長(zhǎng)鏈非編碼RNA侵襲上皮

王宇杰 李晨龍 鄭宏山 劉清 艾思奇 王英杰 肖旭 蘇天崎 付天嬌 梁鵬

【摘要】 目的 研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA Linc00645在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,并探究其可能的作用機(jī)制。方法 分析癌癥基因組圖譜(TCGA-GBM)數(shù)據(jù)庫(kù)和中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組計(jì)劃(CGGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中,Linc00645在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)在人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株和5種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中檢測(cè)Linc00645的表達(dá)水平。敲低Linc00645表達(dá)后,應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力,應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。應(yīng)用Western Blot實(shí)驗(yàn)在蛋白水平上驗(yàn)證敲低Linc00645的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果 Linc00645在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于正常腦(P<0.05),并且Linc00645的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤病理等級(jí)的升高而升高(P<0.05)。Linc00645高表達(dá)組的患者,總體生存期明顯縮短,預(yù)后較差(P<0.05)。抑制Linc00645的表達(dá)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移能力均明顯下降。基因表達(dá)相關(guān)性(Pearson)分析顯示上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(EMT-like)相關(guān)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒因子(ZEB1)與Linc00645表達(dá)呈正相關(guān)性,而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)與Linc00645表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。敲低Linc00645的表達(dá)后細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)水平升高,而N-cadherin、Vimentin和ZEB1表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論 長(zhǎng)鏈非編碼RNA Linc00645在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。Linc00645可能通過(guò)升高N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表達(dá)水平從而提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Linc00645可能作為膠質(zhì)瘤早期診斷和治療的新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)膠質(zhì)瘤;長(zhǎng)鏈非編碼RNA;侵襲;上皮-間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R739.41 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】 1672-7770(2023)02-0146-07

Abstract: Objective To investigate the expression of long non-coding RNA Linc00645 in glioma tissues and its effect on the proliferation, invasion and migration of glioma cells, and to explore its possible mechanisms. Methods The expression of Linc00645 in normal brain tissues and glioma tissues in The Cancer Genome Atlas(TCGA-GBM) database and the Chinese Glioma Genome Atlas(CGGA) database were analyzed, and quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR) was used to verify the expression in Normal Human Astrocyte and 5 glioma cell lines. After knocking down the expression of Linc00645, MTT assay was used to detect the proliferation capacity of the glioma cells, and the wound healing assay and the Transwell assay were conducted to evaluate the migration and invasion ability of the cells. Western Blot was performed to verify the effect of Linc00645 knockdown on the invasion and migration-related proteins of glioma cells at the protein level. Results The expression of Linc00645 in glioma tissues was significantly higher than that in normal brain tissues(P<0.05), and the expression of Linc00645 increased along with the advance of the pathological grade of glioma(P<0.05). In the Linc00645 high ?expression group, the overall survival period was significantly shorter and the prognosis was worse(P<0.05). After inhibiting the expression of Linc00645, the proliferation, invasion and migration ability of glioma cells were significantly reduced. The Pearson correlation analysis showed that EMT-like related markers N-cadherin, Vimentin and zinc finger E-box binding homeobox 1(ZEB1) were positively correlated with Linc00645, while E-cadherin was negatively correlated with Linc00645(P<0.05). The expression of E-cadherin increased, while the expression of N-cadherin, Vimentin and ZEB1 significantly decreased after knocking down the expression Linc00645. ConclusionsLong non-coding RNA Linc00645 is highly expressed in glioma tissues, and its expression is closely related to the malignancy of the tumor. Linc00645 could increase the expression of N-cadherin, Vimentin and ZEB1 to enhance the invasion and migration ability of glioma cells. Therefore, Linc00645 may serve as a new target for early diagnosis and treatment of glioma.

Key words: glioma; long non-coding RNA; invasion; epithelial-mesenchymal transition-like

基金項(xiàng)目:黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LH2021H080)

作者單位:150001 哈爾濱,哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科

通信作者:梁鵬

在過(guò)去的幾十年中,神經(jīng)膠質(zhì)瘤已成為中國(guó)乃至全球中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。盡管在診斷和治療方面取得了很多進(jìn)展,但神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差,中位總生存期為12~14個(gè)月。膠質(zhì)瘤的發(fā)病率不斷上升且病死率很高,因此迫切需要闡明其發(fā)展的病理機(jī)制。眾所周知,膠質(zhì)瘤發(fā)生的過(guò)程很復(fù)雜,涉及很多基因突變和生物過(guò)程的多個(gè)步驟[2-4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是促進(jìn)腫瘤侵襲和遷移過(guò)程的重要機(jī)制[5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類(lèi) RNA 轉(zhuǎn)錄物,長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸,沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)的功能[6]。LncRNAs以前被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪聲,然而現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它們?cè)谝幌盗猩飳W(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,如表觀(guān)遺傳調(diào)控,組蛋白修飾,轉(zhuǎn)錄控制和RNA代謝等過(guò)程[7]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 00645(Linc00645)位于人類(lèi)14號(hào)染色體上,已在子宮內(nèi)膜癌中被證實(shí)有表達(dá)異常并發(fā)揮重要作用[8],然而Linc00645在膠質(zhì)瘤中的作用尚不清楚。本研究檢測(cè)了Linc00645在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平,隨后檢測(cè)敲低Linc00645的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力及相關(guān)標(biāo)志物的影響,明確Linc00645在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的策略。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)樣本數(shù)據(jù)收集 自癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(http://cancergenome.nih.gov)下載164例樣本數(shù)據(jù),其中包含159例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)組織樣本和5例正常腦組織樣本。自中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)(www.cgga.org)下載262例膠質(zhì)瘤患者樣本,其中包含世界衛(wèi)生組織(WHO)Ⅰ-Ⅱ級(jí)96例,Ⅲ級(jí)52例,Ⅳ級(jí)114例。樣本數(shù)據(jù)用于正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中Linc00645表達(dá)情況的分析。

1.2 生存分析方法 從TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GBM患者的生存期數(shù)據(jù),對(duì)Linc00645和GBM患者生存期進(jìn)行相關(guān)性分析,通過(guò)Graphpad軟件采用Kaplan-Meier 法繪制患者生存期曲線(xiàn),并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn),以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 與Linc00645相關(guān)的功能分析 使用基因本體論(gene ontology,GO)分析對(duì)Linc00645的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)Starbase V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Linc00645進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)并根據(jù)相關(guān)性選取前50個(gè)基因作為靶基因,后通過(guò)功能注釋生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery,DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)Linc00645進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)剿髋cLinc00645相關(guān)性最高的生物學(xué)功能注釋?zhuān)占町惐稊?shù)為Fold change>2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率False discovery rate<0.01為有意義注釋。

1.4 主要材料和試劑 所有細(xì)胞株均采用含10%胎牛血清、0.2%雙抗(50 U/mL青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司,青霉素-鏈霉素溶液(100×)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒均購(gòu)自瑞士Roche公司。Transwell小室(預(yù)鋪基質(zhì)膠)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。蘇木素-伊紅試劑盒和MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。載Linc00645的siRNA所用商品化質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法 按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的總RNA,應(yīng)用NanoDrop檢測(cè)RNA濃度。Linc00645的正向引物序列為5′- CAGAGGTGGTGCCTTGACA-3′,反向引物序列為5′- ATATCCTCTGTGGCCCATGC -3′,GAPDH作為內(nèi)參基因,其正向引物序列為5′- CACCCACTCCTCCACCTTTG -3′,反向引物序列為5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG -3′。以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后加入引物使用SYBR Green qPCR分析法進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),反應(yīng)結(jié)束后使用ABI Prism7900HT PCR儀自帶分析軟件,導(dǎo)入原始數(shù)據(jù),獲得相應(yīng)的CT值、ΔCt值,并以2-ΔΔCt值(Ct:循環(huán)閾值)算法分析qRT-PCR結(jié)果,得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)方法 所有細(xì)胞株均采用含10%胎牛血清、0.2%雙抗(50 U/mL 青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞均培養(yǎng)在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并記錄細(xì)胞貼壁情況,2~3 d更換完全培養(yǎng)基一次,換液時(shí)棄掉培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,加入預(yù)染的PBS液(pH=7.4)3 mL漂洗1次,隨后加入5 mL預(yù)熱完全培養(yǎng)基,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組 結(jié)果1分組:(1)正常組和GBM組(圖1A);(2)Ⅰ-Ⅱ級(jí)組,Ⅲ級(jí)組和Ⅳ級(jí)組(圖1B);(3)人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株(NHA)組和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251、LN229、T98G、A172、SHG44)組(圖1C)。結(jié)果2分組:(1)TCGA中Linc00645低表達(dá)組(n=78)和高表達(dá)組(n=81)(圖2A);(2)CGGA中Linc00645低表達(dá)組(n=121)和高表達(dá)組(n=141)(圖2B)。結(jié)果3分組:(1)U251細(xì)胞株和T98G細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc 1#組、si-Linc 2#組、si-Linc 3#組(圖3A);(2)U251細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖3B);(3)T98G細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖3C)。結(jié)果4分組:(1)U251細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖4A,4C-4E);(2)T98G細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖4B-4E)。結(jié)果5分組:(1)U251細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖5E,5F);(2)T98G細(xì)胞株中si-NC組和si-Linc00645組(圖5E,5G)。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天,將5×105貼壁細(xì)胞鋪到6孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%~70%時(shí)用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)備無(wú)RNase EP管,將EP管A:Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL+目的基因質(zhì)粒4 μL(100 pmol)和B:Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL+Lipofectamine 2000 5 μL混合后靜置20 min,加入6 孔板中培養(yǎng)4 h。更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h后收集細(xì)胞。

1.9 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 利用北京碧云天公司生產(chǎn)的MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。根據(jù)說(shuō)明書(shū),在15 mL離心管中使用5 mL的MTT溶劑混勻溶解25 mg MTT粉,分裝后置于-20 ℃避光保存。將2×103/孔貼壁細(xì)胞鋪到加入了100 μL培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。每孔加入10 μL MTT溶液后繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液,輕輕混勻后繼續(xù)孵育10 min,在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察結(jié)晶紫的溶解程度。取出培養(yǎng)板后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度,導(dǎo)出數(shù)據(jù),根據(jù)存活率計(jì)算公式得到相應(yīng)數(shù)值,繪制增殖曲線(xiàn)。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和修復(fù)能力的方法。實(shí)驗(yàn)前所有工具進(jìn)行高壓滅菌,直尺和信號(hào)筆置于超凈臺(tái)中紫外照射30 min。使用信號(hào)筆在無(wú)菌6孔板背后每隔0.5 cm畫(huà)一條橫穿過(guò)孔直線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)前一天加入5×105細(xì)胞鋪板,培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)時(shí)用槍頭沿著直尺劃過(guò)細(xì)胞方向與孔板背面畫(huà)線(xiàn)相垂直,槍頭垂直劃過(guò)貼壁細(xì)胞。使用PBS液洗掉脫落的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),在0 h、24 h取樣拍照。使用Image J軟件分析細(xì)胞修復(fù)面積,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 利用美國(guó)Corning公司生產(chǎn)的商品化的預(yù)包被基質(zhì)膠Transwell小室進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。使用時(shí)提前取出小室,在上室加入300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基,在室溫下靜置30 min水化基質(zhì)膠,將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中,小室內(nèi)部為上室,培養(yǎng)板底部為下室。使用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液。上層小室加入300 μL細(xì)胞懸液,下層小室加入500 μL含20%的FBS培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室,對(duì)小室內(nèi)側(cè)使用蒸餾水輕輕沖洗,使用棉簽擦去內(nèi)層基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞。將小室置入含有4%多聚甲醛的孔板內(nèi),固定細(xì)胞10 min。使用HE染色液染色標(biāo)記細(xì)胞,晾干后翻轉(zhuǎn)小室在顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

1.12 Western Blot方法 收集細(xì)胞,使用RIPA裂解液方法提取總蛋白。使用NanoDrop分光光度計(jì)法測(cè)定提取蛋白濃度,通過(guò)檢測(cè)純凈的蛋白在280 nm處的吸光值,直接定量蛋白濃度和純度,上樣量為200 μg/孔。使用Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)進(jìn)行蛋白電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF),使用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h,再使用TBST稀釋目的一抗,將PVDF膜浸于一抗中,4 ℃孵育過(guò)夜。隨后用TBST漂洗移除一抗,再將PVDF膜浸于相應(yīng)二抗中,室溫下在搖床上孵育1 h,TBST漂洗。采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色法,顯影前以配置1∶1比例配置發(fā)光液A液和B液,充分混勻,將PVDF浸潤(rùn)于顯色液中,將PVDF膜放置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)平臺(tái)中,使用Biorad Image Lab軟件分析目的蛋白的相對(duì)灰度值。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS v.19.0或者GraphPad Prism v.5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用c2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法,生存期采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線(xiàn)并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn),基因表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson法,以P<0.05認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Linc00645在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與生物學(xué)功能分析結(jié)果 對(duì)癌癥基因組圖譜(TCGA-GBM)數(shù)據(jù)庫(kù)中所采集樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)分析顯示,Linc00645在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織(P<0.05)(圖1A)。對(duì)CGGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中所采集樣本的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析顯示,Linc00645的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤病理等級(jí)的升高而升高(P<0.05)(圖1B)。提示Linc00645在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中存在差異表達(dá)性,且表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株NHA和膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、LN229、T98G、A172、SHG44采用qRT-PCR檢測(cè)Linc00645的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果顯示Linc00645在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平顯著高于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞株NHA(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。以上結(jié)果提示,Linc00645在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯上調(diào)。對(duì)Linc00645進(jìn)行GO富集分析,首先利用Starbase V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Linc00645進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),根據(jù)相關(guān)性選取前50個(gè)基因作為靶基因,使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了GO功能注釋?zhuān)Y(jié)果顯示Linc00645主要功能匯聚在金屬鈦酶活性,間質(zhì)化遷移,金屬離子結(jié)合位點(diǎn),細(xì)胞基質(zhì)黏附等相關(guān)分子功能(圖1D)。

2.2 Linc00645表達(dá)量與腦膠質(zhì)瘤患者生存期的關(guān)系 在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GBM患者的臨床數(shù)據(jù),以L(fǎng)inc00645表達(dá)中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組(High expression)和低表達(dá)組(Low expression)并對(duì)其進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析,結(jié)果顯示Linc00645高表達(dá)組的患者,總體生存期明顯縮短,預(yù)后較差(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示膠質(zhì)瘤中Linc00645高表達(dá)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(圖2)。

2.3 敲低Linc00645的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響 3組siRNA序列中,si-Linc00645 1#組(si-Linc 1#)敲減效率最明顯,故選擇用來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3A)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,U251和T98G細(xì)胞株在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后si-Linc00645組的增殖能力低于si-NC組(圖3B,圖3C),這表明Linc00645的表達(dá)下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。

2.4 敲低Linc00645的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,U251和T98G細(xì)胞株在培養(yǎng)24 h后si-Linc00645組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的愈合能力和穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量均顯著低于si-NC組(圖4),這表明Linc00645在體外對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)作用,Linc00645的表達(dá)下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

2.5 敲低Linc00645的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT過(guò)程的影響 共表達(dá)基因相關(guān)性分析顯示EMT相關(guān)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒因子(zincfinger E-box binding homeobox 1,ZEB1)與Linc00645表達(dá)呈正相關(guān)性,E-鈣黏蛋白(E-cadherin)與Linc00645表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)(圖5A-D),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,U251和T98G細(xì)胞株在培養(yǎng)48 h后,si-Linc00645組中E-cadherin表達(dá)水平高于si-NC組,而si-Linc00645組中N-cadherin、Vimentin和ZEB1表達(dá)水平低于si-NC組,抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程(圖5E-G)。以上結(jié)果提示,Linc00645的表達(dá)與膠質(zhì)瘤中EMT過(guò)程存在密切相關(guān)性。

3 討 論

LncRNA的功能主要根據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)特定的分布區(qū)域,在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中通過(guò)各自的序列特殊性結(jié)合mRNA、miRNA及相關(guān)功能蛋白發(fā)揮功能,包括DNA甲基化,對(duì)mRNA穩(wěn)定性的維持,通過(guò)“分子海綿”吸附miRNA,以及通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能。越來(lái)越多的研究顯示,LncRNA在腫瘤的惡性生物學(xué)行為,神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和放化療 ?抵抗過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。多種LncRNA被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9-12]。

EMT指的是上皮細(xì)胞在一些因素的作用下,失去極性及細(xì)胞間緊密連接和黏附連接,獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移的能力,變成具備間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞的改變。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)源于膠質(zhì)細(xì)胞,從神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)育而來(lái),因此很多特征不同于經(jīng)典上皮細(xì)胞,但是膠質(zhì)瘤同樣具有高度可塑性,稱(chēng)為EMT樣(EMT-like)過(guò)程[13-14],調(diào)節(jié)GBM的侵襲遷移過(guò)程。近年來(lái),許多研究報(bào)道了EMT或EMT-like機(jī)制參與其他非上皮性腫瘤的惡性進(jìn)程[15-16]。最近定義的GBM的間充質(zhì)亞型提示在惡性腦腫瘤中,類(lèi)EMT過(guò)程也具有臨床重要性。

既往研究顯示,LncRNA H19,CCAT2和HOTTIP與膠質(zhì)瘤的EMT和患者預(yù)后不良有關(guān)[17-19]。 研究者最先發(fā)現(xiàn)Linc00645在子宮內(nèi)膜癌中存在差異表達(dá),可以作為腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。據(jù)研究報(bào)道在對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析時(shí)發(fā)現(xiàn)Linc00645在膠質(zhì)瘤中可能呈高表達(dá)狀態(tài),并與惡性生存期存在相關(guān)性[20]。鑒于Linc00645對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能可能存在調(diào)控作用,本研究進(jìn)一步探討潛在的調(diào)控機(jī)制。首先通過(guò)生物信息學(xué)的方法,在CGGA膠質(zhì)瘤樣本數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),這些EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平均與Linc00645呈密切相關(guān)。隨后通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Linc00645的表達(dá)被抑制后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi) N-cadherin,Vimentin和ZEB1蛋白的表達(dá)水平也顯著下降。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),Linc00645的表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤組織中上調(diào),并與腫瘤的惡性程度密切相關(guān),上調(diào)的Linc00645預(yù)示膠質(zhì)瘤患者的總體生存期較差。Linc00645可能通過(guò)調(diào)控EMT-like相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin,Vimentin和ZEB1蛋白的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程,從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲和遷移能力。至于Linc00645的表達(dá)為何在膠質(zhì)瘤中上調(diào),仍需對(duì)其上游調(diào)控因子進(jìn)行進(jìn)一步的研究來(lái)探索。而Linc00645通過(guò)何種機(jī)制影響這些蛋白的表達(dá),本研究猜測(cè)Linc00645可能作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)靶向結(jié)合miRNA,進(jìn)而調(diào)控下游靶基因,從而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT樣轉(zhuǎn)化過(guò)程。這些結(jié)果將增進(jìn)我們對(duì)癌癥發(fā)展?jié)撛跈C(jī)制的理解,并可能為人類(lèi)膠質(zhì)瘤的治療提供潛在的新策略。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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(收稿2022-04-14 修回2022-08-03)

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