喬繼琛　肖揚婧卿　劉超明　鄒標(biāo)　崔令花

摘 要：目的 探討柴胡煎劑是否對瘧疾小鼠有緩解癥狀的治療作用。方法 采用約氏瘧原蟲17XNL蟲株感染6～8周齡小鼠，制備瘧疾小鼠模型。每天尾靜脈采血計算小鼠紅細胞瘧原蟲感染率。待瘧疾小鼠模型紅細胞感染率達到3%左右，隨機將瘧疾小鼠分成治療組和對照組。治療組使用柴胡煎劑灌胃治療，根據(jù)柴胡煎劑的用量不同分為低劑量組（0.5 mL，含生藥0.05 g）和高劑量組（0.5 mL，含生藥0.10 g）；對照組使用相同體積生理鹽水灌胃。每天觀察并記錄治療組和對照組瘧疾小鼠模型紅細胞瘧原蟲感染率的變化；隨機測量所有小鼠體溫變化情況。記錄小鼠的生存時間，灌胃7 d后小鼠摘眼球取血對比血紅蛋白含量等常見血常規(guī)指標(biāo)并手術(shù)取小鼠肝臟、脾臟稱重，比較3組小鼠肝重比、脾重比。結(jié)果 治療組和對照組小鼠紅細胞瘧原蟲感染率并無明顯差異（P＞0.05）；對照組小鼠體溫高于治療組；治療組小鼠生存率明顯高于對照組（P＜0.05）；低劑量組與高劑量組在血紅蛋白含量上無差異，在白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血細胞壓積、血小板計數(shù)上無差異，3組小鼠脾重比無差異（均P＞0.05），高劑量組小鼠肝重比明顯大于低劑量組（P＜0.05）。結(jié)論 在特定劑量下柴胡煎劑對約氏瘧原蟲并無直接殺傷作用；但在減少小鼠發(fā)熱、減輕小鼠肝腫大，提升小鼠存活率方面有一定作用。

關(guān)鍵詞：柴胡煎劑；約氏瘧原蟲；感染率；治療作用

中圖分類號：R381；R282

文獻標(biāo)志碼：A

Relieving malaria symptoms in mice with bupleurum decoction

QIAO Jichen XIAO YangJingqingLIU Chaoming ZOU Biao CUI Linghua

（1. Department of Basic Medical Science， Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 344000， China; 2. Department of Clinical Laboratory， Fuzhou First Peoples Hospital， Fuzhou 344000， China）

Abstract： Objective To investigate whether bupleurum decoction has therapeutic effect alleviateing the symptoms of malaria on malaria mice. Methods Malaria mouse model was prepared by infecting 6-8 weeks old mice with 17XNL strain of Plasmodium yoelii. The infection rate of plasmodium in mouse red blood cells was counted by daily tail vein sampling. When the red blood cell infection rate of malaria mouse model reached about 3%， malaria mice were randomly divided into 2 treatment groups and a control group. The treatment groups were given bupleurum decoction by gavage and divided into a low dose group （0.5 mL， containing crude drug 0.05 g） and a high dose group （0.5 mL， containing crude drug 0.1 g）. The control group was given 0.5 mL normal saline by intragastric administration. The change of plasmodium infection rate in erythrocyte of malaria mouse model in the treatment groups and the control group was observed and recorded every day. The temperature changes of all mice were measured randomly. The survival time of the mice was recorded. After 7 days of intragastriction， blood was taken from the eyeballs of the mice to compare the changes of common blood routine indexes such as hemoglobin content. The liver and spleen of the mice were surgically taken and weighed to compare the liver weight ratio and spleen weight ratio of the 3 groups. Results There was no significant difference in plasmodium infection rate among the treatment groups and control group （P>0.05）. The body temperature of the control group was higher than that of the treatment group. The survival rate of mice in the treatment groups was significantly higher than that in the control group （P<0.05）. There was no difference in hemoglobin content， white blood cell count， red blood cell count， hematocrit， and platelet count between the low dose group and the high dose group. There was no difference in spleen weight ratio among the 3 groups （all P>0.05）. The liver weight ratio of the high dose group was significantly higher than that of the low dose group （P<0.05）. Conclusion Bupleurum decoction has no direct killing effect on plasmodium. yoelii at specific dose. However， it has a certain effect on reducing fever， alleviating liver enlargement， and improving survival rate of mice.

Key words： bupleuri decoction; Plasmodium yoelii; infection rate; therapeutic effect

瘧疾是一種由瘧原蟲感染經(jīng)按蚊傳播的傳染病[1]。瘧疾曾在全球多個地區(qū)廣泛流行，病死率較高[2]。據(jù)WHO統(tǒng)計，2020年全世界約有2.41億瘧疾感染病例和62.7萬瘧疾死亡病例[3]。屠呦呦教授提純的青蒿素類藥物明顯降低了瘧疾患者的病死率[4]，青蒿素一度被稱為抗瘧神藥。但近年來有研究表明，在東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲已經(jīng)出現(xiàn)了對青蒿素的耐藥性，并有逐步向全球蔓延的趨勢[5]。柴胡是中醫(yī)診療中常用的藥物，中國藥典中收錄的柴胡有柴胡和狹葉柴胡2種，分別被稱為“北柴胡”和“南柴胡”[6]。中醫(yī)典籍記載，柴胡具有疏肝解郁、解退熱以及抗瘧疾寒熱發(fā)作等作用[7]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，柴胡具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗病原體等多種作用[8]；2種柴胡藥理作用類似，在多種情況下可相互代替使用。雖然中醫(yī)典籍對柴胡抗瘧作用多有記載，但其臨床研究報道并不多見，1960年有臨床醫(yī)生報道了使用柴胡煎劑治療44例瘧疾患者，取得了良好的效果[9]。而在柴胡抗瘧原蟲感染方面的動物實驗，尚未見到相關(guān)研究報道。隨著瘧原蟲對青蒿素耐藥趨勢的出現(xiàn)，全球瘧疾防控壓力面臨嚴(yán)峻考驗[10-13]。在后青蒿素時代，急需篩選備用藥物來應(yīng)對瘧原蟲耐藥蟲株的產(chǎn)生。通過廣泛閱讀相關(guān)文獻，篩選出中藥柴胡可能具有治療瘧疾的作用。本研究擬采用中藥北柴胡飲片煎劑對瘧疾小鼠模型進行灌胃治療，觀察柴胡煎劑對瘧疾小鼠紅細胞瘧原蟲感染率的影響，以驗證柴胡對瘧疾的治療作用，為抗瘧藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥開發(fā)及創(chuàng)新使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

昆明小鼠20只，6～8周齡，雌性；體重為（20±2） g。由江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校動物實訓(xùn)中心動物房提供。

1.1.2 儀器與試劑

電子天平（JCS-K）購自凱豐集團有限公司；紅外體溫測量計（CK-T1501）購自深圳市長坤科技有限公司；全自動血液分析（XS-900i）購自希森美康醫(yī)用電子有限公司，試劑為廠家配套試劑。移液器、灌胃針、燒杯、生理鹽水等物品由學(xué)校實訓(xùn)中心統(tǒng)一招標(biāo)采購。

1.1.3 中藥飲片

北柴胡購自江西洪興大藥房， 產(chǎn)地為甘肅??；中藥飲片經(jīng)煎煮濃縮后制成水煎劑，每1.0 mL含藥 0.20 g。

1.2 方法

1.2.1 制備瘧疾小鼠模型

從超低溫冰箱取出保存的約氏瘧原蟲17XNL蟲株，進行瘧原蟲復(fù)蘇，后續(xù)進行傳代培養(yǎng)。使用1×106個約氏瘧原蟲17XNL蟲株腹腔注射感染小鼠，制備瘧疾小鼠模型。

1.2.2 制備柴胡煎劑

北柴胡煎劑按照中藥傳統(tǒng)煎劑配制方法且參考藥理學(xué)相關(guān)文獻研究經(jīng)驗：使用10.00 g柴胡加入100.0 mL純凈水，煎藥方法先武火水沸騰后改用文火，煎藥時間約為2 h，最終水煎液為50.0 mL。即最終制備柴胡水煎液為10.00 g/50.0 mL生藥（0.20 g生藥/mL）；最終灌胃濃度使用純凈水調(diào)配。

1.2.3 隨機分組灌胃治療

每天對瘧疾小鼠模型進行尾靜脈采血、制作血涂片染色并通過顯微鏡油鏡鏡檢，觀察小鼠瘧原蟲的感染情況，并計數(shù)小鼠紅細胞瘧原蟲感染率。待瘧疾小鼠模型紅細胞感染率達到3%左右，采用隨機分組方式將瘧疾小鼠分成治療組和對照組。治療組根據(jù)對中藥飲片柴胡煎劑的用量不同再次分為低劑量組和高劑量組。根據(jù)相關(guān)文獻，低劑量組使用0.5 mL含0.05 g生藥；高劑量組使用0.5 mL含0.10 g生藥；連續(xù)灌胃治療7 d。對照組使用相同體積生理鹽水進行灌胃治療。

1.2.4 測量體溫，取血及肝臟、脾臟標(biāo)本

每天固定時間觀察實驗組和對照組瘧疾小鼠模型紅細胞瘧原蟲感染率的變化，并記錄原蟲率變化情況。同時使用紅外線體溫儀每天測量記錄小鼠體溫變化，對比治療組和對照組小鼠體溫差異，驗證柴胡對小鼠瘧疾退熱作用的效果。在灌胃治療7 d，停藥觀察2 d后全部小鼠摘眼球取血，取血后制作血涂片將剩余血液做血常規(guī)檢測。取血后脫頸椎處死小鼠，分別取小鼠肝臟、脾臟稱重；計算肝重比與脾重比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel辦公軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用Graphpad 6.0和SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)并制作圖標(biāo)。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組數(shù)據(jù)不同時間對比采用單因素方差分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠紅細胞瘧原蟲感染率

對實驗組和對照組小鼠分別進行不同劑量的柴胡煎劑和同等體積的生理鹽水治療1周。灌胃治療當(dāng)天（1 d）開始至灌胃治療1周后第2天（8 d）每天同一時間進行尾靜脈采血，取血后制作血涂片，吉姆薩染色后鏡檢；并于第9天（感染瘧原蟲第13天）摘眼球取血涂片染色后鏡檢。結(jié)果顯示，柴胡煎劑低劑量組、高劑量組與對照組在小鼠瘧原蟲紅細胞感染率并無差異（P＞0.05），僅在個別天數(shù)有一定差異（圖1）。

2.2 小鼠體溫

瘧疾的典型表現(xiàn)有周期性寒戰(zhàn)發(fā)熱的癥狀，在整個實驗過程中，課題組成員使用紅外線電子體溫計在采血前測量小鼠的體溫，由于設(shè)備限制很難實時捕捉小鼠發(fā)熱的情況。在對照組中，小鼠體溫高于37 ℃的次數(shù)有5次，分別是37.4 ℃、37.3 ℃、37.6 ℃、37.2 ℃、37.2 ℃；實驗組小鼠體溫未能檢測到高于37 ℃，因多數(shù)情況下體溫均不高，故37 ℃以下體溫未做詳細記錄。

2.3 小鼠存活率

小鼠建模成功后，低劑量、高劑量組小鼠無死亡；對照組小鼠分別在第7、12、13天各死亡一只（圖2）。

2.4 血常規(guī)部分指標(biāo)差異情況

第13天對小鼠摘眼球取血，進行血常規(guī)檢測分析。因?qū)φ战M小鼠死亡3只（共6只），且在取血過程中有血液凝固的情況，以致于只有實驗組標(biāo)本可以正常進行血常規(guī)檢測。其中，低劑量組與高劑量組小鼠在白細胞計數(shù)（white blood cell count，WBC）、紅細胞計數(shù)（red blood cell count，RBC）、血小板計數(shù)（platelet count，PLT）、血紅蛋白含量（hemog lobin，Hb）、血細胞比容（hematocrit，HCT）等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

2.5 肝重比、脾重比差異情況

3組小鼠在脾重比上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；對照組小鼠肝重比為（0.11±0.01），明顯大于低劑量組小鼠（0.09±0.01）（P＜0.05）；對照組小鼠與高劑量組小鼠及低劑量組與高劑量組小鼠間肝重比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

柴胡抗瘧原蟲感染方面的動物實驗，尚未見到報道。研究結(jié)果顯示，柴胡煎劑低劑量組、高劑量組與生理鹽水治療組在小鼠瘧原蟲紅細胞感染率并無差異（P＞0.05），僅在個別天數(shù)有一定差異，證實柴胡煎劑在0.05 g/d和0.10 g/d的劑量下并不能夠殺死瘧原蟲。因?qū)φ战M小鼠陸續(xù)有死亡情況，導(dǎo)致小鼠數(shù)據(jù)偏少可能導(dǎo)致后面原蟲率的波動；且本實驗使用的約氏瘧原蟲非致死株，后期會有瘧原蟲減少甚至消失的情況。

在小鼠體溫測量上，由于設(shè)備限制很難實時捕捉小鼠發(fā)熱的情況。使用紅外線電子體溫計于尾靜脈采血前測量小鼠體溫，喂藥前3 d均未能檢測到高于37 ℃體溫。初步證實柴胡對治療瘧疾小鼠發(fā)熱有一定作用，與相關(guān)研究相符[14]。在以后實驗中，將嘗試使用實時體溫檢測系統(tǒng)進行監(jiān)測，以保證體溫結(jié)果更好的連續(xù)性及可靠性。

在小鼠建模成功后，低劑量、高劑量組小鼠無死亡；對照組小鼠分別在第7、12、13天死亡各一只。結(jié)果表明，柴胡煎劑在減少瘧疾小鼠損傷、延長小鼠壽命上有一定積極作用。

高劑量組有一只小鼠在摘眼球取血中因固定手法問題未能摘到小鼠眼球，放回籠子準(zhǔn)備再次固定小鼠時，該小鼠很快死亡；系人為固定手法不當(dāng)導(dǎo)致小鼠死亡，并未列入死亡小鼠數(shù)據(jù)。在建模后第13天對小鼠摘眼球取血，對照組1只死亡，緊急取血未成功。對照組另外3只小鼠取血后2只血液出現(xiàn)凝固，一只取血量較少，不能進行血常規(guī)檢測。低劑量和高劑量組未見血液凝固現(xiàn)象；僅高劑量組一只小鼠取血量較少未進行血常規(guī)檢測。研究證實，低劑量組與高劑量組小鼠在WBC、RBC、PLT、Hb、HCT上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。其中，血常規(guī)儀器可能會誤將感染瘧原蟲的紅細胞判斷為白細胞導(dǎo)致WBC增高，后續(xù)將嘗試分析瘧原蟲紅細胞感染率與儀器測量WBC的關(guān)系，以期為更好地診療瘧疾提供參考。

瘧疾患者會有肝脾腫大的表現(xiàn)，本研究計算瘧疾小鼠肝重比與脾重比來分析柴胡對瘧疾的治療作用。研究顯示，3組小鼠在脾重比上兩兩比較均無差異；對照組小鼠肝重比明顯大于低劑量組小鼠；對照組小鼠與高劑量組小鼠及低劑量組與高劑量組小鼠間肝重比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究初步證實柴胡對緩解小鼠肝腫大有一定作用；但高劑量組小鼠肝腫大情況要高于對照組和低劑量組；這可能和柴胡毒性作用有關(guān)[15]，臨床應(yīng)用中應(yīng)注意合適用量。

綜上，在特定劑量下柴胡煎劑對約氏瘧原蟲并無直接殺傷作用，但在減少小鼠發(fā)熱、減輕小鼠肝腫大，提升小鼠存活率方面有一定的積極作用。

參考文獻：

[1]MILNER D A Jr. Malaria pathogenesis[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine， 2018， 8（1）： a025569.

[2]LOVER A A， BAIRD J K， GOSLING R， et al. Malaria elimination： time to target all species[J]. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene， 2018， 99（1）： 17-23.

[3]World Health Organization. World Malaria Report 2021[R]. Geneva： World Health Organization， 2021.

[4]楊博， 孫毅凡， 雷瑤， 等. 青蒿素及其衍生物治療瘧疾的研究進展[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2021， 39（3）： 393-402.

[5]WOODROW C J， WHITE N J. The clinical impact of artemisinin resistance in Southeast Asia and the potential for future spread[J]. Fems Microbiology Reviews， 2017， 41（1）： 34-48.

[6]陳良勝， 殷雙興. 柴胡應(yīng)用與指紋圖譜研究進展[J]. 中國民族民間醫(yī)藥， 2021， 30（23）： 60-64.

[7]王和平， 黃金勇， 徐美術(shù). 柴胡飲片古今研究概況[J]. 中醫(yī)藥信息， 2005， 22（2）： 15-19.

[8]舒文將， 姚昕利， 陳宗游， 等. 中藥柴胡的藥理研究與臨床應(yīng)用[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報， 2017， 33（4）： 268-273.

[9]李鳳春. 柴胡治療瘧疾44例的療效觀察[J]. 中華內(nèi)科雜志， 1960， 8（6）： 560.

[10]O'FLAHERTY K， ATADE R， ZALOUMIS S G， et al. Contribution of functional antimalarial immunity to measures of parasite clearance in therapeutic efficacy studies of artemisinin derivatives[J]. The Journal of Infectious Diseases， 2019， 220（7）： 1178-1187.

[11]段夢茜， 周隆參， 楊照青. 惡性瘧原蟲青蒿素抗瘧藥抗性研究進展[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué)， 2022， 22（11）： 1086-1091.

[12]ROUT S， MAHAPATRA R K. Plasmodium falciparum： multidrug resistance[J]. Chemical Biology & Drug Design， 2019， 93（5）： 737-759.

[13]田斌， 申曉君， 廖瑜， 等. 長沙市122例輸入性惡性瘧原蟲pfpm2基因拷貝數(shù)變異的分析[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報， 2020， 42（20）： 2012-2017.

[14]蘭寶恒， 吳澤青. 柴胡的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2023， 40（2）： 174-180.

[15]張韻， 朱桂芬， 鐘苑茗. 柴胡的藥理毒理作用及常用量淺析[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥， 2022， 41（11）： 141-142.