蘇倩　李小麗　張忠山　王棟洋

摘 要：目的 探討miR-655-3p在肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的表達及其可能參與的生物學過程和信號通路，為進一步研究miR-655-3p的調(diào)控機制及生物學功能提供理論依據(jù)。方法 初步分析miR-655-3p在肝癌中的表達情況；借助多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測并篩選靶基因，隨后對獲取的靶基因進行GO功能富集和KEGG富集分析；構(gòu)建靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，最后驗證分析核心基因在肝癌中的表達及它們與臨床分期、預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 miR-655-3p在肝癌組織中呈低表達，經(jīng)篩選獲得miR-655-3p相關(guān)靶基因153個。這些靶基因主要與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、血管發(fā)育、衰老、凋亡調(diào)控等生物學過程以及神經(jīng)營養(yǎng)因子、Rap1、MAPK等信號通路相關(guān)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩選的10個核心基因，僅RAC1表達水平在LIHC組織中顯著上調(diào)，且與肝癌患者的臨床分期和總生存期（overall surviral，OS）相關(guān)。結(jié)論 miR-655-3p在肝癌相關(guān)的生物學過程中起重要作用，可能與篩選的靶基因RAC1表達上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝癌；miR-655-3p；生物信息；靶基因

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

Expression and its possible regulatory mechanism of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma based on bioinformatics

SU Qian LI Xiaoli ZHANG Zhongshan WANG Dongyang

（1. Departmet of Oncology， The Affiliated Hospital of Xiangnan University， Chenzhou 423000， China； 2. Clinical College of Xiangnan University， Chenzhou 423000， China）

Abstract： Objective To expore the expression and its possible biological processes and signaling pathways of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma were discussed， and to provides theoretical basis for further study on the regulatory mechanism and biological function of miR-655-3p. Methods The expression of miR-655-3p in hepatocellular carcinoma tissues was preliminarily analyzed. Multiple databases were applied to predict and screen the target genes. Subsequently， GO functional enrichment and KEGG enrichment analysis were performed on the obtained target genes. Furthermore， the target protein interaction network was constructed and core genes in the network were screened. Finally， the expression of core genes in LIHC and their relationship with clinical stage and prognosis were verified and analyzed. Results miR-655-3p was low-expressed in hepatocellular carcinoma tissues. A total of 153 target genes related to miR-655-3p were screened in multiple databases. These target genes were mainly involved in transcriptional regulation of RNA polymerase II promoter， vascular development， aging， apoptosis regulation and other biological processes， as well as neurotrophin， Rap1， MAPK and other signaling pathways. Among the 10 core genes screened in the protein interaction network， only RAC1 expression level was significantly upregulated in hepatocellular carcinoma tissues and correlated with clinical stage and overall survival （OS） of patients. Conclusion miR-655-3p plays an important regulatory role in the biological process related to hepatocellular carcinoma， which may be related to the upregulation of the screened target gene RAC1 expression.

Key words： hepatocellular carcinoma; miR-655-3p; bioinformatics; target gene

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA，它們在人類基因表達調(diào)控中起非常重要的作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)較多的miRNAs與人類腫瘤密切相關(guān)[1]。已有研究表明，miR-655（miR-655-3p）廣泛參與了腫瘤的惡性生物學行為，在腫瘤發(fā)生進展中扮演抑癌基因的角色[2]。在卵巢癌的研究中顯示，miR-655-3p通過靶向調(diào)控RAB1A抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。miR-655在三陰性乳腺癌中下調(diào)PRRX1抑制腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）表型的獲得，從而抑制癌癥進展過程中的細胞遷移和侵襲能力。KIUCHI等[3]發(fā)現(xiàn)血漿中低表達的miR-655與食管鱗狀上皮癌患者的淋巴浸潤和不良預(yù)后顯著相關(guān)，且證實miR-655在食管鱗狀上皮癌細胞中具有腫瘤抑制功能。雖然有一些研究報道了miR-655的生物學功能，但關(guān)于它在腫瘤中的研究仍較少，其具體機制，特別是在肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）中的機制仍缺乏深入的研究。因此，本研究旨在闡明miR-655-3p在LIHC中潛在的生物學作用，并分析其可能的調(diào)控機制，為進一步明確miR-655-3p在LIHC中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基于OncomiR數(shù)據(jù)庫分析miR-655-3p在LIHC中的表達

OncomiR（http：//www.oncomir.org）是一個可用于探索癌癥中miRNA表達失調(diào)的在線資源平臺。從OncomiR數(shù)據(jù)庫中下載與LIHC組織相關(guān)的miR-655-3p表達數(shù)據(jù)，分析在LIHC組織與正常肝組織之間miR-655-3p的表達情況。

1.2 篩選miR-655-3p靶基因

利用miRWalk（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de）、miRDB（http：//mirdb.org）和TargetScan 8.0（http：//www. targetscan.org）3種靶基因預(yù)測工具篩選miR-655-3p靶基因。使用韋恩工具將3個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果繪制韋恩圖，取交集。從miRTarBase數(shù)據(jù)庫（https：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/）中提取經(jīng)實驗證實的miR-655-3p靶基因。將兩者數(shù)據(jù)合并，作為靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.3 靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫對獲取的miR-655-3p相關(guān)靶基因集進行GO功能和KEGG通路富集分析。其中，功能注釋分析包含了生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個組分。以P＜0.05為標準獲取具有統(tǒng)計學差異的功能分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路數(shù)據(jù)，最終選取排名前十位數(shù)據(jù)結(jié)果繪制成條形圖或氣泡圖。

1.4 構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)及篩選核心基因

將miR-655-3p靶基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)名稱依次輸入STRING（https：//cn.string-db. org/）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建miR-655-3p相關(guān)靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白質(zhì)無任何連接的節(jié)點。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進一步分析，利用CytoHubba插件與MCC算法計算每個基因節(jié)點的分值，篩選出排名前十位的基因，即為核心（hub）基因。

1.5 驗證核心基因在LIHC組織中的表達及與臨床分期、預(yù)后的關(guān)系

利用GEPIA工具（http：//gepia.cancer-pku.cn）分析驗證PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因在LIHC組織和正常肝組織中的表達差異。進一步探索這些核心基因與LIHC臨床分期的關(guān)系及對患者生存預(yù)后的影響。

2 結(jié)果

2.1 miR-655-3p在LIHC組織及相應(yīng)正常組織中的表達情況

hsa-miR-655-3p在LIHC組織中的表達水平顯著低于正常組織（P<0.05，表1）。

2.2 miR-655-3p靶基因的篩選

通過miRWalk、miRDB和Targetscan 3種軟件預(yù)測miR-655-3p的靶基因數(shù)分別為1 327、1 294和850個，取交集獲得靶基因有65個（圖1A）。從miRTarBase數(shù)據(jù)庫中查詢的已通過實驗證實的靶基因有93個，其中有5個靶基因（ATAD2、MAGI2、SLC35F5、ELK4、CANX）與上述預(yù)測靶基因交集重疊，最終共獲得153個候選靶基因用于后續(xù)分析（圖1B）。

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集分析

運用 DAVID 數(shù)據(jù)庫對153個篩選靶基因進行功能及通路富集分析。GO分析結(jié)果顯示，miR-655-3p靶基因主要參與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)元遷移、血管形成、衰老、凋亡調(diào)控等過程；在細胞組分方面，miR-655-3p靶基因主要集中于細胞核、核染質(zhì)、核質(zhì)、細胞質(zhì)以及胞液等；在分子功能方面， 主要富集于RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性結(jié)合、RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)的結(jié)合功能等（圖2A）。KEGG信號通路富集分析顯示，這些靶基因主要富集在人類T細胞白血病病毒1型感染、神經(jīng)營養(yǎng)因子、Rap1以及MAPK等相關(guān)信號通路（圖2B）。

2.4 miR-655-3p靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫對miR-655-3p相關(guān)靶基因構(gòu)建好PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入 Cytoscape軟件進行可視化，利用CytoHubba插件借助于MCC算法，最終篩選前十位的基因作為潛在的核心基因。分別是JUN（30）、FOXO1（19）、ZEB1（18）、SRF（11）、RAC1（10）、POU2F1（9）、BPTF（8）、ABT1（6）、GNL3（6）、UTP15（6）（圖3）。

2.5 驗證核心基因在LIHC中的表達和意義

GEPIA表達分析顯示，10個篩選的核心基因中僅RAC1表達水平在LIHC組織中明顯高于正常肝組織，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖4）。進一步通過GEPIA對RAC1與LIHC患者病理分期的相關(guān)性進行單因素方差分析，結(jié)果顯示RAC1與LIHC的病理分期顯著相關(guān)，差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖5）。生存分析顯示，RAC1高表達的LIHC患者總生存時間（overall survival，OS）短于RAC1低表達的LIHC患者（P<0.05，圖6），提示RAC1表達水平升高，LIHC患者總體預(yù)后更差。

3 討論

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥，在所有癌癥中病死率居第3位，對人體生命和健康造成了極大威脅[4]。當前，肝癌在我國的發(fā)病率和病死率也較高，已成為嚴重威脅我國居民健康的重大疾病[5]。盡管目前肝癌的治療手段多種多樣，然而其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明，針對中晚期肝癌的有效手段依然缺乏。深入探究和鑒定出肝癌發(fā)生發(fā)展過程中更多失調(diào)的miRNAs，進一步明確它們的生物學功能及作用機制，對肝癌患者的有效治療和預(yù)后評價具有極其重要的現(xiàn)實意義。

miR-655定位于人染色體14q32上。較多文獻資料顯示，miR-655參與并影響著多種腫瘤的惡性生物學行為。例如，miR-655-3p在肺腺癌細胞系中呈低表達，miR-655-3p過表達可靶向調(diào)控KIF20A抑制肺腺癌細胞增殖、遷移與侵襲，這種抑癌效應(yīng)可能與抑制RAS/MAPK通路有關(guān)[6]。另一研究發(fā)現(xiàn)miR-655在人口腔鱗狀細胞癌細胞系過表達后可減弱腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[7]。楊明環(huán)等[8]發(fā)現(xiàn)miR-655-3p通過靶向抑制TRIM59的表達，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲能力且誘導(dǎo)細胞凋亡。在肝細胞癌中，ADAM10被確定為miR-655-3p的直接靶點，miR-655-3p可能通過調(diào)節(jié)ADAM10和β-catenin通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用[9]。這說明miR-655-3p （miR-655） 在較多惡性腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，但其作用靶點及調(diào)控機制可能完全不同。當前，miR-655-3p在LIHC中的意義及其可能調(diào)控機制尚未完全闡明，可能有多個靶點及多條信號通路參與其中。

本研究基于OncomiR數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在LIHC組織中miR-655-3p表達水平顯著低于正常肝組織。有關(guān)研究結(jié)果也表明，miR-655-3p在LIHC組織和細胞系中顯著下調(diào)[9-10]，所以，推測表達下調(diào)的miR-655-3p在肝腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有潛在重要功能。為了進一步挖掘 miR-655-3p影響LIHC發(fā)生發(fā)展的作用機制，利用生物信息相關(guān)軟件對miR-655-3p下游靶基因進行預(yù)測及篩選。功能和信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要富集于RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、血管形成、衰老、凋亡等生物學過程的調(diào)控以及Rap1、MAPK等相關(guān)信號通路。血管形成是腫瘤發(fā)生、生長、浸潤與轉(zhuǎn)移的重要條件，而細胞凋亡異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中亦占有重要地位。腫瘤的發(fā)生發(fā)展也會與細胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)異常密切相關(guān)。如Rap1在細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。MAPK信號通路在許多腫瘤中常被激活，其多種成分已被確定為致癌基因。多項研究表明，MAPK信號通路的異常改變與癌癥有很強的相關(guān)性，其中包括結(jié)直腸癌[12]、胰腺癌[13]和LIHC[14]等。而MAPK信號通路在LIHC細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[15]。因此，從生物信息學分析角度而言，miR-655-3p可能通過調(diào)控一些關(guān)鍵基因影響生物學過程（和）或信號通路，從而在抑制腫瘤形成進展過程中發(fā)揮重要功能。

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub基因篩選推測出JUN、FOXO1、ZEB1、SRF及RAC1等基因是miR-655-3p參與LIHC生物學過程的關(guān)鍵基因。研究進一步發(fā)現(xiàn)，在這些關(guān)鍵基因中僅RAC1基因在LIHC組織中呈高表達，且與LIHC患者的臨床分期密切相關(guān)，這意味著高表達的RAC1在LIHC發(fā)生發(fā)展中可能具有極其重要的意義。生存分析也提示RAC1高表達可能與LIHC患者的不良預(yù)后有關(guān)，其表達水平的高低對LIHC患者的臨床預(yù)后判斷和評估具有一定的參考價值。RAC1（Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1）是Rho GTPase家族中的重要成員，對人類機體細胞的許多生理活動的完成至關(guān)重要，比如吞噬、黏附、運動、遷移及細胞增殖等。此外，已報道RAC1與多數(shù)癌癥有關(guān)，在血管生成、腫瘤侵襲和遷移中起重要作用。RAC1基因多被認為是一種促進人類癌癥惡性轉(zhuǎn)化和進展的癌基因，其活性和表達異常與腫瘤發(fā)生、存活、耐藥性、轉(zhuǎn)移等腫瘤特性密切相關(guān)[16]。RAC1在LIHC細胞的增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，間接或直接靶向RAC1小分子已在LIHC實驗?zāi)Ｐ椭酗@示出抗癌效應(yīng)，過度表達或過度激活的RAC1有望作為治療LIHC的靶點[17]。研究發(fā)現(xiàn)miR-655-3p預(yù)測篩選的關(guān)鍵靶基因RAC1與腫瘤LIHC患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，推測miR-655-3p 在LIHC發(fā)生發(fā)展中的重要作用可能與其調(diào)控的PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因RAC1有關(guān)。

綜上所述，通過生物信息數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-655-3p 可能通過調(diào)節(jié)RAC1基因影響LIHC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，能為后期深入研究miR-655-3p在LIHC中的調(diào)控機制及尋找新靶點提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]ZHA J F， CHEN D X. MiR-655-3p inhibited proliferation and migration of ovarian cancer cells by targeting RAB1A[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2019， 23（9）： 3627-3634.

[2]LV Z D， KONG B， LIU X P， et al. MiR-655 suppresses epithelial-to-mesenchymal transition by targeting Prrx1 in triple-negative breast cancer[J]. Journal of Cellular And Molecular Medicine， 2016， 20（5）： 864-873.

[3]KIUCHI J， KOMATSU S， IMAMURA T， et al. Low levels of tumour suppressor miR-655 in plasma contribute to lymphatic progression and poor outcomes in oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Molecular Cancer， 2019， 18（1）： 2.

[4]SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2021， 71（3）： 209-249.

[5]CAO W， CHEN H D， YU Y W， et al. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China： a secondary analysis of the global cancer statistics 2020[J]. The Chinese Medical Journal， 2021， 134（7）： 783-791.

[6]杜雪梅， 張運梅， 周文婷， 等. MiR-655-3p靶向KIF20A抑制人肺腺癌細胞系A(chǔ)549遷移及侵襲[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床， 2022， 42（4）：599-606.

[7]WANG Q， LV L K， LI Y， et al. MicroRNA-655 suppresses cell proliferation and invasion in oral squamous cell carcinoma by directly targeting metadherin and regulating the PTEN/AKT pathway[J]. Molecular Medicine Reports， 2018， 18（3）： 3106-3114.

[8]楊明環(huán)， 張波， 湯祥軍， 等. MiR-655-3p調(diào)控TRIM59對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響[J]. 中國臨床神經(jīng)科學， 2022， 30（1）： 8-15， 48.

[9]WU G， ZHENG K M， XIA S G， et al. MicroRNA-655-3p functions as a tumor suppressor by regulating ADAM10 and β-catenin pathway in hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research， 2016， 35（1）： 89.

[10]ZHAO X Q， LIANG B， JIANG K， et al. Down-regulation of miR-655-3p predicts worse clinical outcome in patients suffering from hepatocellular carcinoma[J].? European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2017， 21（4）： 748-752.

[11]朱包良， 湯海博， 欒紹齋， 等. Rac1與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2020， 26（16）：3190-3195， 3200.

[12]PONSIOEN B， POST J B， DES AMORIE J R B， et al. Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signalling[J]. Nature Cell Biology， 2021， 23（4）： 377-390.

[13]RAVICHANDRAN M， HU J J， CAI C， et al. Coordinated transcriptional and catabolic programs support iron-dependent adaptation to RAS-MAPK pathway inhibition in pancreatic cancer[J]. Cancer Discovery， 2022， 12（9）： 2198-2219.

[14]CHAN L K， HO D W H， KAM C S， et al. RSK2-inactivating mutations potentiate MAPK signaling and support cholesterol metabolism in hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Hepatology， 2021， 74（2）： 360-371.

[15]王兆林， 王蓋昊， 于曉輝. MAPK 信號通路在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學， 2016（2）： 326-330.

[16]朱包良， 湯海博， 欒紹齋， 等. Rac1與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進展[J]. 醫(yī)學綜述， 2020， 26（16）： 3190-3195， 3200.

[17]SAUZEAU V， BEIGNET J， VERGOTEN G， et al. Overexpressed or hyperactivated Rac1 as a target to treat hepatocellular carcinoma[J]. Pharmacological Research， 2022， 179： 106220.