田佳澤，江悅艇，陳奕霖，廖海昌，侯羽婷，于亞莉

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春 130062）

油莎豆屬于被子植物門中的單子葉植物綱莎草目莎草科莎草屬[1]，又稱為油莎草、鐵荸薺、地杏仁、地下核桃、人參果、油豆等，在國外又被稱作虎堅果、老虎豆等。油莎豆中各種營養(yǎng)成分豐富，除油脂、膳食纖維、糖、蛋白質(zhì)、淀粉和維C、維E外，還富含人體所需的磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)[2]。此外，油莎豆中還含有豐富的生物活性物質(zhì)，如甾醇、生物堿、丹寧、類黃酮等[3]。

21 世紀以來，國內(nèi)外的許多學者對油莎豆中主要營養(yǎng)成分——油的提取進行了積極的探索[4]，但是對于榨油后的油莎豆豆粕研究卻不多，大多數(shù)油莎豆豆粕都被廢棄掉，造成極大浪費。用油莎豆豆粕作為原料，采用了酶解法、乙醇溶劑法及酶解輔助醇提法3 種不同的方法，對油莎豆豆粕中的黃酮類物質(zhì)進行了提取，并對工藝進行了優(yōu)化，為該物質(zhì)在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與分析方法

1.1 材料與試劑

油莎豆豆粕粉，市售；蘆丁標樣（純度等級AR），酷爾化學（北京） 科技有限公司提供；纖維素酶（純度等級BR），上海源葉生物科技有限公司提供；乙醇（純度等級AR）、鹽酸（純度等級AR）、氫氧化鈉（純度等級AR），北京化工廠提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-4802 型紫外可見分光光度計，尤尼科（上海） 儀器有限公司產(chǎn)品；PHSJ-4F 型pH 計，上海禹昂自動化科技有限公司產(chǎn)品；ESJ 180-4 型電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司產(chǎn)品；LD4-2A 型離心機，北京市雷博爾離心機有限公司產(chǎn)品；DK-98-II 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；SJIA-10N-50A 型真空冷凍干燥機，寧波雙嘉儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 提取量檢測

1.3.1 標準曲線繪制

精確稱取5.5 mg 蘆丁對照品于10 mL 的容量瓶，加入75%乙醇溶液，溶解后，加入75%乙醇定容成550 μg/mL 的對照溶液。準確吸取以下梯度的蘆丁對照品溶液，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL于6 個10 mL 容量瓶中。然后依次加入5 g/100 mL的亞硝酸鈉溶液體積0.3 mL，10 g/100 mL 的硝酸鋁溶液體積0.3 mL，10 g/100 mL 的氫氧化鈉溶液4 mL，每次加入上述的溶液之后，都需振蕩搖勻，靜置6 min后再加入到下一個溶液中，最后用體積分數(shù)70%的乙醇溶液定容至10 mL。

于波長510 nm處，以蘆丁空白作為對照組，進行比色法測定樣品的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，通過橫縱坐標繪制標準曲線[5]，得到回歸方程：Y=0.015 28X-0.180 46，R2=0.997 02。

1.3.2 提取量測定

精確量取1.0 mL 的樣品溶液于10 mL 的容量瓶，按序加入5 g/100 mL 的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，10 g/100 mL 的硝酸鋁溶液0.3 mL，10 g/100 mL 的氫氧化鈉水溶液4 mL，每次加入一種溶液之后，都需要振蕩搖勻，靜置6 min 后，再加入下一種溶液中，最后加入體積分數(shù)為70%的乙醇溶液定容至10 mL[6]。利用紫外分光光度計儀器，采用比色法，于波長510 nm處測定待測物質(zhì)的吸光度，并利用回歸方程這一數(shù)學工具，獲取樣品的黃酮提取量，并且通過其計算出油莎豆豆粕中的黃酮類物質(zhì)的提取量，公式如下：

式中：R——油莎豆豆粕中的類黃酮提取量，mg/g；

m——油莎豆豆粕粉的質(zhì)量，g；

C——所測得的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品溶液體積，mL；

n——溶液稀釋的倍數(shù)。

2 試驗方法

2.1 酶解水提法

纖維素酶作用于植物細胞的細胞壁，使構(gòu)成植物細胞的細胞壁成分被分解成小分子物質(zhì)，降低在提取黃酮類物質(zhì)中遇到的阻力，從而促進其更好地從細胞中溶出[7]。

準確稱取干燥后的2.0 g 油莎豆粕粉末放于三頸圓底燒瓶中，加入適當?shù)睦w維素酶和適當體積的水，調(diào)節(jié)pH 值至相應(yīng)條件，放在恒溫水浴鍋中，進行一定時間的酶解提取，之后高溫滅酶10 min，冷卻至室溫后離心，收集上清液，按照上述方法對提取量進行測定。

以樣品中黃酮提取量為指標，分別選取5 個單因素25 個值進行試驗。即酶用量0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mg/mL；pH 值3，4，5，6，7；酶解溫度30，40，50，60，70 ℃；酶解時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h；料 液 比1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1∶50（g∶mL）。以每個單因素條件最佳值的范圍為依據(jù)，通過正交試驗對黃酮類物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，以獲得酶解法的最佳工藝條件。

2.2 醇提法

依據(jù)相似相溶原理可知，黃酮類物質(zhì)易溶于有機溶劑中，因此可以利用乙醇溶液提取油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)[8]。

準確稱取干燥后的2.0 g 油莎豆粕粉末放于三頸圓底燒瓶中，加入適量的纖維素酶和一定體積分數(shù)的乙醇，在恒溫條件中提取一定時間，冷卻至室溫后離心，收集上清液按照上述方法對提取量進行測定。

以黃酮提取量為指標，分別選取了4 個單因素20 個值進行試驗。即乙醇體積分數(shù)30%，40%，50%，60%，70%，80%；提取溫度30，40，50，60，70 ℃；恒溫水浴時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h；料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL）。以每個單因素條件最佳值的范圍為依據(jù)，通過正交試驗對黃酮類物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，以獲得乙醇提取法的最佳工藝條件。

2.3 酶解醇提法

纖維素酶和乙醇溶液的協(xié)同作用使得油莎豆豆粕中的細胞壁被充分破壞，有利于細胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)浸出[9]。

準確稱取干燥后的2.0 g 油莎豆粕粉末放于三頸圓底燒瓶中，加入適量的纖維素酶和適當體積分數(shù)的乙醇，調(diào)pH 值至相應(yīng)條件，放在恒溫水浴鍋中，進行一定時間的酶解提取，之后高溫滅酶10 min，冷卻至室溫后離心，收集上清液，按照上述方法對提取量進行測定。

以黃酮提取量為指標，分別選取了6 個單因素30 個值進行試驗。即酶用量0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mg/mL；pH 值3，4，5，6，7；酶解溫度30，40，50，60，70 ℃；酶解時間1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h；料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g∶mL）；乙醇體積分數(shù)為10%，20%，30%，40%，50%。以每個單因素條件最佳值的范圍為依據(jù)，通過正交試驗對黃酮類物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，以確定酶解輔助乙醇法的最佳工藝條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 酶解水提法

3.1.1 單因素試驗

（1） 酶用量對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h，料液比1∶30（g∶mL） 的條件下，考查酶用量對黃酮類物質(zhì)提取量的影響。

酶用量對黃酮提取量的影響見圖1。

圖1 酶用量對黃酮提取量的影響

由圖1 可知，當逐漸提高纖維素酶用量時，黃酮的提取量也在不斷地上升，把油莎豆豆粕作為底物時，物料濃度是一定的，當增大纖維素酶用量時，酶的濃度增加，這大大加快了酶與底物的反應(yīng)速度和細胞破裂，導致黃酮類類物質(zhì)的溶解，提取量自然增加。當酶用量增大到0.75 mg/mL 時，溶液中酶的濃度趨于飽和狀態(tài)，黃酮的提取量增加的速度會變慢。當黃酮的提取量達最大值時，黃酮的提取量不隨酶用量的增加而變化。當酶用量繼續(xù)增加時，可能會導致酶水解過度，對黃酮類物質(zhì)的糖苷鍵產(chǎn)生一定影響，導致黃酮類物質(zhì)的提取量減小。因此，結(jié)合實際情況，選擇酶的最佳用量應(yīng)為0.75 mg/mL。

（2） 酶解溫度對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在纖維素酶用量0.75 mg/mL，pH 值5.0，酶解時間1.5 h，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查酶解溫度對黃酮提取量的影響。

酶解溫度對黃酮提取量的影響見圖2。

圖2 酶解溫度對黃酮提取量的影響

由圖2 可知，當酶解溫度不斷升高時，黃酮類物質(zhì)提取量逐漸增大，在50 ℃時達到了最大值。當酶解溫度超過50 ℃后，溫度進一步上升，黃酮的提取量卻開始有下降的趨勢。一方面，溫度的增高降低了酶的活性，纖維素酶不能有效地破壞細胞壁，影響黃酮類物質(zhì)的有效溶出；另一方面過高的溫度會增加試驗的能耗[10]。因此，考慮到實際效益，選擇最佳酶解溫度在50 ℃左右。

（3） pH 值對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。pH 值對酶解來說是很重要的一個因素，最佳的pH值能發(fā)揮出酶的最佳效能[11]。在纖維素酶用量0.75 mg/mL，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h，料液比1∶30（g∶mL） 的條件下，考查pH 值對黃酮提取量的影響。

pH 值對黃酮提取量的影響見圖3。

圖3 pH 值對黃酮提取量的影響

由圖3 可知，隨著pH 值的變大，黃酮的提取量在不斷增加，當pH 值等于5.0 時，黃酮的提取量最高。此后再增加pH 值，黃酮類物質(zhì)提取量趨近于平緩甚至下降，原因可能是由于溶液中pH 值的不斷增大，超出纖維素酶作用的最適宜pH 值范圍，導致酶不能有效發(fā)揮其作用。因此，選擇最佳pH 值在5.0左右。

（4） 酶解時間對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在纖維素酶用量0.75mg/mL，酶解溫度50 ℃，pH 值5.0，料液比1∶30（g∶mL） 的條件下，考查酶解時間對黃酮類物質(zhì)的提取量的影響。

酶解時間對黃酮提取量的影響見圖4。

圖4 酶解時間對黃酮提取量的影響

由圖4 可知，隨著酶解時間的延長，提取出的黃酮類物質(zhì)也在不斷增多，當酶解時間為2 h 時，黃酮的提取量最大。此時，延長酶解時間可以讓底物和酶之間的反應(yīng)進行得更加充分，提高了黃酮的提取量。若酶解時間過長，黃酮的提取量將會進一步下降。長時間的反應(yīng)反而使酶逐漸失去活性，導致了提取量的減少。因此，從各方面因素綜合考慮，選擇的最佳酶解時間在2 h 左右。

（5） 料液比對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在纖維素酶用量0.75 mg/mL，酶解時間2 h，pH 值5.0，酶解溫度50 ℃條件下，考查料液比對黃酮提取量的影響。

料液比對黃酮提取量的影響見圖5。

圖5 料液比對黃酮提取量的影響

由圖5 可知，當料液比發(fā)生變化時，黃酮的提取量也會發(fā)生較為明顯的變化。當料液比為1∶10 ～1∶30（g∶mL） 時，黃酮的提取量將會因為提取液體積的增大而提高；當料液比為1∶30 時，提取量達到最大值，之后提取液進一步增大，黃酮類物質(zhì)提取量反而下降。料液比對于試驗十分重要，如果料液比太小，在試驗過程中物料可能不會被完全酶解，最終造成黃酮提取量較低，如果料液比太大，將對水資源造成一定的浪費，而且不利于試驗的進行。從經(jīng)濟條件考慮，選取料液比在1∶30（g∶mL）左右較為適宜。

3.1.2 正交試驗的設(shè)計

（1） 試驗設(shè)計。根據(jù)以上單因素試驗獲得的范圍，以油莎豆豆粕中的黃酮提取量為考查指標，設(shè)計正交試驗，以確定最優(yōu)的方案，即采用L9（35）的正交表來進行試驗。

因素水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果分析見表2。

表1 因素水平設(shè)計

（2） 數(shù)據(jù)處理。由表2 可知，RA＞RC＞RD＞RE＞RB，即影響油莎豆的豆粕中黃酮提取量的各因素順序為料液比（A） ＞酶用量（C） ＞pH 值（D） ＞提取時間（E） ＞提取溫度（B）。影響較大的因素有料液比、酶用量和pH 值，影響較小的因素為溫度和時間。

表2 正交試驗結(jié)果分析

從試驗實際的角度看來，酶解法提取的黃酮量會隨著料液比的增大而增大，但是與此同時提取液中酶和底物的濃度減少，溶出的雜質(zhì)含量會增加。在試驗過程中，處于理想值的料液比才能使提取充分。因此，選擇酶用量0.875 mg/mL，酶解溫度55 ℃，pH 值5.0，酶解時間2 h，料液比1∶35（g∶mL）作為酶解法的最佳試驗條件。

綜上，在上述確定的酶解法最佳試驗條件下再次進行試驗，得到黃酮提取量為5.624 mg/g。試驗證明，酶解法可使油莎豆豆粕中的黃酮類物質(zhì)充分釋放出來，而且操作簡單、溶劑無污染、成本低，但較長的提取時間可能會將易溶于熱水的無機鹽、蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)一并提取，降低了黃酮類物質(zhì)的純度，對試驗造成一定的干擾。而且純度低會導致后續(xù)分離純化等步驟增多，增加了試驗的復雜性[12]。

3.2 醇提法

3.2.1 單因素試驗

（1） 乙醇體積分數(shù)對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在料液比1∶30（g∶mL），提取時間2 h，提取溫度60 ℃條件下，考查乙醇體積分數(shù)對油莎豆豆粕中黃酮的提取量的影響。

乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響見圖6。

由圖6 可知，提取過程中，當乙醇體積分數(shù)太小時，提取液的極性影響黃酮提取效果[13]，導致了提取液中的黃酮量較低；當乙醇體積分數(shù)達到60%時，溶劑的極性和細胞中黃酮的極性相接近，從而導致了溶出率最大；當乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大時，黃酮提取量減少，可能是由于高濃度的乙醇易揮發(fā)，且揮發(fā)性乙醇中含有黃酮，導致最終黃酮提取量減小了。因此，提取油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)的乙醇體積分數(shù)應(yīng)選擇60%。

圖6 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響

（2） 提取溫度對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在料液比1∶30（g∶mL），提取時間2 h，乙醇體積分數(shù)60%條件下，考查提取溫度對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。

提取溫度對黃酮提取量的影響見圖7。

圖7 提取溫度對黃酮提取量的影響

由圖7 可知，當提取溫度一直上升到50 ℃時，油莎豆豆粕中黃酮的提取量出現(xiàn)了峰值，由于熱效應(yīng)及溶劑效應(yīng)的共同影響，使得分子的運動速度越來越快，有利于黃酮類物質(zhì)溶出，黃酮提取物的提取量也隨之增加。所以，油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)提取的最佳提取溫度應(yīng)是50 ℃。

（3） 提取時間對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在料液比1∶30（g∶mL），提取溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)60%條件下，考查提取時間對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。

提取時間對黃酮提取量的影響見圖8。

圖8 提取時間對黃酮提取量的影響

由圖8 可知，油莎豆豆粕中黃酮提取量隨著提取時間的延長而增加，當提取時間在2 h 時，黃酮的提取量出現(xiàn)最大值；當提取時間大于2 h 后，黃酮提取量呈下降的趨勢，隨著提取時間的繼續(xù)延長，其提取量下降的幅度不明顯，基本維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。結(jié)合實際效益考慮，油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)的最佳提取時間應(yīng)選擇2 h。

（4） 料液比對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在提取時間2 h，提取溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)60%恒定不變的條件下，考查料液比對油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)提取量的影響。

料液比對黃酮提取量的影響見圖9。

圖9 料液比對黃酮提取量的影響

由圖9 可知，在一定范圍內(nèi)，油莎豆豆粕中黃酮的提取量隨料液比的增加而增加，這可能是由于料液比對溶劑傳質(zhì)過程速度的影響，料液比越大，溶劑的傳質(zhì)速度越快，黃酮類類物質(zhì)的浸出速率也越大；料液比為1∶30 時，油莎豆豆粕中的黃酮提取量最高；而當料液比繼續(xù)增大時，黃酮類物質(zhì)的提取量變化不大。還可看出，當料液比增加到一定程度時，黃酮類類物質(zhì)在溶劑中的浸出將達到飽和的狀態(tài)[14]，因此提取油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)的最佳條件是料液比控制在1∶30（g∶mL） 左右。

3.2.2 正交試驗的設(shè)計

（1） 試驗設(shè)計。根據(jù)以上單因素試驗獲得的確定范圍，以油莎豆豆粕中的黃酮提取量為考查指標，按照設(shè)計L9（34）正交試驗，研究各因素對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響，以確定最優(yōu)的方案.

因素水平設(shè)計見表3，正交試驗結(jié)果分析見表4。

表3 因素水平設(shè)計

（2） 數(shù)據(jù)處理。由表4 可知，R'D'＞R'B'＞R'A'＞R'C'，即乙醇提取法中各因素對黃酮提取量的影響程度排序為料液比（D'） ＞提取時間（A'） ＞乙醇體積分數(shù)（C'） ＞提取溫度（B'）。從油莎豆豆粕中提取黃酮的最佳工藝為A'1B'3C'1D'3，即由此可見，最佳提取條件為料液比1∶35（g∶mL），提取溫度55 ℃，乙醇體積分數(shù)55%，提取時間1.75 h。

表4 正交試驗結(jié)果分析

綜上，以最佳提取條件為料液比1∶35（g∶mL），提取溫度55 ℃，乙醇體積分數(shù)55%，提取時間1.75 h下再次進行試驗，得到該條件下的黃酮提取量為7.101 mg/g，相比于酶解法，乙醇提取法顯著增大了油莎豆豆粕中黃酮提取量，而且提取過程簡單安全，具有良好的實用價值。

3.3 酶解醇提法

3.3.1 單因素試驗

（1） 酶用量對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h，乙醇體積分數(shù)30%，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查酶用量對黃酮提取量的影響。

酶用量對黃酮提取量的影響見圖10。

圖10 酶用量對黃酮提取量的影響

由圖10 可知，隨著酶用量的增加，酶和乙醇協(xié)同作用使得黃酮提取量大幅度增大，當酶用量繼續(xù)增大至0.75 mg/mL 時，酶的濃度已達到飽和，此時黃酮提取量趨于穩(wěn)定，持續(xù)增加酶用量只會使酶的浪費。故而，選取酶用量為0.75mg/mL。

（2） 酶解溫度對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶用量0.75 mg/mL，酶解時間1.5 h，乙醇體積分數(shù)30%，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查酶解溫度對黃酮提取量的影響。

酶解溫度對黃酮提取量的影響見圖11。

由圖11 可知，酶解溫度越高，酶解效果越好。但是，如果溫度過高，一方面酶的活性會受到一定的抑制，提取效果會下降；另一方面，提取過程中溶解的雜質(zhì)也在增加，將增加試驗的復雜性和能耗。因此，根據(jù)實際情況，最佳酶解溫度為50 ℃。

圖11 酶解溫度對黃酮提取量的影響

（3） pH 值對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。pH 值不僅影響纖維素酶構(gòu)象，還影響底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性。在酶用量0.75 mg/mL，酶解溫度50 ℃，酶解時間1.5 h，乙醇體積分數(shù)30%，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查pH 值對黃酮提取量的影響。

pH 值對黃酮提取量的影響見圖12。

圖12 pH 值對黃酮提取量的影響

由圖12 可知，黃酮提取量隨pH 值的增大呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢。當pH 值5.0 時，黃酮提取量最大；再繼續(xù)增大pH 值，纖維素酶活性下降，影響破壞細胞壁的致密構(gòu)造的效果，使得乙醇無法更好地發(fā)揮作用，從而導致黃酮提取量下降。因此，從實際出發(fā)，試驗最適pH 值為5.0。

（4） 酶解時間對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶用量0.75 mg/mL，酶解溫度50 ℃，乙醇體積分數(shù)30%，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查酶解時間對黃酮提取量的影響。

酶解時間對黃酮提取量的影響見圖13。

圖13 酶解時間對黃酮提取量的影響

由圖13 可知，黃酮提取量隨著酶解時間的延長而增大，酶解時間為2 h 時，黃酮提取量較高。再延長酶解時間，提取量基本不變，但是雜質(zhì)的溶出率會隨著酶解時間的延長不斷升高，結(jié)合節(jié)省時間、降低成本，故試驗選取酶解時間為2 h。

（5） 乙醇體積分數(shù)對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶用量0.75 mg/mL，酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，料液比1∶30（g∶mL） 條件下，考查乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響。

乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響見圖14。

圖14 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響

由圖14 可知，不同乙醇體積分數(shù)下纖維素酶乙醇提取的得率均高于單一的醇提，這是由于細胞壁的酶水解和黃酮類類物質(zhì)的乙醇浸出的協(xié)同效應(yīng)。分析結(jié)果可知，選擇30%的乙醇體積分數(shù)為最佳提取條件。

（6） 料液比對油莎豆豆粕中黃酮提取量的影響。在pH 值5，酶用量0.75 mg/mL，酶解時間1.5 h，酶解溫度50 ℃，乙醇體積分數(shù)30%條件下，考查料液比對黃酮提取量的影響。

料液比對黃酮提取量的影響見圖15。

圖15 料液比對黃酮提取量的影響

由圖15 可知，在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，提取出的黃酮類物質(zhì)在逐漸增加，當料液比為1∶30（g∶mL） 時，其提取量最高，隨后繼續(xù)增加料液比，提取量反而下降至一個穩(wěn)定水平。這是由于過大的料液比會使得樣品可能沒有被酶解徹底，最終會導致黃酮提取量偏低，而且料液比過大，不僅浪費資源，而且會溶出更多雜質(zhì)，不利于后續(xù)試驗的進行。從經(jīng)濟條件考慮，試驗選擇料液比為1∶30（g∶mL）。

3.3.2 正交試驗

（1） 試驗設(shè)計。根據(jù)以上單因素試驗獲得的確定范圍，以油莎豆豆粕中的黃酮提取量為考查指標，按照L18（36）正交試驗，研究6 個因素對提取油莎豆豆粕中黃酮類物質(zhì)的影響，以確定最優(yōu)的方案。

因素水平設(shè)計見表5，正交試驗結(jié)果分析見表6。

表5 因素水平設(shè)計

表6 正交試驗結(jié)果分析

（2） 數(shù)據(jù)處理。由直觀分析可知，R''B''＞R''C''＞R''F＞R''E'，各因素對黃酮提取量的影響的程度排序為料液比（B） ＞提取溫度（C） ＞時間（F） ＞pH 值（E），乙醇體積分數(shù)和酶解時間影響不大。由此得出的最佳工藝組合為A''1B''3C''1D''1E''2F''1。由此可見，確定最佳提取條件為料液比1∶35（g∶mL），酶解溫度55 ℃，乙醇體積分數(shù)35%，酶解時間2 h，pH 值5，酶用量0.65 mg/mL。

綜上所述，以料液比1∶35（g∶mL），酶解溫度55 ℃，乙醇體積分數(shù)35%，酶解時間120 min，pH值5，酶用量0.65 mg/mL 為最佳工藝條件下，再次試驗得到的黃酮提取量為8.582 mg/g。相比于酶解法和乙醇提取法，纖維素酶和乙醇發(fā)揮協(xié)同作用能較大程度地提取有效成分，纖維素酶輔助提取黃酮的提取率更高。

4 結(jié)論

不同提取方法對黃酮總提取量的影響見表7。

表7 不同提取方法對黃酮總提取量的影響

目前，具有操作方便、提取條件溫和、提取過程安全、提取效率高、能較大程度地保留有效成分的優(yōu)點提取黃酮類物質(zhì)的方法有3 種，分別是酶解法、有機溶劑提取法和超聲波輔助法[15]。如何在試驗中配合使用這3 種簡單的方法，獲得更高的提取量是未來黃酮類物質(zhì)提取的研究方向。

試驗將前2 種方法進行了結(jié)合，探究了黃酮提取的最佳工藝條件。由表7 可知，纖維素酶- 水溶液提取油莎豆豆粕中黃酮的得率最小，酶- 乙醇提取的得率最高。這是由于纖維素酶- 水提法提取黃酮雜質(zhì)較多，如無機鹽、蛋白質(zhì)、糖等，因此提取率最低。在油莎豆豆粕中黃酮提取中加入纖維素酶和乙醇溶液后，酶破壞油莎豆豆粕中細胞壁結(jié)構(gòu)，使黃酮類物質(zhì)更好地溶于乙醇溶液中，二者對黃酮類物質(zhì)的浸出產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使黃酮溶出率明顯增加。結(jié)合各種因素的考慮，采用酶- 乙醇溶液更有利于油莎豆豆粕中黃酮的提取[16]。