許雷 馬維娟 張志杰 張龍穆

2015年全球7 100萬人有慢性HCV感染，我國一般人群抗-HCV陽性率約為0.60%[1]，自從1998年實現(xiàn)無償獻血和HCV篩查以來，獻血人群HCV感染率大幅下降。現(xiàn)用于血液篩查HCV感染的指標(biāo)包括血清學(xué)和HCV RNA檢測，HCV RNA檢測是丙型肝炎早期診斷最有效指標(biāo)，但在丙型肝炎感染者中HCV RNA可以由陽性轉(zhuǎn)陰性或波動性出現(xiàn)，病毒載量極低的情況下（血液HCV RNA檢測陰性）仍有造成輸血傳播的風(fēng)險[2]。目前國內(nèi)采供血機構(gòu)多數(shù)通過檢測血清抗-HCV結(jié)合核酸檢測來判斷是否有HCV的感染[3-5]。用于血液篩查的抗-HCV試劑主要有：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）間接法和雙抗原夾心法，有研究指出，不同廠家抗-HCV試劑的靈敏度和特異性有明顯差異[6]?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》（2019版）規(guī)定可采用一遍血清學(xué)一遍核酸進行血液HCV篩查，評價選擇符合采供血機構(gòu)需求的血清學(xué)檢測試劑，可以更好地發(fā)揮酶免檢測與核酸檢測的互補效果，更好地為臨床提供安全合格血液。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年1—12月青島地區(qū)獻血者標(biāo)本119 602人例進行抗-HCV檢測，留取部分抗-HCV反應(yīng)性標(biāo)本（61例）進行補充實驗，其中單試劑反應(yīng)性46例，雙試劑反應(yīng)性15例。采用EDTA- K2分離膠抗凝真空采血管（美國BD公司），采血管在采血后4 h內(nèi)離心，1 100 r/min離心15 min后保存于2～8℃冰箱，核酸檢測完標(biāo)本置于-30℃冰箱凍存，以備進行補充和確認試驗。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)檢測方法

使用哈美頓全自動加樣儀STAR（瑞士Hamilton公司）、哈美頓全自動酶免分析儀 FAME （瑞士Hamilton公司）進行血清學(xué)檢測。抗- HCV ELISA 間接法試劑包括：Murex HCV ELISA（美國，以下簡稱a試劑）；新創(chuàng)抗-HCV檢測試劑（廈門，以下簡稱 b試劑）；Ortho HCV 3.0 ELISA（美國，以下簡稱c試劑）；麗珠抗-HCV檢測試劑（珠海，以下簡稱 d試劑）。ELISA夾心法試劑：萬泰第4代ELISA 檢測試劑（北京，以下簡稱夾心法試劑）。血清學(xué)確證試劑使用萬泰HCV確證試劑（北京，簡稱RIBA）。

1.2.2 核酸檢測方法

使用Procleix Panther核酸檢測系統(tǒng)（西班牙蓋立復(fù)）及其檢測試劑Procleix Elite；羅氏Cobas s 201核酸檢測系統(tǒng)（美國羅氏）及Cobas MPX 2.0檢測試劑進行核酸檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 ELISA檢測

STAR全自動加樣儀加樣，采用全自動酶免分析標(biāo)儀FAME進行兩種試劑兩次檢測，按儀器和試劑盒的要求進行操作。應(yīng)用夾心法試劑對61例標(biāo)本進行再次檢測，按試劑使用說明書，450/630 nm 波長下比色讀取吸光度值（optical density，OD），樣本S/Co值≥1判斷為反應(yīng)性，樣本S/Co＜1判定為非反應(yīng)性。

1.3.2 NAT檢測

Panther檢測系統(tǒng)采用單人份檢測模式，S/Co值≥1 判斷為反應(yīng)性，樣本S/CO值＜1判定為非反應(yīng)性，初次檢測有反應(yīng)性的標(biāo)本進行項目鑒別實驗。Cobas s 201檢測系統(tǒng)采用6人例混樣檢測模式，經(jīng)初次檢測無反應(yīng)性的標(biāo)本判為陰性，初次檢測有反應(yīng)性進行拆分實驗，循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct值）＜60為陽性，Ct值無顯示為陰性。

1.3.3 補充確認試驗

對61例標(biāo)本進行RIBA法和RNA檢測，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。其中RIBA確認試劑按照使用說明書至少2條帶≥1+為陽性，1條帶≥1+為可疑，沒有≥1+條帶為陰性，確認試劑中出現(xiàn)一次陽性判為確認陽性。確認試驗RIBA陽性（RIBA+）和（或）HCV RNA陽性（RNA+）的樣本判定HCV真陽性，RIBA試劑均不確定且HCV RNA陰性（RIBA IND /RNA-）的判為不確定，RIBA和HCV RNA陰性判定為真陰性樣本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同試劑之間抗-HCV陽性率以n（%）表示，比較采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗-HCV初篩（間接法）反應(yīng)性

表1顯示，抗-HCV間接法試劑初篩檢測獻血者標(biāo)本119 602人例，反應(yīng)性210例（1.76‰），其中單試劑反應(yīng)性187例（1.56‰），占比89.05%（187/210）。進口間接法試劑反應(yīng)性比例高于國產(chǎn)試劑（a試劑 VS b試劑、c試劑 VS d試劑），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.525、39.321，P＜0.05）。

2.2 2種試劑與確證結(jié)果的符合性

本研究留取的61例初篩反應(yīng)性標(biāo)本中，確認試驗陽性標(biāo)本14例（RIBA+/RNA+ 9例 、RIBA+/RNA- 5例），確認陰性標(biāo)本40例（RIBA-/RNA-）（另外7例為RIBA IND/RNA-，按不符合統(tǒng)計，表2）。

表2 2種試劑檢測結(jié)果與RIBA確證結(jié)果的符合情況（例）

2.3 2種試劑與確證試驗（RIBA及HCV RNA）結(jié)果對比

表3顯示，本研究留取的36例間接法（c試劑）反應(yīng)性標(biāo)本，夾心法試劑檢測反應(yīng)性16例，其中HCV RNA或RIBA確證陽性14例，1例為RIBA確證不確定，1例陰性。其余20例初篩單試劑反應(yīng)性標(biāo)本，夾心法試劑檢測為非反應(yīng)性，RIBA確證結(jié)果15例為陰性，5例為不確定。

表3 兩種試劑檢測結(jié)果不一致標(biāo)本的確認試驗結(jié)果（例）

3 討論

HCV主要通過輸血及血液制品傳播，也可經(jīng)破損的皮膚和黏膜傳播，HCV病毒顆粒結(jié)構(gòu)區(qū)包括：核心蛋白基因區(qū)（C區(qū)）和衣殼蛋白基因區(qū)（E1，E2）；非結(jié)構(gòu)區(qū)包括：NS2、NS3、NS4、NS5。HCV血液篩查試劑大體上分為三類：血清學(xué)檢測HCV抗體的ELISA試劑（間接法/夾心法）、血清學(xué)檢測HCV抗原的ELISA試劑、利用 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）或核酸擴增-轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)（transcription mediated amplification，TMA）等方法檢測HCV RNA的核酸檢測試劑等。雖然近年來HCV抗體的檢測敏感性得到很大的提高，但仍存在“窗口期”較長的問題，我國自2010年開始，在采供血機構(gòu)中引進核酸檢測，有效縮短了獻血者HCV篩查的“窗口期”[7]，從2015年血液篩查核酸檢測全面覆蓋，使我國輸血后HCV感染的殘余風(fēng)險度下降到萬分之一以下[8]。但由于HCV病毒特點區(qū)別于HBV和HIV，HCV核酸檢測能力偏弱，存在漏檢風(fēng)險。結(jié)果顯示抗-HCV篩查雙試劑反應(yīng)性的15例標(biāo)本，RIBA確證試驗陽性14例，核酸檢測陽性僅9例，即其余5例RIBA確認結(jié)果陽性，而獻血者HCV RNA未能檢出，與相關(guān)報道結(jié)果相近[5]，可能存在HCV既往感染，抑或隱匿性感染：血液中HCV RNA水平低于核酸檢測下限，表現(xiàn)為HCV RNA陰性[3]，也可能造成HCV輸血傳播風(fēng)險，因此血液篩查核酸檢測不能完全替代血清學(xué)檢測。

HCV核心抗原幾乎與HCV RNA 同時出現(xiàn)，同樣具有彌補血液篩查“窗口期”漏檢的優(yōu)勢[9]，但靈敏度比核酸檢測偏低，筆者認為更適合在未開展核酸檢測的地區(qū)進行大規(guī)模的血液篩查。有研究比較發(fā)現(xiàn)Murex Ag/Ab對抗體檢測的敏感性不如間接法Murex Ab試劑[10]，可能試劑微孔板包被的抗原或抗體性質(zhì)有關(guān)。筆者認為我國血液篩查已全面核酸檢測的背景下，應(yīng)用靈敏度較低的HCV Ag/Ab聯(lián)合試劑的意義不大，應(yīng)著重考慮敏感性和/或特異性更好抗-HCV試劑結(jié)合核酸檢測進行血液篩查。

抗-HCV試劑從第一代僅包被NS4抗原片段，到第三代試劑（間接法）包被核心（結(jié)構(gòu)區(qū)）和NS3、NS4、NS5（非結(jié)構(gòu)區(qū)），增加了核心區(qū)C33的比重，因此敏感性大大提高，但仍未解決假陽性高的問題。結(jié)果顯示，c試劑單試劑反應(yīng)性標(biāo)本經(jīng)核酸檢測全部陰性；RIBA確認試驗不確定5例，陰性15例。間接法單試劑陽性標(biāo)本無確認陽性者，結(jié)合表1數(shù)據(jù)推斷，不論是進口還是國產(chǎn)試劑，間接法假陽性率明顯偏高，可能原因是血清中非特異性免疫球蛋白G（IgG）、類風(fēng)濕因子干擾、超氧化物歧化酶干擾、用于試劑制備的抗原不純等因素均可造成假陽性[11]。較高的假陽性率不僅浪費寶貴的血液資源，也給獻血者造成不必要的困擾，因此對抗-HCV初篩反應(yīng)性獻血者，應(yīng)制定合理歸隊策略。

表1 2019年無償獻血者標(biāo)本抗-HCV血液篩查情況

夾心法抗-HCV試劑（第4代）在檢測抗-HCV IgG的基礎(chǔ)上，增加了免疫球蛋白M（IgM）的檢測，不僅可以縮短窗口期，主要是將基因工程重組表達的抗原作為原料取代了酶標(biāo)二抗，方法學(xué)上有了大幅改進，理論上可以大大提高檢測特異性。而且待檢樣本加樣量由間接法的10μL提高到50μL，降低了加樣誤差造成漏檢的可能。筆者對留取的61例間接法試劑（間接法）初篩陽性標(biāo)本用夾心法試劑檢測，反應(yīng)性17例，初篩試驗間接法雙試劑反應(yīng)性的15例樣本全部檢出（確認結(jié)果陽性或不確定），說明其靈敏度能夠滿足采供血機構(gòu)血液篩查的要求。其中46例間接法單試劑反應(yīng)性標(biāo)本中，僅有2例夾心法試劑檢測為反應(yīng)性（確認結(jié)果陰性和不確定各1例），說明夾心法試劑的特異性明顯高于間接法試劑。在血液篩查中采用雙抗原夾心法試劑可以有效地降低假陽性率，為血液篩查工作提供更高的準(zhǔn)確度，可以減少血液浪費，也避免為獻血者帶來不必要的心理負擔(dān)。

由本研究確認試驗結(jié)果可以看出雙試劑陽性的標(biāo)本，其確證陽性的概率很高，留取的雙試劑陽性的標(biāo)本15例，確認陽性14例（93.33%，14/15），而單試劑陽性的標(biāo)本確證試驗陽性率較低。c試劑單試劑反應(yīng)性標(biāo)本確認試驗（RIBA）不確定樣本7例，主要以c22核心區(qū)條帶和NS3抗原條帶弱反應(yīng)性為主，筆者認為假反應(yīng)性概率較大，相關(guān)文獻報道抗-HCV確證結(jié)果為不確定的標(biāo)本檢測的S/Co值分別＞8.0時預(yù)測為陽性獻血者的概率較大[12]。而這7例樣本用夾心法試劑檢測均為非反應(yīng)性，這可能與試劑廠家包被抗原種類和工藝水平有關(guān)，這7例標(biāo)本ELISA檢測的S/Co值普遍較弱，不排除假反應(yīng)性的可能。表3中的5例不確定標(biāo)本，反應(yīng)條帶普遍較弱，且核酸檢測結(jié)果全部陰性，對于此類人群是否有HCV傳播風(fēng)險，有待進一步進行隨訪和評估[6]。

綜上所述，筆者認為雙抗原夾心法（4代）抗-HCV血篩試劑靈敏度可靠，特異性明顯高于間接法試劑。獻血者HCV篩查中，核酸檢測不能完全取代血清學(xué)檢測，二者應(yīng)相互補充，如果采用一遍酶免和一遍核酸的HCV篩查模式，采供血機構(gòu)應(yīng)根據(jù)本地區(qū)HCV流行情況合理選擇血篩酶免和核酸試劑組合，提高血液篩查檢測效能。針對抗-HCV初篩反應(yīng)性獻血者，應(yīng)進一步優(yōu)化歸隊策略，為獻血者提供后續(xù)隨訪和合理的就診建議，對獻血者及時告知和關(guān)愛[13]，文章的研究結(jié)果可為獻血者歸隊策略指南的進一步優(yōu)化提供數(shù)據(jù)參考。