郭玉娟 裴新 鄭小明 金冰 楊嫄嫄 查鑫華 張曉東 季宇

自1986年第一個(gè)生物治療藥物上市以來,生物制藥行業(yè)的生產(chǎn)工藝一直在快速發(fā)展［1］。到2023年,全球市場規(guī)模預(yù)計(jì)將達(dá)到2850億美元。目前,細(xì)胞培養(yǎng)工藝仍以分批補(bǔ)料(Fed-batch)工藝為主,原因?yàn)镕ed-batch工藝相對簡單和相對簡單的可放大性。通過細(xì)胞系工程、培養(yǎng)基開發(fā)和工藝控制改進(jìn),實(shí)現(xiàn)了更高的比生產(chǎn)率、較高的活細(xì)胞密度(viable cell density,VCD)、延長培養(yǎng)時(shí)間,已將表達(dá)量從每升幾十毫克提高到＞3 g/L,成本大幅降低［2］。

單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAb)的生產(chǎn)成本仍然遠(yuǎn)高于小分子,并且需要增加產(chǎn)量來滿足市場需求。因此,降低mAb 生產(chǎn)成本、減少供應(yīng)短缺、提高生產(chǎn)力和產(chǎn)量是生物制造行業(yè)面臨的最重要挑戰(zhàn)［3］。強(qiáng)化工藝(process intensification,PI)是上游工藝中倍受關(guān)注的新技術(shù)。強(qiáng)化工藝是連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)基置換,使用截留設(shè)備將細(xì)胞保留在生物反應(yīng)器中,使細(xì)胞維持穩(wěn)定的狀態(tài)。強(qiáng)化工藝能達(dá)到較高的細(xì)胞密度及蛋白產(chǎn)量。本文將討論強(qiáng)化工藝在生物制藥上游工藝開發(fā)中的應(yīng)用,包括N-1種子培養(yǎng)步驟以及N生產(chǎn)培養(yǎng)步驟。

1 強(qiáng)化工藝概述

強(qiáng)化工藝采用創(chuàng)新技術(shù)和方法來實(shí)現(xiàn)工藝改進(jìn),從而顯著降低制造成本。在生物制藥上游工藝方面,傳統(tǒng)的上游工藝開發(fā)路線包括從最早的種子復(fù)蘇、搖瓶擴(kuò)增、種子罐擴(kuò)增到生產(chǎn)罐。因此,整個(gè)路線可以分為種子階段和生產(chǎn)階段。強(qiáng)化工藝可應(yīng)用于N-1種子培養(yǎng)階段以及N生產(chǎn)培養(yǎng)階段。前者可以實(shí)現(xiàn)高密度種子培養(yǎng),后者可以進(jìn)行Perfusion、高密度接種培養(yǎng)、濃縮補(bǔ)料批培養(yǎng)(concentrated Fed-batch,CFB)等。

2 N-1種子階段

2.1 N-1 Perfusion N-1 Perfusion指在N-1種子生物反應(yīng)器培養(yǎng)階段使用細(xì)胞截留裝置將細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi),同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基置換,使細(xì)胞維持在營養(yǎng)成分充足且較少代謝廢棄物的健康環(huán)境中,從而在短時(shí)間內(nèi)(通常5～7 d)達(dá)到較高密度［(20～100)×106cells/ml］,同時(shí)維持較高活率［4］。傳統(tǒng)Fed-batch接種密度通常在(0.4～2.0)×106cells/ml左右,由于接種密度較低,培養(yǎng)前期主要是細(xì)胞生長階段,這種非生產(chǎn)性生長階段延長細(xì)胞培養(yǎng)運(yùn)行時(shí)間,降低生產(chǎn)率［5］。Padawer等［6］通過高密度接種(8.0×106cells/ml),培養(yǎng)8 d即可達(dá)到與低密度(0.5×106cells/ml)接種培養(yǎng)14 d相同的蛋白產(chǎn)量。此外,由于N-1灌流種子培養(yǎng)細(xì)胞密度較高,1個(gè)N-1種子反應(yīng)器可同時(shí)接種至多個(gè)N階段傳統(tǒng)低密度Fed-batch培養(yǎng),從而減小N-1階段設(shè)備規(guī)模［7］?；谝陨蟽?yōu)勢,N-1 Perfusion強(qiáng)化工藝被越來越廣泛應(yīng)用［8］。

2.2 N-1高密度細(xì)胞庫 高密度細(xì)胞庫也是近年來新發(fā)展的一個(gè)強(qiáng)化工藝技術(shù)。傳統(tǒng)的種子擴(kuò)增流程通常是在幾個(gè)連續(xù)的批培養(yǎng)中進(jìn)行的,包括在搖瓶或搖管中經(jīng)過幾次細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng),每個(gè)擴(kuò)增步驟通常需要3 d左右的時(shí)間,然后再接種到種子生物反應(yīng)器中。這個(gè)過程通常需要3周的時(shí)間,需要耗費(fèi)很多人力和時(shí)間成本,增加污染的風(fēng)險(xiǎn)。

高密度細(xì)胞庫的建立可以克服這些不足。高密度細(xì)胞庫的運(yùn)用通常與N-1 Perfusion相結(jié)合,種子培養(yǎng)以Perfusion模式擴(kuò)增。結(jié)合WAVE生物反應(yīng)器培養(yǎng)和Perfusion培養(yǎng)這兩種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),可以縮短細(xì)胞從凍存管到N-1生物反應(yīng)器的整個(gè)種子擴(kuò)增的過程。在減少操作時(shí)間的同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)更短的種子擴(kuò)增時(shí)間和更高的細(xì)胞密度。高密度細(xì)胞庫每支體積含4.5 ml［9］,細(xì)胞密度一般為(50～100)×106cells/ml。高密度細(xì)胞庫可以直接接種到生物反應(yīng)器中,省去了中間種子擴(kuò)增步驟。見圖1。Tao等［10］的研究中,使用高密度細(xì)胞庫(45×107cells/瓶)直接接種到20 L的WAVE袋中,結(jié)果顯示,使用高密度細(xì)胞庫可以省去搖瓶擴(kuò)增步驟,工時(shí)可以減少9 d。高密度細(xì)胞庫是強(qiáng)化種子擴(kuò)增步驟的一個(gè)簡單高效的途徑,可以在不影響生物工藝性能的情況下提高細(xì)胞培養(yǎng)工藝的效率。

圖1 傳統(tǒng)擴(kuò)增工藝與強(qiáng)化過程

3 N階段

3.1 灌流工藝 N階段Perfusion是將反應(yīng)器中培養(yǎng)基不斷置換,移除代謝副產(chǎn)物同時(shí)補(bǔ)充新的營養(yǎng)物質(zhì),細(xì)胞被截留在反應(yīng)器中。此外,根據(jù)培養(yǎng)需求定量排出細(xì)胞,維持穩(wěn)定的生長環(huán)境。Perfusion可以達(dá)到比Fed-batch更高的細(xì)胞密度,具有單位體積產(chǎn)量高、占地面積小等優(yōu)勢。灌流工藝已成功運(yùn)用于表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定和表達(dá)量較低產(chǎn)品的生產(chǎn)。

與Fed-batch培養(yǎng)相比,Perfusion工藝細(xì)胞VCD比Fed-batch高2～5倍［11］,并能在較長時(shí)間內(nèi)保持較高密度,獲得更高的體積生產(chǎn)率,糖基化圖譜和電荷異質(zhì)性比較一致。Perfusion工藝可以減少蛋白聚集和不完整碎片,批間異質(zhì)性更低。從經(jīng)濟(jì)方面進(jìn)行比較,培養(yǎng)基對總成本的影響會隨著灌流速率(perfusion rate,PR)的提高而顯著降低。在Perfusion中,通過優(yōu)化培養(yǎng)基,降低單位細(xì)胞的灌流速率(CSPR),提高細(xì)胞特定生產(chǎn)率(QP)值,最終反應(yīng)器產(chǎn)率提高230%,總培養(yǎng)基成本從17 $/g降低至10.1 $/g［12］。灌流工藝傳統(tǒng)習(xí)慣用于生產(chǎn)不穩(wěn)定產(chǎn)品比如凝血因子和酶制品,然而也可用于mAb的生產(chǎn),以下匯總了12種采用灌流工藝進(jìn)行生產(chǎn)商業(yè)治療生物制品藥物［13］。見表1。

表1 采用灌流工藝進(jìn)行生產(chǎn)的商業(yè)治療生物制品藥物

3.2 高密度接種Fed-batch (HSD) 高密度接種Fedbatch的N-1階段一般采用Perfusion方式得到較高細(xì)胞密度,以滿足高接種密度的要求。一般高密度接種的細(xì)胞密度為2×106cells/ml以上,可減少生產(chǎn)階段時(shí)間,以更短的Fed-batch生產(chǎn)周期達(dá)到相同產(chǎn)量［14］。這一強(qiáng)化工藝模式主要有兩個(gè)優(yōu)勢：①對培養(yǎng)基用量需求較少；②對現(xiàn)有工藝設(shè)備改動較少,只需改動N-1階段設(shè)備即可［3］。有研究顯示,對比傳統(tǒng)的Fed-batch工藝,N-1 perfusion銜接高密度接種Fed-batch,可以顯著增加表達(dá)量［15］。

高密度接種Fed-batch可以縮短單批次培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到同樣的產(chǎn)量要求,增加每年的生產(chǎn)批次,大大提升了設(shè)備利用率,繼而使產(chǎn)能得到提高。在Yang等［5］的研究中,對兩株CHO細(xì)胞株進(jìn)行高密度接種Fedbatch工藝優(yōu)化,利用N-1 perfusion得到40×106cell/ml 的高密度種子,以初始密度10×106cells/ml接種N階段Fed-batch,12 d即達(dá)到原工藝17 d的表達(dá)量(5 g/L),產(chǎn)能提高30%,且產(chǎn)品質(zhì)量與原工藝保持一致,并且其中一株克隆產(chǎn)品質(zhì)量更得到改善。Stepper等［16］對比傳統(tǒng)工藝,采用超高密度接種Fed-batch后,6 d即達(dá)到原工藝11 d的表達(dá)量,生產(chǎn)周期縮短45%。以相同年產(chǎn)量計(jì)算,傳統(tǒng)工藝需要生產(chǎn)147批,采用高密度接種Fed-batch強(qiáng)化工藝后只需生產(chǎn)49批,產(chǎn)能從 2.1 kg/d提高到3.9 kg/d。有研究［17］將傳統(tǒng)工藝流程與強(qiáng)化工藝流程進(jìn)行對比,具體見圖2。

圖2 傳統(tǒng)工藝流程與強(qiáng)化工藝流程對比

在進(jìn)行高密度接種Fed-batch工藝優(yōu)化時(shí),應(yīng)充分考慮到細(xì)胞生長代謝和蛋白質(zhì)量的變化。高密度接種Fed-batch,細(xì)胞對數(shù)增長期縮短,較早到達(dá)平臺期,可能會出現(xiàn)提前進(jìn)入衰亡期,因此細(xì)胞生長代謝與傳統(tǒng)工藝存在一定差異。Xu等［18］以(3～16)×106cells/ml初始密度進(jìn)行接種,對比原工藝Peak VCD提高1.8～2.4倍,最終表達(dá)量提高至4～8倍。根據(jù)細(xì)胞株及原工藝不同,采用高密度接種Fed-batch強(qiáng)化工藝后,由于細(xì)胞密度和活率、平臺期維持時(shí)間與傳統(tǒng)工藝可能存在差異,所以可能造成蛋白質(zhì)量的變化。Padawer等［6］的研究,同樣發(fā)現(xiàn)采用高密度接種Fed-batch強(qiáng)化工藝后,蛋白的酸堿異構(gòu)發(fā)生改變；以5×106cells/ml初始密度進(jìn)行接種,以表達(dá)量達(dá)到原工藝水平時(shí)收獲日蛋白質(zhì)量對比,糖基化結(jié)果沒有顯著差異,但是酸性峰比例下降12%～20%。

3.3 CFB工藝 CFB工藝一般是使用50 KD孔徑的中空纖維柱,通過1個(gè)動力系統(tǒng)使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液流經(jīng)柱子的同時(shí)排出廢液,而細(xì)胞和蛋白被截留在反應(yīng)器內(nèi),同時(shí)會往反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)液循環(huán)于反應(yīng)器與中空纖維柱的方法主要分為交替切向流(alternating tangential flow,ATF)和切向流過濾(tangential flow filtration,TFF),其中ATF應(yīng)用較多。見圖3。

早期關(guān)于CFB的研究是使用WAVE生物反應(yīng)器,John等［19］在WAVE生物反應(yīng)器中使用CHO細(xì)胞生產(chǎn)免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)的研究中應(yīng)用了ATF系統(tǒng)來開發(fā)CFB工藝,通過優(yōu)化PR,從0.8～1.2 VVD 提高到0.8～2.5 VVD,VCD可達(dá)到34.5×106cells/ml,最終蛋白濃度為3.8 g/L,相比于傳統(tǒng)補(bǔ)料培養(yǎng)(traditional fed-batch,TFB),最高VCD和表達(dá)量分別提高了6倍和10倍。Clincke等［20］同樣進(jìn)行了在WAVE生物反應(yīng)器中開發(fā)CFB工藝的研究,其團(tuán)隊(duì)分別用ATF系統(tǒng)和TFF系統(tǒng)做了對比研究,得到了蛋白產(chǎn)量(ATF,第 11天,1.80 g/L；TFF,第12天,2.98 g/L)。受限于當(dāng)時(shí)細(xì)胞株及培養(yǎng)基開發(fā)不太成熟,以及WAVE生物反應(yīng)器中氧氣傳質(zhì)效率不夠等原因,早期研究中Titer均比較低。

Yang等［21］在5 L Applikon生物反應(yīng)器中結(jié)合ATF系統(tǒng)對CFB工藝參數(shù)的優(yōu)化進(jìn)行了研究,最初在1×培養(yǎng)基,0.1 CSPR的條件下,培養(yǎng)至第10天時(shí)ATF柱即發(fā)生了堵塞現(xiàn)象,導(dǎo)致培養(yǎng)終止。經(jīng)過優(yōu)化后將灌流培養(yǎng)基濃縮配制為2×培養(yǎng)基,以0.05 CSPR的PR重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn),但是由于VCD過高(接近200× 106cells/ml)ATF柱很快也出現(xiàn)了堵塞,但對比之下,同時(shí)期的Titer遠(yuǎn)高于之前工藝,為了防止這一現(xiàn)象在培養(yǎng)至第8天時(shí)將培養(yǎng)溫度由35℃降為31℃,最高VCD得以控制在120×106cells/ml左右,培養(yǎng)周期相應(yīng)也得到延長。在蛋白質(zhì)量的變化上,該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),相比于TFB,CFB工藝產(chǎn)出的蛋白存在聚體增多、電荷異質(zhì)性方面酸峰降低的質(zhì)量數(shù)據(jù)變化。優(yōu)化后的工藝在另一細(xì)胞株上驗(yàn)證,最終結(jié)果見表2。

表2 不同工藝的質(zhì)量結(jié)果對比

3.4 細(xì)胞截留技術(shù) 細(xì)胞截留技術(shù)能使細(xì)胞和產(chǎn)品或培養(yǎng)基分離,去除代謝廢物,同時(shí)不斷進(jìn)行新鮮培養(yǎng)基的置換,從而達(dá)到較高的細(xì)胞密度和細(xì)胞活率,延長培養(yǎng)時(shí)間。理想的細(xì)胞截留技術(shù)應(yīng)具備較高的細(xì)胞截留效率和灌流能力,較低的流速和較短的反應(yīng)器外停留時(shí)間,能夠維持較高的細(xì)胞密度和細(xì)胞活率、較長時(shí)間的運(yùn)行性能穩(wěn)定及較低的失敗風(fēng)險(xiǎn)等。

該技術(shù)原理主要包括根據(jù)密度的沉降分離(傾斜式沉降、離心機(jī)分離、超聲波分離、水力渦旋器等)和根據(jù)細(xì)胞孔徑大小的膜分離(切向流膜分離、中空纖維膜分離等),每種技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)。沉降分離是利用細(xì)胞與培養(yǎng)基的密度不同進(jìn)行分離。其優(yōu)點(diǎn)是可以避免膜堵塞的問題,降低剪切力引起的細(xì)胞損傷,能夠?qū)崿F(xiàn)長時(shí)間的Perfusion。但是采用這種灌流裝置,細(xì)胞密度的峰值較低。Searles等［22］報(bào)道細(xì)胞密度的峰值只能達(dá)到(20～30)×106cells/ml,如果超過這個(gè)細(xì)胞密度截留效率會顯著降低。Kim等［23］的實(shí)驗(yàn)表明,連續(xù)離心Perfusion細(xì)胞密度是30×106cells/ml,能維持＞30 d的培養(yǎng)。超聲分離進(jìn)行Perfusion細(xì)胞密度的峰值一般是(10～20)×106cells/ml,目前也有文獻(xiàn)［24］報(bào)道細(xì)胞密度的峰值能達(dá)到40×106cells/ml。2007年P(guān)into等［25］報(bào)告水力旋流表現(xiàn)出較高的分離效率,分離效率能達(dá)到99%,但細(xì)胞密度較低。Bettinardi等［26］研究顯示使用水力旋流進(jìn)行截留,細(xì)胞密度也能達(dá)到 50×106cells/ml。

另一種細(xì)胞截留技術(shù)是膜分離技術(shù),包括中空纖維過濾、交叉流過濾、漩渦流過濾及旋轉(zhuǎn)過濾等。膜分離截留技術(shù)最大的挑戰(zhàn)是死細(xì)胞,細(xì)胞碎片以及添加的消泡劑等會導(dǎo)致膜堵塞。目前常見的中空纖維過濾包括TFF和ATF。TFF是采用切向流技術(shù),通過蠕動泵使過濾方向與液體流動方向相互垂直,從而減少膜堵塞風(fēng)險(xiǎn)。不同研究小組［27,28］實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TFF細(xì)胞密度峰值能達(dá)到(60～70)×106cells/ml,培養(yǎng)時(shí)間＞25 d。ATF是通過隔膜泵提供動力使得培養(yǎng)液在經(jīng)過中空纖維TFF實(shí)現(xiàn)細(xì)胞攔截,一次循環(huán)可以同時(shí)反沖膜,所以能有效防止膜的阻塞。ATF可以實(shí)現(xiàn)較高的培養(yǎng)基置換速率和低剪切力,能夠維持較高的細(xì)胞密度及活力。Kim等［23］研究發(fā)現(xiàn)使用ATF Perfusion,細(xì)胞密度的峰值能達(dá)到130×106cells/ml。Xu等［29］報(bào)道ATF Perfusion細(xì)胞密度維持在40×106cells/ml,培養(yǎng)時(shí)間能維持40 d,同時(shí)產(chǎn)品的表達(dá)量和質(zhì)量能保持一致。

4 小結(jié)

強(qiáng)化工藝的優(yōu)點(diǎn)可以總結(jié)為更快(縮短生產(chǎn)周期)、更省(提高廠房利用率、在線過程分析技術(shù)可降低運(yùn)營成本、自動化的引入可減少人為犯錯(cuò)成本)及更好(穩(wěn)定卓越的產(chǎn)品質(zhì)量、更高的產(chǎn)能)。然而,在成功進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)之前,仍然存在一些必須克服的挑戰(zhàn),包括：如何降低巨大的成本壓力,如何通過風(fēng)險(xiǎn)控制讓變化可控?？梢灶A(yù)期,隨著研究工作的深入,下一代生物工藝實(shí)現(xiàn)工藝強(qiáng)化,降本增效,向連續(xù)流方向發(fā)展。