辛家東，楊可新，周嘉寶，王傳旭，高建東

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000)

尿酸性腎病在嘌呤代謝紊亂的情況下，會造成尿酸排泄障礙或者生成過多，引起血尿酸的升高，當(dāng)尿酸鹽在血液中處于過飽和狀態(tài)時會導(dǎo)致腎臟病變，若沒有得到及時治療，病情會發(fā)展惡化至終末期腎衰竭[1]。慢性尿酸性腎病的常規(guī)治療以降尿酸為主，而在本身腎功能受損的情況下會縮小降尿酸藥物的選擇范圍。臨床治療中的降尿酸藥物如非布司他、別嘌呤醇等常被認為是腎臟保護劑，但其有可能引起的心血管風(fēng)險、過敏等不良反應(yīng)亦不可忽視[2]。因此尋求新的藥物是當(dāng)前迫切解決的問題，而中醫(yī)藥治療尿酸性腎病的多項研究證明是安全有效的[3]。矢志方是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院通過“活血通絡(luò)、化痰祛濕”治法總結(jié)創(chuàng)立的經(jīng)驗方，由王不留行、車前子、白芥子、冬葵子四味藥物組成，臨床中治療尿酸性腎病效果肯定，但具體的作用機制尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基于“疾病-基因-靶點-藥物”交互的網(wǎng)絡(luò)，通過綜合且系統(tǒng)的角度分析藥物對疾病的干預(yù)和治療作用，以闡明藥物作用于人體的復(fù)雜機制[4]，故亦可應(yīng)用在具有多成分、多靶點、多途徑特性的中藥里。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對矢志方的活性成分及靶點進行篩選，以探討其治療尿酸性腎病的關(guān)鍵活性成分、核心靶點及信號通路。

1 資料與方法

1.1矢志方藥物的獲取和篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集矢志方藥物的主要化學(xué)成分。生物利用度(oral bioavailability,OB)即口服藥物的核心藥動學(xué)參數(shù)，能夠體現(xiàn)口服藥物劑量在體循環(huán)里的比例[5]。類藥性(drug-likeness,DL)則是可以定性地分析化合物是否具有與目前已知藥物相似的化學(xué)和物理性質(zhì)[6]。本研究以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)對矢志方有效成分及其作用靶點進行篩選。通過Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)選擇參數(shù)為已驗證(reviewed)的人類物種(human)數(shù)據(jù)庫，并將所有靶標(biāo)名稱規(guī)范為基因名。

1.2尿酸性腎病相關(guān)靶標(biāo)的獲取與矢志方治療尿酸性腎病靶點的篩選 通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.Gene Cardsorg/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)檢索“Uric acid nephropathy”獲取尿酸性腎病的相關(guān)靶點，并與矢志方有效成分相對應(yīng)的藥物靶點取交集，以得到矢志方作用于尿酸性腎病的靶點，最終采用Venn圖的形式體現(xiàn)交集靶點。

1.3矢志方成分和靶點的網(wǎng)絡(luò)繪制 將矢志方有效成分信息與尿酸性腎病相關(guān)靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中以繪制矢志方成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)圖。利用插件Cyto NCA分析網(wǎng)絡(luò)的特性，準(zhǔn)確直觀地體現(xiàn)中藥治療尿酸性腎病的主要與次要有效成分。

1.4構(gòu)建藥物-疾病靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將矢志方與尿酸性腎病交集的81個靶點導(dǎo)入STRING version:11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，限定為人類物種(Homo sapiens)，設(shè)置minimum required interaction score為highest confidence 0.900，舍棄游離節(jié)點，得到蛋白互作信息，利用R軟件篩選核心靶點。

1.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通過R軟件version:4.1.1對矢志方作用于尿酸性腎病的靶蛋白進行生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞成分(cellular component,CC)分析，即基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析。設(shè)置P<0.05為篩選要求，對排名在前10的不同生物學(xué)過程條目進行柱狀圖繪制。然后利用R軟件對基因組百科全書(KEGG)通路采取富集分析，同樣設(shè)置P<0.05，作為顯著富集篩選要求，獲取矢志方治療尿酸性腎病的主要作用通路，并將排名前30的信號通路繪制為柱狀圖。

1.6分子對接 從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org)中下載拓撲分析里排名前6的核心蛋白，JUN(PDB ID:6y3v)、HIF1A(PDB ID:6gmr)、MAPK1(PDB ID:2y9q)、MYC(PDB ID:4y7r)、TP53(PDB ID:1xqh)、RELA(PDB ID:6qhl)的晶體結(jié)構(gòu)。通過軟件Chem3D Ultra14.0把從Pub Chem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)里下載的化合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)。再運用Py MOL軟件，對靶蛋白受體采取脫水和去除小分子配體等處理后，利用Auto Dock Tools 1.5.6對其受體分子進行計算電荷、加氫等處理。然后將靶蛋白受體和化合物轉(zhuǎn)換為“pdbqt”文件，并對盒子中心以及盒子格點參數(shù)進行合適的設(shè)置。最終運行Vina 1.5.6對分子對接的驗證進行評估，并且運行Discovery Studio 2019尋找對接位點并計算柔性結(jié)合的LibDockScore，將輸出的分子對接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件進行分子對接構(gòu)象展示。若結(jié)合能小于0說明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，當(dāng)Vina結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol以及LibDockScore>100說明兩者形成穩(wěn)定對接，對配體-受體復(fù)合物進行分子對接結(jié)果3D、2D展示，以評價生物信息分析預(yù)測的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1矢志方活性成分的篩選 在TCMS數(shù)據(jù)庫檢索矢志方藥物全部的化學(xué)成分，設(shè)定篩選條件分別為OB≥30%，DL≥0.18的化合物，得到符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分共有21個，其中王不留行4個，白芥子3個，車前子9個，冬葵子5個，見表1。

表1 矢志方藥物活性成分

2.2矢志方治療作用靶點的篩選與尿酸性腎病相關(guān)靶標(biāo)的收集 通過TCMSP平臺數(shù)據(jù)庫篩選矢志方藥物活性成分相應(yīng)的潛在作用靶點，去重后，共計181個。利用Gene Cards、OMIM、PharmGkb數(shù)據(jù)庫檢索“Uric acid nephropathy”獲取尿酸性腎病的相關(guān)靶點以進行整合，去除重復(fù)靶點，共計1132個。利用R軟件繪制Venn圖(見圖1)，顯示出矢志方藥物治療尿酸性腎病的交互靶點共計81個(見表2)。

圖1 矢志方與尿酸性腎病Venn圖

表2 矢志方與尿酸性腎病交互靶點

2.3“中藥-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 運用Cytoscape軟件對中藥-活性成分-靶點-疾病關(guān)系數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，導(dǎo)入文件后得到相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。藥物活性成分與作用靶點兩者之間的聯(lián)系用每條邊表示，V型代表藥物成分，菱形代表靶點。此網(wǎng)絡(luò)圖中共有94個節(jié)點，其中靶點節(jié)點有81個，化合物節(jié)點有13個。相互作用的邊有292條。表明矢志方中有13個有效成分作用于尿酸性腎病的靶點。

圖2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 在Cytoscape軟件中導(dǎo)入STRING獲取的數(shù)據(jù)并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件Cyto NCA進行拓撲分析，通過BC、DC、EC、CC、LAC、NC進行二次打分以獲取子網(wǎng)絡(luò)，最終得到6個節(jié)點，15條邊。這6個靶蛋白有可能是矢志方治療尿酸性腎病的關(guān)鍵靶蛋白(見圖3)。

圖3 矢志方治療尿酸性腎病的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5GO功能富集分析和KEGG通路分析 利用R軟件對矢志方有效作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析。基于P<0.05確定2 020個GO條目，其中包含1 862個BP條目，33個CC條目，125個MF條目。其中生物過程(biological process)主要涉及的有對藥物的反應(yīng)、對細胞外刺激的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等；細胞組分(cellular component)涉及的有膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體等；分子功能(molecular function)主要涉及的有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等，同時分別取排名前10的條目進行柱狀圖繪制以便可視化分析(見圖4)。進行KEGG富集分析，根據(jù)P<0.05，結(jié)果顯示有143條矢志方治療尿酸性腎病靶點的通路，同時將排名前30條信號通路進行柱狀圖繪制，涉及的通路有Lipid and atherosclerosis(脂質(zhì)與動脈粥樣硬化)、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications(AGE-RAGE信號通路)、Fluid shear stress and atherosclerosis(流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化)、IL-17 signaling pathway(IL-17信號通路)、TNF signaling pathway(TNF信號通路)、HIF-1 signaling pathway(HIF-1信號通路)、p53 signaling pathway(P53信號通路)、NF-kappa B signaling pathway(NF-κB信號通路)等(見圖5)。

圖4 矢志方有效作用靶點GO功能富集分析結(jié)果

圖5 矢志方有效作用靶點KEGG功能富集分析結(jié)果

2.6分子對接 有效活性成分槲皮素與核心蛋白HIF1A、JUN、MYC，木犀草素與MAPK1、TP53，以及異牡荊素與RELA均可以穩(wěn)定對接，其結(jié)合能均低于-5.0 kcal/mol。同時應(yīng)用Discovery Studio 2019軟件對活性分子及對應(yīng)靶蛋白進行對接分析(詳見表3)，可知有效活性成分均能與其各自的核心蛋白HIF1A、JUN、MAPK1、MYC、RELA、TP53的受體-配體進行半柔性對接，結(jié)果表明DS均能找到對接位點,除槲皮素與核心蛋白HIF1A-6gmr結(jié)構(gòu)域與槲皮素與MYC-4y7r結(jié)構(gòu)域形成的對接模型LibDockScore小于100外，其余均大于100。由于不同核心蛋白和不同活性分子在不同氨基酸位點會引起不同的氫鍵及疏水鍵聯(lián)系，彼此結(jié)果形成不一樣的對接體。最后將Vina輸出的化合物導(dǎo)入Pymol中并運行Discovery Studio2019軟件，進行與蛋白配體3維分子對接(見圖6)。

表3 矢志方中有效活性成分分子對接Vina、Discovery Studio 2019結(jié)果

A為HIF1A-槲皮素；B為JUN-槲皮素；C為MAPK1-木犀草素；D為MYC-槲皮素；E為RELA-異牡荊素；F為TP53-木犀草素圖6 矢志方中有效活性成分分子對接3D模型

3 討 論

尿酸性腎病在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并沒有與之相對應(yīng)的病名，可根據(jù)臨床表現(xiàn)與發(fā)病特點歸屬于“痛風(fēng)”“腰痛”“痹癥”“虛勞”“水腫”等范疇中[7]。高建東教授認為此病的基本病理因素在于濕濁痰瘀，可嚴(yán)重影響病情發(fā)展的轉(zhuǎn)歸[8]。矢志方由王不留行、車前子、白芥子、冬葵子組成，本團隊運用此方在臨床中治療尿酸性腎病20余年，療效甚好，矢志方也是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院治療尿酸性腎病的經(jīng)驗方[9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，矢志方能明顯降低高尿酸血癥大鼠血尿酸水平，抑制腎小管炎癥[10]。為了深入研究矢志方治療尿酸性腎病的作用機制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“矢志方-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，篩選收集治療尿酸性腎病的核心靶點，并通過GO、KEGG富集分析，最后進行分子對接驗證，闡明矢志方治療尿酸性腎病多靶點、多成分、多通路的特點，提供臨床治療理論依據(jù)。

本研究篩選出矢志方與尿酸性腎病交集靶點有81個，構(gòu)建出“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖后，發(fā)現(xiàn)此方治療疾病的主要活性成分有槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、異牡荊素(isovitexin)等。槲皮素成分廣泛存在于中藥材中，隸屬黃酮類的化合物，能夠抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，不僅能夠降低尿酸水平還能減輕高尿酸血癥對腎臟的危害[11]。人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶是黃嘌呤氧化酶(XOD)，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠可逆性抑制XOD催化產(chǎn)生的尿酸以及超氧陰離子自由基(O2-)的生成[12]。木犀草素能夠通過促進尿酸排泄和減少尿酸生成兩種途徑降低尿酸水平，同時可以改善高尿酸血癥引起的腎臟損害[13]。異牡荊素具有抗氧化[14]、鎮(zhèn)痛消炎[15]的功能。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析得到JUN、HIF1A、MAPK1、MYC、TP53、RELA等關(guān)鍵靶點。在炎癥、血管通透性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，JUN是抗炎治療的有效靶點[16]。多項研究表明氧化應(yīng)激參與細胞凋亡過程[17]，其中缺氧是引起人體出現(xiàn)氧化應(yīng)激的重要因素。腎臟對氧化應(yīng)激具有高度敏感性，會引起多種腎臟固有細胞損傷，進而出現(xiàn)多種腎臟疾病進展、惡化的情況。HIF1A與人體缺血缺氧密切相關(guān)，認為在氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)下促進腎小管細胞凋亡[18]。MAPK1作為MAPK的基因成員，是一項重要的炎癥評價指標(biāo)，能夠?qū)Χ喾N細胞外刺激信號做出反應(yīng)以介導(dǎo)炎癥的發(fā)生[19]。TP53可以直接影響人體免疫應(yīng)答能力，與細胞免疫浸潤水平具有密切的關(guān)系[20]。RELA是NF-κB家族成員之一，活化后的NF-κB可以快速啟動靶基因并加速其轉(zhuǎn)錄，在調(diào)控基因表達的同時也迅速激活TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、干擾素、趨化因子等致炎因子和誘導(dǎo)NO合成酶的轉(zhuǎn)錄[21]。

從KEGG通路富集結(jié)果可知，程度最高的AGE-RAGE信號通路與糖尿病發(fā)生關(guān)系密切，尿酸性腎病與糖尿病均屬于代謝障礙的范疇，AGE-RAGE通路在參與氧化應(yīng)激的過程中激活炎癥因子與活性氧的生成，可以出現(xiàn)血管壁的損傷[22]，而多項研究表明尿酸能夠介導(dǎo)血管損傷的可能機制，并且均涉及尿酸介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[23]。正常人體中RAGE的表達量極低，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生諸如炎癥、糖尿病等病理變化時，會增加其表達量。因此推測矢志方抑制AGE-RAGE通路能夠減輕痛風(fēng)患者血管內(nèi)皮與腎臟損傷。矢志方可以調(diào)控流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化，研究表明剪切應(yīng)力可以改變內(nèi)皮細胞生理功能引起炎癥、動脈粥樣硬化與血管功能障礙的發(fā)生[24]。IL-17信號通路可以激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)過程中此轉(zhuǎn)錄因子具有對細胞黏附因子與細胞因子表達的作用，可激活細胞產(chǎn)生眾多炎癥因子，進而誘發(fā)自身免疫性疾病，同時IL-17通路在這種途徑刺激下也提高了自身信號通路里炎癥因子的表達[25]。研究發(fā)現(xiàn)IL-17中和抗體的應(yīng)用能夠減輕痛風(fēng)模型動物的組織炎性浸潤[26]。除此，TNF信號通路也參與調(diào)控了痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[27]。有研究證實，TNF拮抗劑在減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性炎癥反應(yīng)的同時還能夠保證降低尿酸水平[28]。尿酸水平的升高會擾亂促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的平衡而促使腎小管細胞凋亡[29]，在家族性尿酸性腎病患者的腎活檢中發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞的凋亡[30]。大量研究表明，HIF-1信號通路可以激活多種下游靶基因表達發(fā)揮抑制腎小管上皮細胞損傷的功能，尤其在缺氧應(yīng)答過程中占有重要地位[31]。有文獻表明，P53信號通路具有豐富的動力學(xué)表現(xiàn)，能夠決定細胞命運，如壓力會引起細胞內(nèi)DNA受損，低表達的P53會引起短暫性細胞周期阻滯，促使細胞修復(fù)，而高表達的P53則會導(dǎo)致細胞凋亡[32]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)對矢志方治療尿酸性腎病的成分、靶點、通路之間的相互聯(lián)系進行探索，推斷矢志方可以發(fā)揮影響信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、代謝等途徑的作用，進而能夠治療尿酸性腎病。其機理是利用AGE-RAGE、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17、TNF、NF-κB 等信號通路發(fā)揮抗炎、降低尿酸水平、改善代謝功能以治療尿酸性腎病。然而此研究主要是通過多個信息庫的數(shù)據(jù)進行篩查分析，或許會存在與實際結(jié)果不一致的可能性，需要對矢志方治療尿酸性腎病的作用機制進行更深一步的細胞生物學(xué)和動物實驗驗證，但也為科學(xué)研究提供新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。