鄧麗 王楠 雷杰 牛群 吳玲 龔蘭 謝貝 王琪 李華 楊瑜 劉志輝 孟繁榮

廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095

結(jié)核病為一種侵?jǐn)_人類至少有7 000 年歷史的古老疾病，但目前仍為單因致死率最高的傳染性疾病，是全球的重大公共衛(wèi)生問題［1］。結(jié)核分枝桿菌耐藥性的出現(xiàn)與蔓延，更使人類結(jié)核病控制形勢(shì)雪上加霜，如何提高耐藥尤其是耐多藥結(jié)核病患者的治療水平，又如何有效阻斷其傳播，是世界衛(wèi)生組織（WHO）實(shí)現(xiàn)2035 年全球終止結(jié)核病目標(biāo)的棘手難題［2］。明晰其耐藥機(jī)制，并由此研發(fā)抗結(jié)核新藥與診斷新技術(shù)則為解決問題的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。目前，臨床應(yīng)用的抗結(jié)核藥物共33 種，其中異煙肼為全殺菌一線抗結(jié)核藥物［3］；一旦結(jié)核分枝桿菌同時(shí)對(duì)異煙肼與另一種全殺菌一線抗結(jié)核藥物利福平耐藥，則被介定為低治愈率、高病死率的耐多藥結(jié)核病［4］。因此，結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥倍受人們重視，對(duì)其耐藥機(jī)制的研究也取得了豐碩的成果，目前人們認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌過氧化氫-過氧化物酶編碼基因katG 和烯酰-酰基載體蛋白還原酶編碼基因inhA 基因突變?yōu)橹饕獧C(jī)制，編碼烷羥基丙二酸還原酶的ahpC 啟動(dòng)子區(qū)（oxyR-ahpC）、編碼β-酮?；d體蛋白合成酶的kasA 基因和編碼NADH 脫氫酶的ndh 基因突變也參與其中，但這些基因突變發(fā)生頻度與其耐藥表型的關(guān)聯(lián)性則報(bào)道不一［5］。為豐富相關(guān)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，我們對(duì)華南地區(qū)236 株異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌株和144 株異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株的katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突變情況進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

1.一般資料

1.1.菌株來源 在廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核病生物樣本庫(kù)中選擇異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌株236 株、異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株144株。

1.2.試劑與儀器 結(jié)核分枝桿菌DNA 提取試劑盒、溶菌酶為上海生物工程公司產(chǎn)品，分枝桿菌Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基為美國(guó)BD 公司產(chǎn)品，C1000TM Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀、DNA 水平電泳儀、Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝膠成像儀由美國(guó)BIO-RAD 公司生產(chǎn)，Nano Drop one 超微量紫外分光光度計(jì)由美國(guó)Thermo fisher公司生產(chǎn)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1.PCR 擴(kuò)增引物 參考結(jié)核分枝桿菌H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)株katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因序列，設(shè)計(jì)5 種基因PCR 擴(kuò)增引物（表1），引物合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

表1 5種基因PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

2.2.結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇培養(yǎng) 在生物樣本庫(kù)中選擇目的結(jié)核分枝桿菌株，應(yīng)用Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期純培養(yǎng)物。

2.3.DNA 提取 85 ℃ 45 min 滅活上述檢測(cè)株純培養(yǎng)物，按結(jié)核分枝桿菌DNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，并應(yīng)用Nano Drop one 超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA提取純度，符合要求者行PCR擴(kuò)增。

2.4.PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)總體積為50 μl：TaKaRa Taq（5 U/μl）0.5 μl、10×PCR Buffer 5 μl、dNTP Mixture 4 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各2 μl、滅菌蒸餾水35.5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s～1 min，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴(kuò)增完成后，取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物4 μl 在1%瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝膠成像儀觀察結(jié)果，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否合格，合格者進(jìn)入基因測(cè)序環(huán)節(jié)。

2.5.基因序列測(cè)定與分析 基因測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)序列為參照，應(yīng)用DNAMAN、CHORMAS、DNASTAR 等軟件分析基因突變結(jié)果。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Microsoft Office Excel 2013 收集相關(guān)資料，以katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA、ndh 基因分類和單基因突變、雙及多基因突變分別進(jìn)行行分類，描述性分析各基因突變出現(xiàn)的頻率。

結(jié) 果

1.5 種結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因突變的總體情況分析（表2）

表2 380株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼（INH）耐藥的5種基因突變總體情況

在INH 耐藥株中發(fā)現(xiàn)26 個(gè)位點(diǎn)29 種突變類型，在INH敏感株中發(fā)現(xiàn)16 個(gè)位點(diǎn)17 種突變類型。在katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 中分別發(fā)現(xiàn)3 個(gè)位點(diǎn)5 種突變、5 個(gè)位點(diǎn)5 種突變、11 個(gè)位點(diǎn)13 種突變、6 個(gè)位點(diǎn)6 種突變和11 個(gè)位點(diǎn)11 種突變。基因突變類型以katG 基因315AGC（S）→ACC（T）、mabA-inhA 基因-15T→C 最為常見。

2.結(jié)核分枝桿菌基因突變模式分析（表3）

表3 380株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的INH耐藥基因突變類型

在異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)20種單基因突變模式株、18種雙基因突變模式株，在異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌菌株中則見到12種單基因突變模式、1種雙基因突變模式、1種3基因突變模式和1種4基因突變模式，也發(fā)現(xiàn)3株結(jié)核分枝桿菌在同一基因上的兩個(gè)不同位點(diǎn)存在突變，但雙基因以上突變模式發(fā)生的頻率很小，僅為7.89%（30/380）。

討 論

在抗結(jié)核治療中，異煙肼為最有效的早期殺菌活性藥物，其進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后由菌體過氧化物-過氧化氫酶將其轉(zhuǎn)化為活性形式，它可與脂?；d體蛋白M（AcpM）及β-酮脂酰載體蛋白合成酶（KasA）通過共價(jià)鍵形成復(fù)合體，抑制結(jié)核分枝桿菌分枝菌酸的合成而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁；而katG 基因突變或缺失、inhA 基因或ahpC 啟動(dòng)子突變導(dǎo)致的基因過表達(dá)是結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼產(chǎn)生耐藥的主要分子機(jī)制［6-7］。不過到目前為止，這些基因突變?nèi)圆荒苋骊U釋結(jié)核分枝桿菌的異煙肼耐藥，更多可能的異煙肼耐藥的相關(guān)基因?qū)?huì)被不斷發(fā)現(xiàn)。有研究報(bào)道，應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌全基因組測(cè)序可將異煙肼耐藥預(yù)測(cè)的靈敏度和特異度分別達(dá)到97.1%和99.0%［8］。這為我們探尋結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥新機(jī)制提供了更為有用的分子生物學(xué)信息。我們的研究顯示：katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 5 個(gè)基因的36 個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)出40 種基因突變類型、28 種單基因和21 種雙基因以上突變模式（表2、表3），異煙肼耐藥株katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突變的頻率分別為52.11%、22.46%和5.93%。Krittanan 等［9］在泰國(guó)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥株中發(fā)現(xiàn)33 種突變，katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC基因突變的頻率分別為84.8%、9.1%和6.1%；來自蒙古的文獻(xiàn)［10］報(bào)道katG、mabA-inhA 基因突變的頻率分別為28.11%和72.37%；而吉爾吉斯共和國(guó)的研究［11］則顯示katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突變的頻率分別為91.2%、7%和1.8%，這些研究結(jié)果充分顯示結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的相關(guān)基因突變具有明顯的地域性特點(diǎn)。同時(shí)還有研究顯示，結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的地域性分子特征也會(huì)隨時(shí)間的推移發(fā)生一定的變化，Huo 等［12］報(bào)道我國(guó)異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌katG 基因突變率已由2005 年的76.8%降至2015年的70.5%，mabA-inhA 基因突變率則相應(yīng)由14.6%升至26.7%，這預(yù)示結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子機(jī)制也具有一定的時(shí)序性，如何科學(xué)把握結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的時(shí)空特征并應(yīng)用于耐藥結(jié)核病控制實(shí)踐，是擺在人們面前的一大課題。

從表2、表3我們還可看到，在144株異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株中，在34 株（23.61%）中檢測(cè)到基因突變，katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突變的發(fā)生率分別為11.11%、11.11%、4.17%、1.39%和3.47%，如何解釋在異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株中竟然有如此高比例的基因突變發(fā)生，的確不是一個(gè)簡(jiǎn)單的科學(xué)問題。我們認(rèn)為原因不外以下幾個(gè)方面：一是耐藥表型檢測(cè)問題，二是耐藥異質(zhì)性問題，三是基因突變的實(shí)質(zhì)性意義問題，四是其他藥物耐藥的影響問題。耐藥表型問題可以通過藥物敏感性測(cè)試復(fù)核予以糾正，耐藥異質(zhì)性問題目前已有文獻(xiàn)報(bào)道確實(shí)存在［13］，也的確有的基因突變?yōu)闊o義突變，如本文表2 的katG 基因295CAG（Q）→CAA（Q），通過仔細(xì)的分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌其他抗結(jié)核藥物耐藥將對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)的基因突變產(chǎn)生重要影響，我們認(rèn)為需要引起密切關(guān)注，也將另文發(fā)表相關(guān)研究以拋磚引玉。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突