張 瑞，李 起，陳 晨，李孟柯，權(quán)龍璽，高 琦，張 東，耿智敏

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科（西安 710061）

膽囊癌（gallbladder cancer，GBC）是膽囊或者膽囊管上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，其惡性程度高，具有高度的隱匿性以及易轉(zhuǎn)移性，所以許多病人就診時(shí)已處于晚期[1]。淋巴轉(zhuǎn)移（lymph node metastasis，LNM）作為膽囊癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑之一，主要與膽囊漿膜下層豐富的淋巴管有關(guān)。它不僅是影響GBC臨床分期的關(guān)鍵因素，也是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。因此對(duì)膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善病人預(yù)后具有重要的意義[3]。

根據(jù)經(jīng)典的“種子-土壤”學(xué)說(shuō)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展會(huì)引起周?chē)M織廣泛的動(dòng)態(tài)改變，同時(shí)周?chē)鷱?fù)雜微環(huán)境也會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程。成纖維細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境（即“土壤”）中重要細(xì)胞成分之一（cancerassociated fibroblast，CAF），參與并影響腫瘤細(xì)胞（即“種子”）增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程[4]。CAF一方面參與腫瘤外基質(zhì)的塑造，導(dǎo)致藥物滲透屏障的建立；另一方面，CAF通過(guò)旁分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，作用于周?chē)[瘤細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤惡性演進(jìn)。目前已有大量研究證實(shí)CAF 在膽管癌[5]、胰腺癌[6]、肝癌[7]等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

本課題組在前期研究中通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CAF可以明顯促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖侵襲[8]，同時(shí)也可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[9]。但是CAF在體內(nèi)是否對(duì)膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯恐饕獜捏w內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度出發(fā)，構(gòu)建裸鼠足墊腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，通過(guò)小動(dòng)物活體成像、HE染色、免疫組化等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，從而探討CAF在體內(nèi)對(duì)膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響，旨在為CAF 促進(jìn)膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移提供新的理論依據(jù)，并為開(kāi)發(fā)新的膽囊癌治療靶點(diǎn)提供方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

組織標(biāo)本來(lái)源于2021年4月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科并行手術(shù)治療的病人。CAF來(lái)源于行膽囊癌根治手術(shù)的病人的腫瘤組織，NF來(lái)源于因膽囊息肉行腹腔鏡膽囊切除術(shù)（laparoscopic cholecystectomy，LC）手術(shù)的病人的正常膽囊組織。術(shù)中取材后立即保存于組織保存液中，所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。所有患者術(shù)前已知情，并簽署了知情同意書(shū)，本課題通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、主要試劑與儀器

細(xì)胞：人膽囊癌細(xì)胞NOZ，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

主要試劑：①Western blot 相關(guān)試劑：RIPA 裂解液（強(qiáng)）、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA 蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE 試劑（雅酶，上海），PVDF 膜和ECL 發(fā)光液（Millipore，美國(guó)），封閉液（含5%脫脂奶粉TBST 緩沖液，現(xiàn)配），α-SMA兔抗人一抗和FAP兔抗人一抗（Abcam，美國(guó)）；②免疫熒光相關(guān)試劑：Triton X-100試劑（赫特，西安），α-SMA兔抗人一抗（Abcam，美國(guó)），DAPI試劑（索萊寶，北京），山羊抗兔IgG H&L +FITC 二抗（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；③免疫組化相關(guān)試劑：通用型SAP 試劑盒（中杉金橋，北京），CK7兔抗鼠一抗（愛(ài)博泰克，武漢）④細(xì)胞轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體Lipofectamine2000（Invitrogene，美國(guó)）。

主要儀器：電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽和發(fā)光儀（Bio-Rad，美國(guó)），倒置熒光顯微鏡（Olymplus，日本），搖床等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代細(xì)胞提取 所有收集的新鮮組織標(biāo)本立即用含2%雙抗的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進(jìn)行清洗。剔除脂肪血管組織，修剪標(biāo)本成細(xì)小組織塊（約2 mm×2 mm×2 mm），在預(yù)熱的F12 培養(yǎng)基（Gabico，美國(guó)）中進(jìn)行組織消化。在培養(yǎng)基添加2 mg/mL分散酶（Roche，美國(guó)）、1 mg/mL IV型膠原酶（Sigma，美國(guó)）和10 U/μL DNase I（Roche，美國(guó)），在37 ℃搖床中震蕩，1 h 后中止消化。使用紅細(xì)胞裂解液去掉紅細(xì)胞。所得細(xì)胞接種于六孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8 h，待細(xì)胞貼壁后即進(jìn)行換液。之后每3 d 換液1 次，7～9 d 可傳代，純化1至3次后進(jìn)行免疫熒光鑒定。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法 收集培養(yǎng)的CAF 和NF 細(xì)胞，加入裂解液和PMSF 后，冰上靜置30 min，充分將蛋白裂解，4 ℃12 500 rmp 離心10 min。抽取蛋白上清，并測(cè)定濃度。后加入Loading buffer 進(jìn)行煮蛋白。SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉緩沖液封閉1 h。后加一抗（稀釋比：α-SMA 1:1 000；FAP 1:1 000；GAPDH 1:1 000），4 ℃過(guò)夜孵育。第二日，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。后加入相應(yīng)種屬二抗（稀釋比1:2 000），室溫繼續(xù)孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。ECL 液顯影后曝光。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光 接種適量CAF、NF 于48 孔板進(jìn)行爬片，向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，室溫固定30 min。PBS 清洗3 遍后，用0.5%Triton X-100 進(jìn)行透化處理10 min，繼續(xù)PBS 清洗3 遍。用含有2%BSA 的TBST 緩沖液室溫封閉30 min，封閉結(jié)束后加入一抗，4 ℃繼續(xù)孵育過(guò)夜；加熒光二抗，避光室溫孵育1 h，DAPI 避光染色15 min，最后加入20 μL 含抗熒光淬滅劑的封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 裸鼠足墊腫瘤模型

1.3.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6 周雌性健康BALB/c 裸鼠8只，體質(zhì)量20±2 g/只，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1，本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批復(fù)號(hào)：XJTU1AF2022LSK-089）。

圖1 裸鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移瘤模型示意圖Figure 1 Flow chart of footpad metastatic tumor in nude mice

1.3.4.2 構(gòu)建裸鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移模型 實(shí)驗(yàn)前將裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分為CAF 組和NF 組，每組各4 只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用基質(zhì)膠配制成一定濃度腫瘤細(xì)胞懸液（約20 μL），分別 為5 × 106NOZ+1 × 106CAF，5 × 106NOZ+1 ×106NF。固定小鼠后，用70%酒精消毒足墊皮膚，將腫瘤細(xì)胞和纖維細(xì)胞混懸液注射入小鼠足墊皮下，肉眼可以觀察到注射處呈一個(gè)類圓形皮丘隆起。定期觀察小鼠一般狀態(tài)、腫瘤生長(zhǎng)以及腘窩淋巴結(jié)腫大情況。4周后處死小鼠，獲取淋巴結(jié)并計(jì)算體積，體積計(jì)算公式為：體積（mm3）=（長(zhǎng)×寬2）/2。

1.3.4.3 樣本收集 構(gòu)建動(dòng)物模型約4 周后，肉眼觀察裸鼠右后足紅腫，用手觸及右側(cè)腘窩處有腫大淋巴結(jié)時(shí)，表明動(dòng)物模型構(gòu)建成功。使用脫頸法處死裸鼠，解剖獲取裸鼠右側(cè)腘窩處的淋巴結(jié)組織，收集標(biāo)本，進(jìn)行固定、包埋、切片和HE染色，光鏡下由專業(yè)病理科醫(yī)師觀察診斷。

1.3.4.4 免疫組化 應(yīng)用生物素法檢測(cè)腘窩淋巴組織標(biāo)本中CK7 的表達(dá)情況。細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）是一種堿性角蛋白，存在于各種導(dǎo)管細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞中。有報(bào)道在膽管癌[10]、胰腺癌[11]、肝癌[12]等腫瘤中CK7明顯高表達(dá)。本研究通過(guò)CK7免疫組化標(biāo)識(shí)腫瘤細(xì)胞。免疫組化操作按說(shuō)明書(shū)操作。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)或/和細(xì)胞核中出現(xiàn)棕色顆粒。

1.3.5 小動(dòng)物活體成像 通過(guò)攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的病毒感染NOZ，使之表達(dá)綠色熒光。轉(zhuǎn)染病毒24～48 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染后通過(guò)嘌呤霉素進(jìn)行篩選，并進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。構(gòu)建BALB/c 裸鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移模型（同前描述），通過(guò)IVIS 光譜成像系統(tǒng)（Perkin Elmer）定期對(duì)裸鼠進(jìn)行成像，監(jiān)測(cè)腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析和圖像生成主要采用SPSS 24.0和Graph-Pad Prism 7軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，采用Fisher確切概率法或χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAF和NF培養(yǎng)與鑒定

利用病人組織提取原代CAF和NF細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)。光鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞形態(tài)均一，呈不規(guī)則三角形或者長(zhǎng)梭形，呈放射狀排列，并且CAF生長(zhǎng)速度較快（圖2A）。Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：相較于NF，α-SMA 和FAP 在CAF 中的表達(dá)明顯（圖2B）。免疫熒光染色顯示：α-SMA 在CAF中表達(dá)呈陽(yáng)性，在NF中表達(dá)呈陰性（圖3）。綜合WB和免疫熒光結(jié)果證實(shí)，本研究提取出的細(xì)胞符合腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征。

圖2 腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞形態(tài)和Western Blot鑒定Figure 2 Morphology of cancer-associated fibroblast and identification by Western Blot

圖3 腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定Figure 3 Immunofluorescence identification of cancer-associated fibroblast

2.2 裸鼠腫瘤腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型

足墊注射腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混合懸液后6～7 d，可以觀察到足墊處有腫瘤硬性結(jié)節(jié)形成。定期監(jiān)測(cè)其體積變化，可以發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間增加，腫瘤體積逐漸增大，成瘤率100%（8/8）。接種后2 周左右，部分裸鼠右后肢腘窩處可觸及小米粒大小的質(zhì)硬淋巴結(jié)，此部分小鼠為陽(yáng)性可疑，具體淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況待4 周后解剖確認(rèn)。腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況如圖4。

圖4 小鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移瘤模型Figure 4 footpad tumor metastasis of nude mouse model

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況

通過(guò)IVIS 光譜成像系統(tǒng)定期監(jiān)測(cè)腘窩淋巴結(jié)情況，結(jié)果顯示：CAF 組裸鼠出現(xiàn)的淋巴轉(zhuǎn)移明顯較NF組時(shí)間早，淋巴轉(zhuǎn)移率高（見(jiàn)圖5）。

圖5 小鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移瘤模型活體成像圖Figure 5 IVIS spectrum imaging of footpad tumor metastasis in nude mouse model

第4周處死并解剖腘窩淋巴轉(zhuǎn)移灶，腘窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)情況如圖6A，CAF組腘窩淋巴結(jié)較NF組體積明顯腫大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（如圖6B）。

圖6 腘窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)Figure 6 Lymph nodes of popliteal metastasis

腘窩淋巴結(jié)HE染色結(jié)果顯示，CAF組腘窩淋巴結(jié)中存在大量的癌上皮細(xì)胞（如圖7A），CAF 組（75%）相較于NF組（25%）腘窩淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯增加（如圖7B）。

圖7 腘窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)HE和IHC結(jié)果Figure 7 HE and IHC results of popliteal lymph nodes

3 討論

有研究報(bào)道，約30%～60%GBC患者會(huì)出現(xiàn)淋巴管轉(zhuǎn)移性播散[1，13]。然而，目前對(duì)其淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍然知之甚少。前期我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAF與膽囊癌的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者之間的聯(lián)系。膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移途徑主要由肝十二指腸韌帶向周?chē)蛘哌h(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，此類淋巴結(jié)位置較深，距離體表遠(yuǎn)，不易進(jìn)行監(jiān)測(cè)觀察[14]。足墊腫瘤模型是一種較為成熟的研究淋巴轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型。裸鼠足墊含豐富的微小淋巴管，當(dāng)足墊處腫瘤形成后，可沿著足部淋巴管回流途徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，最先轉(zhuǎn)移至腘窩淋巴結(jié)，然后向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至腹股溝淋巴結(jié)、髂血管周淋巴結(jié)等遠(yuǎn)處淋巴結(jié)[15]。目前該模型已經(jīng)在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移研究中廣泛應(yīng)用，如胰腺癌[16]、結(jié)直腸癌[17]、膀胱癌[18]等。其在膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用并未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究借助該模型進(jìn)一步探究CAF 在體內(nèi)對(duì)膽囊癌淋巴轉(zhuǎn)移的影響。

腫瘤微環(huán)境，也稱為腫瘤間質(zhì)，由除腫瘤細(xì)胞之外的非惡性宿主細(xì)胞成分（包括成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和脈管系統(tǒng)）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）組成，這些共同塑造了腫瘤的惡性生物學(xué)特性[19]。CAF作為腫瘤間質(zhì)中最豐富和最關(guān)鍵的細(xì)胞類型之一，也是ECM 的主要生產(chǎn)者。CAF 一方面促進(jìn)癌細(xì)胞的活化與增殖，另一方面還可以誘導(dǎo)血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和重塑腫瘤基質(zhì)，間接促進(jìn)腫瘤血管再生、淋巴管新生和癌細(xì)胞耐藥性。膽道系統(tǒng)腫瘤具有顯著的間質(zhì)纖維化特征[20]，其實(shí)質(zhì)內(nèi)存在大量的CAF。研究已證實(shí)CAF可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的多種生物過(guò)程，如增殖、侵襲和EMT[21-22]。

目前對(duì)于膽囊癌CAF 的相關(guān)研究較少，尤其是涉及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的研究。近期有研究發(fā)現(xiàn)，CAF 和腫瘤細(xì)胞之間的異型粘附可以驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞侵襲，并進(jìn)一步引發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[23]。Hajime等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)原位轉(zhuǎn)移模型，證實(shí)CAF 可以明顯促進(jìn)食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；靶向CAF 治療后可以降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生[24]。一項(xiàng)意大利學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞可以通過(guò)釋放PDGF-D 激活肝成纖維細(xì)胞分泌VEGF-C/VEGF-A，導(dǎo)致淋巴管擴(kuò)張和腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲，從而促進(jìn)了腫瘤的早期轉(zhuǎn)移。這些報(bào)道為研究膽囊癌CAF對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的影響提供了一些依據(jù)[25]。我們前期發(fā)現(xiàn)CAF 可以分泌IGFBP3 促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（lymph endothelial cells，LECs）遷移[9]，而LEC 遷移有助于淋巴管的萌發(fā)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵入淋巴管，并隨著淋巴液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處淋巴結(jié)。

本研究通過(guò)構(gòu)建體內(nèi)模型探討膽囊癌相關(guān)性成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響。首先通過(guò)酶消化提取并鑒定CAF和NF細(xì)胞，再通過(guò)裸鼠足墊腫瘤轉(zhuǎn)移模型觀察CAF對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAF組腘窩淋巴結(jié)相較于NF 組明顯腫大，HE 染色證實(shí)其淋巴轉(zhuǎn)移率明顯升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)論與展望

本研究首次通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了CAF可以促進(jìn)膽囊癌的淋巴轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步研究CAF 調(diào)控淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了重要依據(jù)，有望為未來(lái)膽囊癌靶向治療提供重要的分子指標(biāo)靶點(diǎn)。

（利益沖突：無(wú)）