張銳銳，張 浩，石厚銀，李春紅，屈坤燕，劉 浩

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨傷科（瀘州646000）；3.西南醫(yī)科大學(xué)法學(xué)院（瀘州 646000）

棉酚（Gossypol）是一種存在于錦葵科植物棉花根、莖、種子中的天然黃色多酚羥基雙萘醛類化合物[1]。它作為一種針對Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1蛋白家族的小分子抑制劑，可上調(diào)促凋亡蛋白NOXA 和PUMA 等來促進腫瘤細胞的凋亡[2-4]。研究表明，棉酚對多種腫瘤細胞都表現(xiàn)出較強的抑制作用，如骨肉瘤、骨髓瘤、膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌細胞等[5-10]。由于棉酚是一種親脂性小分子藥物，在水中溶解性很差，因此難以制成注射制劑，口服仍然是棉酚最佳的給藥方式[11-14]。然而，口服棉酚在體內(nèi)的生物利用度較差，往往需要較高的劑量才能產(chǎn)生顯著的治療效果。此外，棉酚對人體組織細胞無特定選擇作用，對正常組織同樣具有細胞毒性，因此削弱了對腫瘤的治療作用，這對該藥物在臨床的應(yīng)用形成了阻礙[15-16]。

針對上述問題，我們之前報道了一種基于兩親性材料硬脂酸-支鏈聚乙烯亞胺（PgS）的膠束用于棉酚的包裹[17]。聚合物膠束作為疏水藥物的理想載體，因其粒徑小、載藥量大、生物利用度高等特點廣受關(guān)注[18-19]。我們先前合成的PgS 膠束不僅可包裹疏水性藥物棉酚，其氨基還可與棉酚的酚羥基間形成氫鍵，極大程度上提高了藥物包裹率[17]。在此基礎(chǔ)上，我們引入了一種復(fù)合物載體材料——環(huán)RGD 多肽/透明質(zhì)酸（cRGD/HA）。透明質(zhì)酸（HA）是一種天然且可生物降解的多糖，它可以與多種腫瘤細胞上過度表達的CD44受體特異性地相互作用，因此常用于腫瘤細胞靶向[20-22]。整合素αvβ3和αvβ5已被證實是治療腫瘤的潛在靶點，而cRGD可特異性識別腫瘤血管中表達的整合素αvβ3，因此可用于腫瘤血管靶向[23-25]。在本研究中，我們首次將腫瘤細胞靶向的HA 與腫瘤血管靶向的cRGD進行結(jié)合，在先前所構(gòu)建的載棉酚PgS膠束基礎(chǔ)上制備出一種具有潛在腫瘤細胞與腫瘤血管雙靶向功能的載藥納米顆粒（Gos@PgS/cRGD/HA），利用這種可注射的納米載體促進棉酚在水中的分散，同時有望通過其腫瘤靶向功能大幅度提高棉酚的治療效果并降低其毒副作用，為促進該天然提取藥物的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

棉酚（純度＞98%）、硬脂酸（SA）、支鏈聚乙烯亞胺（PEI，平均分子量10 kDa和600 Da）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N'-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）、無水乙醇、甲醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）、鏈霉素、青霉素、溴化鉀、96孔細胞培養(yǎng)板、纖維素透析袋、甘露醇、透明質(zhì)酸酶（上海阿拉丁試劑有限公司）；透明質(zhì)酸（HA）、NHS-PEGcRGD（瀘州科晉生物用品有限公司）；磷酸緩沖液干粉（PBS，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 細胞培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher 科技有限公司）；人類前列腺癌細胞（PC-3 細胞，中國科學(xué)院細胞庫中心）。

FA-1104 電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-1型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；TGL-20高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；DZF-6020 真空干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；YGC 氮吹儀（鄭州寶晶電子科技有限公司）；TGL-16G 臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Ultrospec 2100 pro 紫外-可見光分光光度計（美國，通用電氣公司）；核磁共振波譜儀（型號Advance 400 MHz，Bruker 公司，德國）；Zeta sizer Nano ZS-90 激光粒度測定儀（英國Malvern 儀器公司）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Electron 公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；H-600 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；Varioskan Flash 多功能酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）；FD-1B-80冷凍干燥機（上海利聞科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 cRGD/透明質(zhì)酸復(fù)合物的制備

利用NHS-PEG-cRGD和支鏈PEI（分子量600 Da）之間的酯化反應(yīng)合成PEI-環(huán)狀RGD（Arg-Gly-Asp-DTyr-Lys）多肽嫁接聚合物（PEI-cRGD），反應(yīng)過程如圖1所示。在合成PEI-cRGD 時，將44 mg NHS-PEGcRGD與60 mg支鏈PEI溶解在5 mL DMF中，于室溫下保持100 rpm的攪拌速度反應(yīng)24 h，反應(yīng)容器內(nèi)充以氮氣保護。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液置入截留分子量為2 000 Da的纖維素透析袋中。將透析袋密封后，浸入100 mL純水中，并保持150 rpm的攪拌速度進行透析，每隔2 h更換新的透析外液，以除去DMF和未反應(yīng)的游離PEI。用紫外-可見光分光光度儀，以純水為參比，檢測透析外液在200～800 nm 波長范圍內(nèi)的吸光度，當(dāng)透析外液在該波長范圍內(nèi)幾乎無光吸收時停止透析。將透析袋內(nèi)溶液用冷凍干燥機進行凍干處理，得到PEI-cRGD干粉。

圖1 PEI-cRGD的合成示意圖Figure 1 Schematic diagram of the synthesis of PEI-cRGD

通過HA與PEI-cRGD 的靜電相互作用形成cRGD修飾的HA（cRGD/HA）。于室溫下，將40 mg HA 加入220 mL純水中，以120 rpm的速度攪拌30 min，使HA完全溶解分散。再將20 mg PEI-cRGD 加入100 mL 純水中，以上述同樣的方式使之完全溶解。之后，保持HA溶液以120 rpm 的速度繼續(xù)攪拌，同時將PEI-cRGD 溶液滴加到HA 溶液中。待完全加入后，再繼續(xù)攪拌1 h以上，使HA 與PEI-cRGD 的靜電吸附充分進行，形成cRGD/HA復(fù)合物。最后，將cRGD/HA復(fù)合物溶液冷凍干燥得到cRGD/HA復(fù)合物干粉。

1.3 載棉酚雙層納米顆粒的制備和優(yōu)化

根據(jù)我們之前報道的方法，通過SA與支鏈PEI（分子量10 kDa）進行?；磻?yīng)制備了一種兩親性材料PgS，其平均每個PEI 分子鏈上嫁接（6.67±0.12）個SA分子[17]。于常溫下將8 mg PgS 和15 mg 棉酚完全溶于5 mL無水乙醇中。再將藥物的醇溶液逐滴加到80 mL純水中，并保持240 rpm 的轉(zhuǎn)速攪拌1.5 h 以上形成載藥PgS 膠束。于室溫（20～25℃）將20 mg 的cRGD/HA復(fù)合物溶于20 mL 純水中，300 rpm 持續(xù)攪拌0.5 h 以上。待cRGD/HA 完全溶解后，將載藥PgS 膠束溶液逐滴加入cRGD/HA 水溶液中，繼續(xù)保持300 rpm 轉(zhuǎn)速攪拌1.5 h 以上，形成載藥雙層納米顆粒，以Gos@PgS/cRGD/HA表示（圖2）。

圖2 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA形成過程示意圖Figure 2 Schematic diagram of the formation process of gossypolloaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）

通過透析除去有機溶劑和未包裹的游離藥物。將載藥納米顆粒溶液置入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋中。再將密封好的透析袋完全浸入50 mL 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）中，并保持150 rpm的攪拌速度進行透析，以除去無水乙醇和游離的棉酚，每隔1 h 更換新的透析外液。當(dāng)透析外液澄清透明時，換為純水繼續(xù)透析8 h。透析結(jié)束后，向納米顆粒溶液中加入一定量的甘露醇（終濃度為7.5%，w/v）后進行冷凍干燥[26]，得到納米顆粒產(chǎn)品的干粉。在10～20 mL 范圍內(nèi)考察載藥PgS膠束溶液的加入量對于納米顆粒的粒徑和表面電位的影響。

1.4 載棉酚雙層納米顆粒的粒徑和Zeta電位的檢測

在室溫條件下，取載藥雙層納米顆粒以適量去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑大小和Zeta電位。

1.5 載棉酚雙層納米顆粒的形態(tài)學(xué)觀察

在室溫條件下，將優(yōu)化后的載藥雙層納米顆粒水溶液滴于碳膜覆蓋的銅網(wǎng)表面，自然干燥后置于透射電子顯微鏡進行觀察。

1.6 載棉酚雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測定

1.6.1 棉酚溶液標準曲線的繪制 稱取適量的棉酚，用氯仿溶解后，使用紫外-可見光分光光度儀在200～600 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，確定棉酚最大吸收波長。精密稱取處方量的棉酚溶解于氯仿中，分別配制成梯度濃度（8、10、14、18、20 及24 μg/mL）的棉酚標準溶液。采用紫外-可見光分光光度儀于最大吸收波長處測定吸光度。以橫坐標（x）為藥物的濃度，縱坐標（y）為吸光度值，繪制棉酚的標準曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程。

1.6.2 載棉酚雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測定在前面制備載藥雙層納米顆粒的透析純化過程中，取每次更換的透析外液4 mL，以等體積的氯仿萃取出游離的棉酚，先后共萃取3次，合并3次的萃取液。取10 mL合并的氯仿萃取液以氮氣流吹干，殘留物重新以2 mL氯仿溶解，隨后使用紫外-可見光分光光度儀在最大吸收波長處測定其吸光度值，根據(jù)標準曲線得到透析外液中的藥物濃度。當(dāng)透析外液中棉酚質(zhì)量少于檢測限度時停止透析。合并各次更換的透析外液中棉酚的總質(zhì)量，結(jié)合制備載藥納米顆粒時的藥物與包裹材料的投入量，計算出棉酚的包封率與載藥質(zhì)量百分比。

1.7 載藥雙層納米粒的藥物釋放研究

本研究利用透析法考察載藥雙層納米顆粒的體外藥物釋放。取制備好的載藥雙層納米粒凍干粉適量溶于20 mL PBS 中，使藥物的最終含量達到10 mg。將載藥納米顆粒溶液置入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋中密封好，再將透析袋完全浸入500 mL PBS中，并保持80 rpm 的攪拌速度和37 ℃溫度進行透析。設(shè)置加透明質(zhì)酸酶的對照組，在納米顆粒溶液中加入適量的透明質(zhì)酸酶，使其濃度達到15 U/mL，其余處理同前。每隔一定時間，取透析外液5 mL（同時補充同等體積的PBS），以等體積的氯仿萃取出游離的棉酚，先后共萃取3 次。合并3 次的萃取液，取12.5 mL 以氮氣流吹干，殘留物重新以適量氯仿溶解。采用前文所述方法測定氯仿中的棉酚濃度，根據(jù)標準曲線計算各時間點透析外液中的棉酚質(zhì)量，進而得到各時間點藥物釋放的百分比。以時間為橫坐標（x），藥物釋放百分比為縱坐標（y）繪制載藥雙層納米粒的體外釋放曲線。

1.8 載藥雙層納米粒的體外腫瘤細胞抑制作用研究

本研究采用人類前列腺癌細胞（PC-3 細胞）考察載藥雙層納米粒的體外腫瘤細胞生長抑制作用[19]。首先使用完全培養(yǎng)基懸浮PC-3 細胞。將均勻懸浮的細胞以約1×104個/孔的量加到96孔板的適當(dāng)區(qū)域內(nèi)，進行細胞培養(yǎng)。用DMEM細胞培養(yǎng)基溶解載藥雙層納米?；蛳鄳?yīng)的游離藥物，得到不同濃度（均以藥物質(zhì)量計，即3、9、27、81、243 μmol/L）的樣品溶液。在96孔板的每孔中加入不同量的待測樣品培養(yǎng)72 h，每個待測樣品重復(fù)3 孔。將培養(yǎng)基換新，每個試驗孔內(nèi)加入20 μL 的MTT 水溶液（5 mg/mL），在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后棄去含MTT 的培養(yǎng)基，并在每孔中加入100 μL DMSO。待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，用酶標儀測定每個孔在490 nm 處的吸光值，得出每種樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果

2.1 粒徑和Zeta電位檢測

在本研究實驗條件下，隨著載藥PgS 膠束溶液加入量的增加，載藥雙層納米粒的粒徑先逐漸減小后逐漸增大，且Zeta 電位逐漸升高直至0 mV 附近（圖3）。當(dāng)載藥PgS膠束溶液加入量為16 mL時，納米顆粒的平均粒徑達到最小，為124～125 nm。這是因為當(dāng)載藥PgS膠束量較少時，cRGD/HA相對于載藥PgS膠束是過量的，PgS膠束能夠被過量的cRGD/HA復(fù)合物包裹，此時所形成的納米顆粒表面包裹了大量帶負電的cRGD/HA復(fù)合物，使納米顆粒平均粒徑較小的同時其表面負電性較強。隨著載藥PgS 膠束量的增加，平均每個載藥PgS 膠束上可吸附的cRGD/HA 復(fù)合物在減少，此時所形成的納米顆粒表面包裹的cRGD/HA 復(fù)合物的量也在降低，最終使得納米顆粒表面剛好被cRGD/HA 復(fù)合物覆蓋，因此納米顆粒的平均粒徑達到最小，同時整個體系的Zeta電位繼續(xù)上升。在此基礎(chǔ)上，載藥PgS膠束量的繼續(xù)增加，會導(dǎo)致載藥PgS膠束過量，使原已形成的表面帶負電的納米顆粒繼續(xù)與帶正電的載藥PgS膠束發(fā)生靜電吸附，從而多個粒子聚集在一起產(chǎn)生更大的復(fù)合顆粒，因此使得體系的平均粒徑反而增大，同時Zeta電位繼續(xù)上升。

圖3 PgS膠束溶液加入量對載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA粒徑（A）和Zeta電位（B）的影響（，n=3）Figure 3 Effect of PgS micelles solution addition on the particle size（A）and Zeta-potential（B）of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）（，n=3）

當(dāng)載藥PgS膠束溶液加入量為16 mL時，納米顆粒的平均粒徑達到最小，此時納米顆粒表面cRGD/HA 復(fù)合物的量也較為適宜，且顆粒表面也處于負電性較高的情況，有利于保持納米顆粒的穩(wěn)定性，因此確定載藥PgS 膠束溶液加入量16 mL 為最佳條件。采用馬爾文激光粒度儀測定優(yōu)化后的載藥雙層納米顆粒的粒徑為（125.0±4.1）nm，Zeta電位為（-13.2±0.6）mV。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

透射電鏡下載藥PgS 膠束溶液加入量為16 mL 所制得的載藥雙層納米顆粒的形態(tài)近似球形，粒徑分布較均勻，基本上在120～160 nm 范圍內(nèi)（如圖4），這與前面用粒度儀所測得的結(jié)果一致。

圖4 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA不同放大倍數(shù)的透射電鏡照片F(xiàn)igure 4 Transmission electron microscopy images of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）with different magnifications

2.3 載藥雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測定

2.3.1 棉酚溶液標準曲線的繪制 棉酚在氯仿中的吸收曲線于200～300 nm 的紫外波長范圍內(nèi)顯示雜峰，于365 nm處有一個單峰，最終選擇在365 nm的吸收波峰處測量各標準溶液的吸光度（圖5A）。在本研究所選擇紫外-可見光分光光度法分析條件下，得到吸光度值（A）對藥物濃度（c）的標準曲線。棉酚的標準曲線為A=0.0360c-0.0224（R2=0.9998），在8～24 μg/mL 范圍內(nèi)有著較好的線性關(guān)系（圖5B）。

圖5 棉酚在氯仿中（20 μg/mL）的吸收光譜圖（A）和棉酚溶液的標準曲線圖（B）Figure 5 Absorption spectra of gossypol in chloroform（20 μg/mL）（A）and standard curve of gossypol solution（B）

2.3.2 載藥雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測定 載藥雙層納米粒的包封率與載藥質(zhì)量百分比分別為（69.21 ± 0.76）%和（8.33 ± 0.08）%。本課題組前期的實驗結(jié)果表明單獨使用PgS膠束時棉酚的包封率僅約為64%。相比之下，載藥雙層納米顆粒的包封率明顯更高。

2.4 載藥雙層納米粒的藥物釋放

采用透析法測定載藥雙層納米粒溶液的體外釋放。如圖6 所示，載藥雙層納米粒在沒有透明質(zhì)酸酶時的藥物釋放速度較慢，在96 h 后平均藥物釋放百分比不到60%，表明納米顆粒對棉酚的包裹較為牢固。相比之下，納米顆粒在有透明質(zhì)酸酶時的藥物釋放速度較快，在96 h后的平均藥物釋放百分比超過了85%。這是由于加入透明質(zhì)酸酶后，納米顆粒外部的HA層被逐漸降解，因此來自HA 外層的阻礙減小或消除，使得棉酚更容易從顆粒內(nèi)核中釋放出來。值得一提的是，許多腫瘤組織的透明質(zhì)酸酶都有過量表達的情況[19]，因此透明質(zhì)酸酶促進的藥物釋放效果可能為棉酚在體內(nèi)的作用賦予一定的腫瘤選擇性，從而增強藥物的抗腫瘤作用，并減小其對正常組織的傷害。

圖6 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA在添加或未添加透明質(zhì)酸酶（HAase）時的體外累積釋放曲線（，n=3）Figure 6 In vitro cumulative release profiles of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）with or without the addition of hyaluronidase（HAase）（，n=3）

2.5 載藥雙層納米粒的體外腫瘤細胞抑制作用

體外細胞試驗結(jié)果顯示，游離棉酚、Gos@PgS/cRGD/HA 納米顆粒的IC50的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別約為18.27 μmol/L 和20.65 μmol/L（圖7）。表明藥物遞送載體對細胞毒性較低，載藥納米顆粒對PC-3細胞的抑制程度接近并略小于游離藥物。

圖7 經(jīng)不同濃度游離棉酚以及載棉酚雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA處理后的PC-3細胞存活率（A）與半數(shù)抑制濃度IC50值（B）（，n=3）Figure 7 The survival rate（A）and half inhibitory concentration IC50 value（B）of PC-3 cells treated with different concentrations of free gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）（，n=3）

3 討論

納米載體材料為傳統(tǒng)藥物輸送領(lǐng)域提供了新的策略，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，具有良好的應(yīng)用前景[27-28]。為解決棉酚的溶解性和組織分布選擇差、生物利用度低等問題，本試驗制備了兩親性高分子材料PgS和cRGD/HA復(fù)合物作為納米載體，PgS是一種新型的納米載體材料，具有低細胞毒性和較好的生物相容性，適于藥物的運載。載棉酚PgS 膠束作為本研究制備雙層載藥納米顆粒的內(nèi)核部分，可以較好的包裹棉酚。用腫瘤血管靶向性cRGD 多肽來修飾具有腫瘤細胞靶向性的HA，形成了一種具有潛在雙靶向功能的復(fù)合材料cRGD/HA[29-30]，而目前將cRGD 的腫瘤血管靶向與HA 的腫瘤細胞靶向相結(jié)合的應(yīng)用還較少。在純水中有較強負電性的cRGD/HA 通過靜電吸附作用包裹帶正電的載藥PgS 膠束，形成同時具有潛在靶向?qū)嶓w腫瘤細胞和腫瘤血管的雙層載藥納米顆粒，其可以大幅度提高棉酚在體內(nèi)腫瘤組織的選擇性分布，有望通過水溶性納米載體促進棉酚在水中的分散，并顯著提高棉酚的治療效果和降低毒副作用。

納米載體的理化性質(zhì)會對其穩(wěn)定性、細胞毒性等產(chǎn)生影響，因此進行制劑學(xué)評價是必不可少的過程。優(yōu)化后Gos@PgS/cRGD/HA 的形態(tài)近似球形，平均粒徑為（125.0±4.1）nm，Zeta電位為（-13.2±0.6）mV，在短期試驗期間無需避光保存且有較好的穩(wěn)定性，緩釋作用時間較長，并對腫瘤細胞生長抑制作用與游離棉酚接近，有望促進棉酚的治療效果和降低毒副作用。與已報道的幾種棉酚制劑如脂質(zhì)體、膠束和微乳相比[31-33]，Gos@PgS/cRGD/HA提高了棉酚的溶解度、包封率和載藥量。通過以上各項實驗，不僅掌握了這種新型雙靶向棉酚納米顆粒的基本理化性質(zhì)，也對其體外抗腫瘤細胞效果有了初步的考察，為以后進一步深入研究這種載藥雙層納米顆粒體內(nèi)外作用機理打下重要基礎(chǔ)。在本研究的基礎(chǔ)上，我們將對載藥納米顆粒部分理化性質(zhì)進行進一步測定，對已檢測的理化性質(zhì)再采用其他可行的方法進行佐證，并進一步明確載體材料與藥物分子之間的相互作用。目前體外細胞試驗已證實載藥雙層納米顆粒具有顯著的腫瘤細胞生長抑制作用，未來將進行體內(nèi)藥代動力學(xué)試驗，并構(gòu)建動物腫瘤模型，進一步探討載藥雙層納米顆粒的藥代動力學(xué)參數(shù)、潛在的腫瘤雙靶向功能和抗腫瘤效果等性質(zhì)。

4 結(jié)論與啟示

本研究成功制備了一種可注射的載棉酚雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA，優(yōu)化后的納米制劑具有較好的制劑學(xué)評價結(jié)果，能夠有效提高棉酚在水中的溶解度。納米顆粒對棉酚的包封率接近70%，載藥量超過8.3%，緩釋藥物時間長達96 h 以上，對體外PC-3 腫瘤細胞的生長抑制效果與游離藥物的作用相近，有望提高棉酚的體內(nèi)治療效果和降低毒副作用。本研究結(jié)果為載藥雙層納米顆粒的進一步研究以及促進該天然提取藥物的臨床應(yīng)用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

（利益沖突：無）