江婷婷，林彥鋒 綜述 李 鵬，宋宏彬 審校

感染性疾病是人類健康的重大威脅，目前可導(dǎo)致人類感染性疾病的微生物超過1 000種[1]。然而，目前只有少數(shù)的病原體可以識別出來。微生物分離培養(yǎng)是感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，且許多常見的病原體難以培養(yǎng)[2]。PCR等分子生物學(xué)檢測只適用于有限的已知病原體診斷[3-4]。宏基因組測序已廣泛應(yīng)用于已知或未知病原體的鑒定[5-6]，但該技術(shù)依賴于采集感染部位的樣本[7]。

游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)是指游離于細(xì)胞外的部分降解了的DNA，于1948年首次在癌癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)[8]，已用于腫瘤檢測[9]、無創(chuàng)產(chǎn)檢[10]、器官移植[11]等。cfDNA高度片段化，長度大部分在100～200 bp之間[12]。cfDNA存在于外周血循環(huán)中，主要來源于人的基因組DNA、線粒體DNA[13]。血液中還存在微生物來源的cfDNA(microbial cell-free DNA，mcfDNA)，其長度短于人源cfDNA，為40～100 bp[14]，侵入性病原體通過微生物的易位及感染或在機體出現(xiàn)物理損傷時進(jìn)入血液[15]。

基于cfDNA的液體活檢在臨床感染實時診斷中表現(xiàn)出巨大應(yīng)用價值，在敗血癥[16]、寄生蟲[17]和結(jié)核病[18]等病原檢測中表現(xiàn)出可靠的識別能力，研究者們針對多種病原體及不同類型樣本開展了相關(guān)工作。

1 mcfDNA用于細(xì)菌性感染檢測

1.1 血液樣本血流感染是臨床上眾多挑戰(zhàn)之一，在許多病例中預(yù)后較差，會導(dǎo)致敗血癥甚至死亡，病原體的早期識別有助于降低患者的病死率。一項前瞻性研究表明，256份膿毒癥發(fā)病時血培養(yǎng)樣本的陽性率為33%，而基于mcfDNA二代測序的病原體鑒定陽性率則為72%[19]?；趍cfDNA測序，Chen et al[20]通過對正常樣本和敗血癥樣本檢測的細(xì)菌構(gòu)建共生網(wǎng)絡(luò)，從有限的敗血癥樣本中鑒定出引起敗血癥的目標(biāo)細(xì)菌。研究[21]還發(fā)現(xiàn)，病原體cfDNA持續(xù)可檢測的時間跨度明顯長于傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)，且其持續(xù)時間與轉(zhuǎn)移性感染風(fēng)險增加有關(guān)。對復(fù)發(fā)性或難治性的兒科腫瘤患者的臨床血樣進(jìn)行cfDNA測序，Goggin et al[22]發(fā)現(xiàn)在感染癥狀出現(xiàn)的3日前就可在患者血液中檢測到病原體的cfDNA序列，檢測靈敏度和病原序列數(shù)隨時間推移而升高，對常見血流感染病原體的特異性達(dá)到91%。

此外，基于血液樣本的cfDNA也能用于識別非血流感染的原位感染病灶病原體。Echeverria et al[23]對53名確診為髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)假體感染的血液樣本進(jìn)行cfDNA測序，將病原體檢測率從87%提高到94%，并發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法無法獲得的14種微生物。重癥肺炎患者的下呼吸道樣本不易獲取，研究者通過對患者外周血進(jìn)行cfDNA檢測，在67%(12/18)的病例中檢測到一種或多種肺炎病原體，并得到臨床確認(rèn)[24]。通過比較囊性纖維化患者和健康志愿者的血液cfDNA測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)71%的患者血液中存在呼吸道病原體的cfDNA，且豐度在統(tǒng)計學(xué)上顯著高于健康對照組[25]。

肺結(jié)核早期診斷對治療極為關(guān)鍵，但傳統(tǒng)方法難以對病原體進(jìn)行及時檢測。Pan et al[26]發(fā)現(xiàn)cfDNA可以作為檢測肺結(jié)核免疫相關(guān)的微生物標(biāo)志物，與使用單核細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比率來檢測肺結(jié)核相比，基于cfDNA檢測肺結(jié)核的靈敏性和特異性分別提高到79.2%和84.2%。此外，臨床上從培養(yǎng)物收集到確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌的檢測時間中位數(shù)平均為41 d，而基于cfDNA的檢測可將總時間縮短為4 d左右，顯著提升了檢測時效性[27]。

1.2 其他體液樣本mcfDNA也廣泛存在于尿液、胸腔積液、肺泡灌洗液、腦脊液等其他類型人體體液樣本中。研究者通過識別73例尿液樣本中肺結(jié)核特異性的mcfDNA片段，表明該方法的特異性達(dá)到100%[28]。此外，cfDNA測序結(jié)果中還包含細(xì)菌組成、抗菌素敏感性等信息，從而可對臨床抗菌藥物敏感性進(jìn)行評估[29]。結(jié)合臨床患者信息，cfDNA測序還可用于評估患者所患疾病的嚴(yán)重程度。Cheng et al[30]對腎移植受體的尿液進(jìn)行cfDNA測序分析，發(fā)現(xiàn)cfDNA來源的宿主組織和細(xì)胞類型與患者感染狀態(tài)密切相關(guān)，并確認(rèn)腎臟和膀胱組織損傷與細(xì)菌感染相關(guān)。

基于mcfDNA的檢測方法對于傳統(tǒng)方法難以檢測的細(xì)菌具有重要意義。臨床結(jié)核性胸膜炎診斷極具挑戰(zhàn)，Che et al[31]對患者胸腔積液樣本同時進(jìn)行傳統(tǒng)方法檢測和cfDNA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者對結(jié)核分支桿菌檢測的敏感性為75%，特異性則達(dá)到100%，顯著高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和Xpert檢測方法。肺炎克雷伯菌易導(dǎo)致肺炎，胸腔積液中的肺炎克雷伯菌的臨床分離培養(yǎng)較為困難。Ren et al[32]建立了基于mcfDNA的肺炎克雷伯菌感染檢測系統(tǒng)，與痰培養(yǎng)結(jié)果相比，該檢測方法的敏感性及特異性分別為91%、95%以上，其陽性檢出率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)檢測，為臨床診治提供了重要指導(dǎo)。

2 cfDNA用于真菌性感染檢測

侵入性真菌感染在臨床日趨常見，但真菌分離培養(yǎng)較為困難，且不易分離破壁，宏基因組測序也難以檢出。毛霉病是一種罕見的真菌感染引起的疾病，Martin-Blais et al[33]基于血液樣本的mcfDNA測序確診了1例侵入性胃腸毛霉病，同時該方法還可以檢出煙曲霉菌等其他絲狀真菌[34]。研究者通過對真菌感染患者的血液樣本進(jìn)行mcfDNA二代測序，與通過肺組織、胰腺假性囊腫液和頭皮傷口等侵入性檢測結(jié)果一致[35]。Hong et al[36]對9例經(jīng)培養(yǎng)證實真菌感染的患者血液進(jìn)行mcfDNA測序，在其中7例患者中檢測到真菌，也與活檢組織鑒定結(jié)果相同。mcfDNA還可用于浸潤性霉菌感染的檢測，敏感性為79%，陽性預(yù)測值則達(dá)到100%[37]。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，mcfDNA可有效識別多種類型的真菌感染?；诙鷾y序，Yan et al[38]對34例疑似敗血癥患兒的血液樣本進(jìn)行mcfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)耶氏肺孢子蟲等19種潛在的致病性真菌。以上研究說明基于mcfDNA測序可以用于臨床指導(dǎo)真菌性感染病原體的檢測。

3 cfDNA用于寄生蟲性感染檢測

目前，臨床上主要通過對患者的血液、組織液、排泄物、分泌物或活體組織等來檢查寄生蟲，檢出率低，輕度感染者需要反復(fù)檢查，且不適用于異位寄生的寄生蟲感染。肺泡棘球蚴病是由多房棘球絳蟲幼蟲引起的嚴(yán)重的寄生蟲病，研究者分析了149例血漿樣本的cfDNA序列，發(fā)現(xiàn)在術(shù)前診斷為肺泡棘球蚴病患者血漿中含有不同棘球絳蟲特異性序列，而在術(shù)前診斷為非肺泡棘球蚴病患者和健康志愿者均無相應(yīng)序列，且棘球絳蟲特異性cfDNA序列數(shù)量與肺泡棘球蚴病病變嚴(yán)重程度相關(guān)，從而為治療后患者恢復(fù)的定量評估提供重要參考[18]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)瘧疾患者總血漿中cfDNA水平隨疾病嚴(yán)重程度的增加而升高，這為寄生蟲感染的識別和病癥嚴(yán)重程度判斷提供了新的依據(jù)[39]。Zhao et al[40]收集了9例囊性棘球蚴病患者治療前后的血液樣本并測序，發(fā)現(xiàn)棘球絳蟲cfDNA濃度及片段大小發(fā)生顯著變化，治療后濃度及片段長度均增加，這表明mcfDNA也可作為評估患者恢復(fù)情況的潛在標(biāo)志物。血吸蟲病的診斷主要通過對宿主的糞便或尿液標(biāo)本中寄生蟲蟲卵進(jìn)行檢測，但不易檢出輕度及早期活動性感染。研究者通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對血吸蟲感染區(qū)域的人群體液樣本進(jìn)行血吸蟲cfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)該方法的敏感性為100%，表明血吸蟲cfDNA具有作為指示活動性血吸蟲感染標(biāo)志物的巨大潛力[41]。

4 cfDNA用于病毒性感染檢測

病毒是引起呼吸道感染性疾病的常見病原體之一，早期準(zhǔn)確地識別病原體可以減少抗感染藥物的濫用。Munjal et al[42]基于mcfDNA檢測，在1例患者的血漿中檢測出愛潑斯坦-巴爾病毒的存在。說明cfDNA的檢測可以為臨床實踐提供重要的信息。高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是引起鱗狀細(xì)胞癌的主要因素，HPV-cfDNA從原發(fā)腫瘤脫落到體循環(huán)中，通過cfDNA的液體活檢可以在治療和隨訪期間進(jìn)行連續(xù)采樣，從而在早期疾病和治療后疾病進(jìn)展中監(jiān)測HPV-cfDNA，具有高敏感性，可以用作篩查測定[43]。另外cfDNA可作為損傷的生物標(biāo)志物，預(yù)測冠狀病毒感染的臨床結(jié)局[44]。綜上，基于cfDNA的檢測可以早期識別病毒性感染，并有效改善預(yù)后。

5 cfDNA用于其他病原體感染檢測

臨床對細(xì)菌、真菌、寄生蟲以外的其他病原體檢測能力極為不足，主要依賴癥狀出現(xiàn)后的篩查與對癥治療。Centeno et al[45]對10例傷寒立克次體感染患者采用mcfDNA測序，發(fā)現(xiàn)檢測的特異性達(dá)到100%，高于血清學(xué)檢測。Branda et al[46]對患者血漿中的伯氏疏螺旋體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)mcfDNA檢測的靈敏度為64%，顯著高于PCR(7%)及血清學(xué)(50%)檢測結(jié)果，聯(lián)合cfDNA和血清學(xué)檢測可將靈敏度提高到86%。Karius檢測是基于mcfDNA二代測序的非侵入性血液測試，可鑒定1 000多種細(xì)菌、DNA病毒、真菌和寄生蟲，國外已應(yīng)用于臨床。Branda et al[46]采用Karius定量微生物檢測cfDNA方法，對游走性紅斑患者的血漿樣本進(jìn)行分析，檢測到伯氏疏螺旋體及其他兩種媒介傳播的病原體：立克次體和土拉桿菌，后續(xù)對1例對照受試者進(jìn)行土拉桿菌血清學(xué)檢測，結(jié)果為強陽性。

6 展望

作為一種微創(chuàng)快速的檢測病原方法，cfDNA日益廣泛用于感染性疾病病原檢測，成為臨床重要的輔助手段。病原體cfDNA從感染部位釋放到非侵入性樣本(如外周靜脈血、尿液等)中，其采樣過程相對無創(chuàng)，且實驗過程不需裂解細(xì)胞、檢測周期短，也可對多病原混合感染進(jìn)行識別。結(jié)合納米孔測序可進(jìn)一步縮短mcfDNA檢測周期，使得臨床快速識別病原體成為可能。對不同測序平臺中cfDNA識別病原體的能力進(jìn)行評估，結(jié)果表明二代測序的敏感性和特異性可達(dá)到79%和91%，但檢測周期需要24 h以上，納米孔測序?qū)?xì)菌的敏感性和特異性分別達(dá)到75%和81%，且可在6 h內(nèi)完成病原體鑒定。在血流感染發(fā)生前就可以檢出病原cfDNA序列，即使是抗生素治療后仍然可以檢出，這為臨床感染的早期預(yù)警和篩查提供了重要參考。

樣本的cfDNA容易受到污染和干擾，測序分析對背景信號的降噪要求很高，通過對低生物量背景進(jìn)行校正可提高檢測效果。此外，樣本采集及處理中的多個因素也會給cfDNA檢測靈敏度帶來影響，如：采樣管或尿液防腐劑的類型，樣本延遲處理，核酸提取試劑盒的選擇等，通過優(yōu)化樣本前處理方式及更高效的核酸提取方法對cfDNA的檢測至關(guān)重要?，F(xiàn)有的病原微生物的數(shù)據(jù)庫的完整性、數(shù)據(jù)更新速度和頻率等也影響基于cfDNA的病原檢測。同時，cfDNA作為一種短片段DNA，依賴二代測序平臺，測序成本高且檢測周期仍相對較長。納米孔測序?qū)Χ唐螜z測的數(shù)據(jù)量和準(zhǔn)確性仍有一定局限，但相對于二代測序成本較低，且具有實時性。隨著納米孔測序技術(shù)的發(fā)展，短片段模式的開發(fā)，使得納米孔測序用于cfDNA檢測具有了可行性。隨著各種測序平臺技術(shù)與多種擴增等樣本處理方法的發(fā)展，cfDNA在臨床感染性疾病的診斷中將會發(fā)揮更重要的作用。