代鵬飛 綜述 徐慧琴 審校

近年來，免疫檢查點(diǎn)[程序性細(xì)胞死亡受體蛋白-1/程序性細(xì)胞死亡配體蛋白-1(programmed cell death protein-1/programmed cell death ligand protein-1，PD-1/PD-L1)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein- 4，CTLA- 4)，淋巴細(xì)胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)等]抑制劑是臨床研究最多和發(fā)展最快的免疫治療方法，尤其是PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑受到了研究者廣泛關(guān)注[1-3]。由于惡性腫瘤在時(shí)間和空間存在高度異質(zhì)性，免疫組織化學(xué)方法(immunohistochemistry，IHC)存在一定的局限性[4]。核醫(yī)學(xué)分子影像技術(shù)，尤其是PET，可以無創(chuàng)、精確、實(shí)時(shí)、動態(tài)、全面實(shí)現(xiàn)在體檢測PD-1/PD-L1表達(dá)水平，從而有效地篩選出能從PD-1/PD-L1免疫治療中獲益的患者。目前已發(fā)展的靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)PET探針多數(shù)屬于單克隆抗體和抗體片段的PET探針[5]。然而，這些類型探針由于分子量大、代謝時(shí)間長、免疫原性、復(fù)雜的制備工藝限制了其在臨床上的應(yīng)用。所以，開發(fā)小分子PET探針至關(guān)重要?；谀壳吧儆形墨I(xiàn)總結(jié)靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1多肽和有機(jī)小分子PET探針的發(fā)展情況，本文主要總結(jié)該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以期為發(fā)展新型的靶向PD-1/PD-L1小分子PET探針提供新的思路和帶來新的機(jī)遇。

1 PD-1/PD-L1信號通路概述

PD-1是含有268個(gè)氨基酸的誘導(dǎo)表達(dá)I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白B7-CD28超家族成員，經(jīng)誘導(dǎo)后主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。PD-L1是含有290個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白B7超家族成員，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)、巨噬細(xì)胞和多種癌細(xì)胞(黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌等)表面。PD-1與配體PD-L1結(jié)合后，PD-1胞內(nèi)區(qū)具有磷酸化作用位點(diǎn)C端氨基酸殘基的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)，在酪氨酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，募集酪氨酸蛋白磷酸酶SHP-2，從而使下游的脾臟酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)去磷酸化，進(jìn)而抑制下游的AKT、mTOR、RAS、MEK、ERK等通路的活化，最終抑制T細(xì)胞活化、增殖以及細(xì)胞因子的分泌。在健康的生物機(jī)體內(nèi)，這種免疫的負(fù)調(diào)控機(jī)制能使機(jī)體免于自身免疫應(yīng)答過強(qiáng)出現(xiàn)的免疫損傷，避免了自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病等)的發(fā)生。PD-L1在黑色素瘤、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等癌細(xì)胞表面過度表達(dá)，從而持續(xù)異常地激活免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1信號通路，進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的免疫逃逸，造成了癌細(xì)胞的惡性增殖。阻斷免疫細(xì)胞表面PD-1與癌細(xì)胞表面PD-L1的結(jié)合，抑制PD-1/PD-L1信號通路的活化，阻斷負(fù)性調(diào)控信號，釋放活化T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力，從而修復(fù)機(jī)體正常免疫反應(yīng)并控制和清除癌細(xì)胞。因此，免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1信號通路是一個(gè)理想的免疫治療靶點(diǎn)[6]。

2 PD-1/PD-L1表達(dá)作為腫瘤免疫治療的重要生物標(biāo)志物

迄今為止，全球已經(jīng)有數(shù)十種抗體類PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲批上市，用于黑色素瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌和肝癌等癌癥的治療[7]。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，癌癥患者體內(nèi)PD-1/PD-L1表達(dá)水平與其是否能從PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中獲益存在一定的正向相關(guān)[8]。目前，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑總體響應(yīng)率僅為15%～40%，而且單獨(dú)使用PD-1單抗抑制劑的總體響應(yīng)率僅為20%[9]。一項(xiàng)關(guān)于派姆單抗(pembrolizumab)用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明[10]，患者的客觀緩解率(objective response rate，ORR)、無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和中位生存期(median survival time，MST)與PD-L1表達(dá)水平呈正相關(guān)。并且，當(dāng)患者體內(nèi)PD-L1表達(dá)超過50%時(shí)，ORR達(dá)到45.2%。納武單抗(nivolumab)用于非小細(xì)胞肺鱗癌臨床試驗(yàn)表明，PD-L1表達(dá)陽性患者的ORR和MST分別為31%和17.2個(gè)月，而PD-L1表達(dá)陰性患者的ORR和MST僅為9%和10.4個(gè)月。2020年NCCN發(fā)布的NSCLC指南中，明確指出了不同PD-1/PD-L1表達(dá)水平使用不同免疫治療方案。所以，準(zhǔn)確檢測PD-1/PD-L1表達(dá)水平，可以有效地篩選能從PD-1/PD-L1免疫治療中獲益的患者，對患者進(jìn)行分層治療、療效監(jiān)測和預(yù)后評價(jià)具有重要意義。

3 靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1抗體類PET探針

近年來，靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1的單克隆抗體、雙特異性抗體、納米抗體、抗體片段、單鏈抗體、親合體、Adnectin和類抗體支架蛋白等的PET分子探針到了迅速發(fā)展[11-13]，本文概括了一些靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1抗體類PET探針的情況，見表1。雖然免疫PET顯像(Immuno-PET)發(fā)展迅速、特異性好，但是相對分子量大、生物半衰期長、免疫原性強(qiáng)、制備困難、需要特殊的基因組編輯技術(shù)、肝臟非特異性高攝取等缺陷，使其具有一定的局限性。

4 靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1小分子PET探針

相比于單克隆抗體、雙特異性抗體、納米抗體、抗體片段、單鏈抗體、親合體和Adnectin等類抗體支架蛋白，小分子多肽和有機(jī)小分子化合物具有以下優(yōu)點(diǎn)：生物體內(nèi)半衰期短、組織穿透力強(qiáng)、可修飾性強(qiáng)、無免疫原性、合成簡單、成本廉價(jià)、化學(xué)穩(wěn)定性好、運(yùn)輸便捷和顯像時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[24]。

4.1 核素標(biāo)記的多肽小分子PET探針WL12是一種由12個(gè)氨基酸構(gòu)成的高親和性靶向PD-L1環(huán)狀肽，其半數(shù)抑制濃度(half inhibit concentration, IC50)值為20 nmol/L[25]。分子對接相互作用分析表明，WL12在PD-L1的凹槽中形成了β片狀結(jié)構(gòu)。WL12的D-亮氨酸類似于PD-1的Ile134插入到疏水性口袋中，其中一個(gè)正亮氨酸殘基結(jié)合方式與PD-1的Ile126結(jié)合方式相同。此外，WL12與PD-L1之間存在大量的氫鍵。有研究者在放射性核素標(biāo)記多肽小分子抑制劑WL12制備多肽小分子PET探針領(lǐng)域做了大量的工作[26-28]，見表2。

2017年，有研究者將DOTAGA雙功能螯合劑連接在WL12多肽上[26]。隨后，使用64Cu進(jìn)行放射性核素標(biāo)記制備了多肽小分子PET探針[64Cu]WL12。研究顯示[64Cu]WL12與PD-L1具有較強(qiáng)親和力(Kd=2.9 nmol/L)。隨后在構(gòu)建的PD-L1表達(dá)陽性和PD-L1表達(dá)陰性的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)腫瘤的荷瘤鼠模型中進(jìn)行PET-CT顯像，研究表明，在注射10 min后即可在PD-L1表達(dá)陽性的荷瘤鼠模型中觀察到[64Cu]WL12的高攝取，可以持續(xù)到120 h，免疫組化證實(shí)了該結(jié)果；而PD-L1表達(dá)陰性的荷瘤鼠模型中并未觀察到[64Cu]WL12的高攝取。hPD-L1腫瘤的腫瘤-肌肉和腫瘤-血液比值分別為25.6±1.9和4.7±1。結(jié)果表明[64Cu]WL12在注射1 h后，可以特異性檢測腫瘤PD-L1的表達(dá)水平。

表1 靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1抗體類PET探針

表2 靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1小分子PET探針

68Ca的半衰期與WL12多肽的生物半衰期相近，并且68Ga方便獲取(68Ge/68Ga發(fā)生器)，方便臨床工作人員的使用。2018年，De Silva et al[27]用放射性核素68Ca標(biāo)記DOTAGA-WL12多肽制備了68Ca 標(biāo)記的多肽小分子PET探針[68Ca]WL12。生物分布實(shí)驗(yàn)表明，在所有不同時(shí)間點(diǎn)的測試中，[68Ca]WL12在hPD-L1腫瘤中的攝取值是對照組的9倍。在注射15、60、120 min時(shí)，hPD-L1腫瘤的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)分別為19.4±3.3、11.56±3.18、9.89±1.72；而對照組腫瘤在注射15、60、120 min時(shí)，%ID/g均小于1.33±0.21。相比于[64Cu]WL12，[68Ca]WL12制備方便、具有更適于臨床應(yīng)用的生物半衰期。

18F來源于回旋加速器，實(shí)用性更強(qiáng)，更適合于PET成像特性。2019年，Lesniak et al[28]使用[18F]FPy-TFP作為放射性輔基通過與WL12鳥氨酸側(cè)鏈氨基形成酰胺鍵，從而制備了18F標(biāo)記的多肽小分子PET探針[18F]FPy-WL12。PET-CT圖像顯示，在放射性示蹤劑注射10、30和60 min后，hPD-L1腫瘤中[18F]FPy-WL12的攝取值與對照組CHO相比顯著增加。在注射10、60、120 min時(shí)，hPD-L1腫瘤的%ID/g分別為5.23±1.11、7.16±1.67、8.86±10.2；而對照組腫瘤%ID/g均小于1.77±0.21。然而研究發(fā)現(xiàn)肝臟和腎臟對[18F]FPy-WL12攝取率較高。

2022年，Zhou et al[29]利用68Ca標(biāo)記的多肽小分子WL12制備了PET探針68Ga-NOTA-WL12，同時(shí)進(jìn)行了人體研究，結(jié)果表明，在體外和體內(nèi)PD-L1表達(dá)陽性腫瘤中，均表現(xiàn)特異性攝取68Ga-NOTA-WL12；生物分布實(shí)驗(yàn)表明，68Ga-NOTA-WL12主要分布在肝、脾、小腸和腎；在注射1 h后，腫瘤清晰可見，尤其是肺，1 h時(shí)腫瘤/肺比值為4.45±1.89。

4.2 核素標(biāo)記的有機(jī)小分子PET探針近年來，隨著小分子抑制劑與PD-1/PD-L1蛋白作用模式的研究，越來越多的分子(磺酰胺類、聯(lián)苯類、噁二唑類、芐苯醚類等)已經(jīng)用于抑制免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1的結(jié)合[30]。

2015年，美國百時(shí)美施貴寶公司在申請的專利中披露了具有抑制PD-1/PD-L1結(jié)合活性的聯(lián)苯類化合物[31]。受此啟發(fā)，2020年,Miao et al[32]合成了結(jié)構(gòu)上類似于BMS-1166的化合物L(fēng)N2。通過銅催化的炔基和疊氮的點(diǎn)擊反應(yīng)(Husigen環(huán)加成反應(yīng))將硼氨酸引入到化合物L(fēng)N2中，制備成含硼氨酸LN。最后，基于18F-19F同位素交換制備成有機(jī)小分子PET探針[18F]LN。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[18F]LN與PD-L1具有較強(qiáng)親和力(Kd = 65.27±3.47 nmol/L)。同時(shí)在建立的PD-L1陽性(A375-hPD-L1)和PD-L1陰性(A375)的荷瘤鼠模型中顯像。結(jié)果表明，在注射15 min后，在PD-L1陽性(A375-hPD-L1)的荷瘤鼠腫瘤攝取值為(1.96±0.27)%ID/g；在PD-L1陰性(A375)和阻斷組的荷瘤鼠腫瘤攝取值分別為(0.89±0.31)%ID/g和(1.07±0.26)%ID/g。研究分析，通過點(diǎn)擊反應(yīng)引入親脂性的AMBF3降低了探針對PD-L1的親和力，從而造成非靶器官的非特異性攝取。

為了改善探針的親水性，2021年,Lv et al[33]基于醛和羥胺縮合策略，使用[18F]FDG代替AMBF3作為標(biāo)記輔基標(biāo)記有機(jī)小分子L7制備了[18F]LG-1。[18F]FDG結(jié)構(gòu)的引入顯著提高了[18F]LG-1的水溶性，其Log Do/w比[18F]LN低4.8倍。體外實(shí)驗(yàn)表明，PD-L1表達(dá)陽性細(xì)胞(A375-hPD-L1)攝取明顯高于PD-L1表達(dá)陰性細(xì)胞(A375)。體內(nèi)動態(tài)PET圖像表明，在注射60 min后，在PD-L1陽性(A375-hPD-L1)的荷瘤鼠腫瘤攝取值是PD-L1陰性(A375)荷瘤鼠腫瘤的2.6倍?？傊琜18F]LG-1是一種潛在的靶向PD-L1的有機(jī)小分子PET探針。

5 總結(jié)和展望

研究[4]表明有創(chuàng)的IHC在檢測PD-1/PD-L1表達(dá)水平方面存在局限性：① 檢測閾值不同；② 容易受到干擾素、淋巴細(xì)胞趨化因子和前期治療等因素影響；③ 無法實(shí)時(shí)、重復(fù)和動態(tài)監(jiān)測PD-1/PD-L1表達(dá)。靶向PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)PET探針可以高效地實(shí)現(xiàn)活體檢測PD-1/PD-L1表達(dá)水平。相比于抗體類PET探針，小分子PET探針具有生物體內(nèi)半衰期短、化學(xué)穩(wěn)定性好、無免疫原性和成本廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。然而，PD-1與PD-L1接觸的界面具有高度平坦且疏水的結(jié)構(gòu)，沒有小分子結(jié)合的合適位點(diǎn)，導(dǎo)致PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)小分子抑制劑研究進(jìn)展緩慢。由于缺乏高活性的PD-1/PD-L1小分子抑制劑，使得靶向免疫檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1小分子PET探針的研究進(jìn)展更加緩慢。