崔佰吉，王 爽，張風(fēng)旗，陸德煥

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

烏拉草(CarexMeyerianaKunth，CMK)是莎草科多年生草本植物，在我國東北長白山地區(qū)分布最為豐富。研究發(fā)現(xiàn)烏拉草中含有豐富的纖維素[1]，是生產(chǎn)纖維素納米晶體的原料[2]。烏拉草中揮發(fā)油具有良好的抑菌活性[3]；烏拉草多糖具有體外抗氧化能力[4]和免疫調(diào)節(jié)活性[5]；烏拉草還富含多種黃酮類和多酚類成分，具有抗氧化、抑制腫瘤血管生成及抗衰老的作用，但目前對這一方面的研究內(nèi)容比較少。

Box-Behnken design(BBD)效應(yīng)面法是種多因素非線性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的一種方法，在中藥成分提取和藥劑領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-9]。本研究采用單因素結(jié)合BBD方法進(jìn)行烏拉草中總黃酮和總多酚的提取工藝研究，優(yōu)選提取過程中的乙醇濃度、料液比和提取時間，為烏拉草的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV1800紫外分光光度儀(日本 島津)；KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(德國 賽多利斯)。

烏拉草收集自吉林省磐石市，蘆丁(批號：20200718)和沒食子酸(批號：20200625)購自于成都普菲德科技有限公司，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定方法

總黃酮含量測定方法按照文獻(xiàn)的方法，以蘆丁當(dāng)量表示總黃酮的含量，按照文獻(xiàn)的方法稍加改進(jìn)。

精密稱取蘆丁對照品9.89 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、定容，得對照品儲備液。分別量取對照品儲備液適量，加甲醇稀釋至適宜濃度的對照品溶液(0.0989、0.1978、0.2967、0.3956、0.4945、0.5934 g/L)。

分別精密量取對照品溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.6 mL，混勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.6 mL，混勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min；用70%的乙醇溶液定容至刻度，混勻；紫外分光光度法在510 nm波長下測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=13.455X-0.006 9，R2=0.996 6。表明在0.098 9～0.593 4 g/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于烏拉草中總黃酮的含量測定。

精密量取供試品溶液1 mL置10 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法依法操作，紫外分光光度法在510 nm波長下測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總黃酮的含量。

2.2 總多酚的含量測定

總多酚含量測定方法按照文獻(xiàn)的方法，以沒食子酸當(dāng)量表示總多酚的含量，按照文獻(xiàn)的方法稍加改進(jìn)。

精密稱取沒食子酸對照品5.17 mg置10 mL量瓶中，加適量水溶解，加30%乙醇水溶液定容至刻度，得對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液適量，加水稀釋至適宜的濃度，得對照品溶液(0.0517、0.1035、0.2069、0.3104、0.4138、0.5170 g/L)。

精密量取各對照品溶液1 mL至25 mL量瓶中，加入福林酚試劑2 mL混勻，加入10%碳酸鈉溶液6 mL混勻，加水定容至刻度，置暗放150 min，紫外分光光度法在765 nm波長下測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=46.555X-0.043 9，R2=0.989 6。表明在0.051 7～0.517 0 g/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于烏拉草中總多酚的含量測定。

精密量取供試品溶液1 mL置25 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法操作，紫外分光光度法在765 nm波長下測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總多酚的含量。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1溶劑濃度的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶20分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、90%，加熱回流提取，提取時間為45 min，過濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測定總黃酮及總多酚的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的乙醇對于總黃酮和總多酚的含量影響不大，變化趨勢不明顯，綜合評價，選取80%乙醇溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2料液比的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為80%，加熱回流提取，提取時間為45 min，過濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測定總黃酮及總多酚的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液比的變化對于總黃酮和總多酚的含量影響比較明顯，隨著料液比例的增加，含量逐漸增加，料液比為1∶30時趨于平衡，所以選取料液比為1∶30進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3提取時間的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶30分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為80%，加熱回流提取，提取時間分別為45、60、90、120 min，過濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測定總黃酮及總多酚的含量。結(jié)果表明，提取時間對于結(jié)果的影響不大，45 min時結(jié)果稍低，但是與其他提取時間的含量結(jié)果沒有顯著性差異，綜合評估后選擇75 min為最佳提取時間，在響應(yīng)面設(shè)計時再擴(kuò)大響應(yīng)范圍。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合評估后進(jìn)行相應(yīng)的參數(shù)優(yōu)化設(shè)計，選取乙醇濃度、料液比、提取時間3因素，以總黃酮和總多酚的含量結(jié)果為考察指標(biāo)，采用“2.1、2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行總黃酮及總多酚的含量測定，Design-Expert12進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果二項(xiàng)式擬合后可知，回歸方程為：Y=-0.350 8A2+0.186 7B2-0.408 3C2+0.332 5A+0.101 2B+0.358 8C-0.227 5AB+0.507 5AC-0.175 0BC+4.32；F值為2.92；P值為0.1254；模型相關(guān)系數(shù)為0.8401；測量信噪比為5.25(>4)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型擬合度良好，各因素跨度合理，但選取的三個因素對最終結(jié)果的影響的顯著程度不明顯，但可以看出因素A(乙醇濃度)、因素C(提取時間)和因素A&C三項(xiàng)的P值分別為0.074、0.059和0.059，說明因素A和C以及兩者之間的交互作用對烏拉草有效成分提取率具有一定的影響作用。

各因素交互影響結(jié)果3D圖見圖1。因素對提取率的影響越明顯，曲面就會越凸出，曲面越平，提取率對于因素的改變越不明顯。圖1可以看出A&C的交互作用對總黃酮和總多酚的提取率影響最大，這一結(jié)果與方差分析中的結(jié)果得到相互的驗(yàn)證。最后，根據(jù)軟件的計算，預(yù)測最佳的提取方案為：乙醇濃度77.4%，料液比為1∶30，提取時間為90 min。

1 A&B 2 A&C 3 B&C

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計預(yù)測的最佳實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)合實(shí)際調(diào)整為80%，故驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)條件：乙醇回流法提取，乙醇濃度80%；料液比1∶30；提取時間90 min。進(jìn)行平行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果總黃酮SD為0.09，總多酚SD為0.15，顯示本方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

3 討 論

由于黃酮分子結(jié)構(gòu)中多含有酚羥基結(jié)構(gòu)，所以總黃酮和總多酚類的測定中具有一定的重疊效果。但在單因素和BBD過程中發(fā)現(xiàn)，不同因素變化對有效成分的含量影響并不顯著，各種因素變化范圍的增大并未引起含量的梯度變化。同時BBD結(jié)果也可看出，模型設(shè)計和各因素響應(yīng)結(jié)果值顯著性不明顯，原因可能與烏拉草中的總黃酮和總多酚實(shí)際含量有關(guān)?；A(chǔ)含量不高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計的各因素最低水平下能夠有效提取總黃酮和總多酚，所以水平梯度上漲后，對于最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性影響。同時，由于烏拉草為草本植物，為了便于有效成分的提取需要對其進(jìn)行粉碎處理，粉碎后的烏拉草粗粉較蓬松，加入過少的提取溶劑不能完全浸沒烏拉草粉末，這可能也是各因素對含量結(jié)果響應(yīng)不明顯的一個因素。雖然整個實(shí)驗(yàn)過程中各因素對烏拉草中總黃酮和總多酚的提取效率沒有顯著影響，但實(shí)驗(yàn)明確了各個因素及交互作用的相互影響，可以為烏拉草資源的有效利用提供理論參考。

本研究采用BBD法優(yōu)化了烏拉草中總黃酮和總多酚的提取工藝，最終確定了最佳的提取方法，并明確了各個因素以及各個因素之間的交互作用對其提取率的影響程度，最終確定的提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，可以用于烏拉草中總黃酮和總多酚的提取。