劉秀萍，申龍俊，孫巳茵，鄧 方

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130031)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI) 可發(fā)生于多種腦血管疾病過(guò)程中， 而腦水腫是缺血性腦血管病中常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。血-腦屏障的通透性與腦水腫密切相關(guān)[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足、細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血-腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。組成血-腦屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上有豐富的水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表達(dá)。AQP4是膜水通道蛋白家族的成員之一，在腦組織中廣泛表達(dá)，是控制水進(jìn)出腦組織的通道，在腦水腫[2]、星形細(xì)胞遷移[3]、神經(jīng)炎癥及缺血性腦卒中等方面均起著重要作用[4]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolide，GK)是銀杏葉提取物中的一類萜內(nèi)酯成分，主要包括單體銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)[5]。目前銀杏內(nèi)酯已廣泛應(yīng)用于臨床，然而迄今銀杏內(nèi)酯及其單體白果內(nèi)酯在腦灌注損傷后的作用機(jī)制尚不明確，其對(duì)腦缺血后腦水腫方面鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為深入探究其對(duì)急性腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，本研究從血腦屏障角度，觀察GK和BB對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及對(duì)缺血側(cè)皮層AQP4表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重260～280 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2013-0001。

1.2 藥物與試劑

銀杏內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號(hào)：20130801)，白果內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號(hào)：NZ130609，純度>90%)，AQP4抗體(AB3594，Minipore)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型組(MCAO組)、銀杏內(nèi)酯組(GK組)和白果內(nèi)酯組(BB組)。后兩組分別設(shè)不同干預(yù)劑量亞組，即GK2.5組(2.5 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)、GK5組(5 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)、GK10組(10 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)，BB2.5組(2.5 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)、BB5組(5 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)和BB10組(10 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)。模型組及GK、BB各劑量組行MCAO，假手術(shù)組不插線栓。各實(shí)驗(yàn)組及劑量亞組每組實(shí)驗(yàn)大鼠6只。劑量亞組動(dòng)物于腦缺血再灌注前30 min腹腔給藥，假手術(shù)組和MCAO組給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠腦缺血再灌注模型的制備

實(shí)驗(yàn)采用Longa線栓法制備腦缺血再灌注模型，大鼠左側(cè)MCAO 2 h再灌注12 h。應(yīng)用10%水合氯醛(35 mL/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定，去除口腔分泌物，碘伏消毒頸部皮膚，經(jīng)頸正中切口，分離頸部筋膜，沿左側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉，暴露頸動(dòng)脈三角。手術(shù)分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，注意伴行的迷走神經(jīng)，防止術(shù)中牽拉導(dǎo)致呼吸心跳驟停。用電凝筆電凝來(lái)源于ECA的枕動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈，分離ECA主干，其遠(yuǎn)心端用細(xì)線將血管結(jié)扎，使其無(wú)血流通過(guò)，在近心端靠近CCA和ECA分叉處用細(xì)線在ECA上打一松結(jié)。用稍粗縫合線暫時(shí)系緊CCA，用小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，在頸外動(dòng)脈兩條結(jié)扎線間近心端側(cè)上方近剪一倒“V”形切口，將直徑為0.26 mm賴氨酸包被的鈍性魚(yú)線線栓斜行插入，通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈推進(jìn)到大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)，插入約18～20 mm遇有阻力時(shí)為止，系緊ECA根部絲線去除CCA殘留的粗縫合線。大腦中動(dòng)脈閉塞2 h后行再灌注，小心拔除線栓,手術(shù)線系緊血管殘端，保證MCA血流再通。Sham組僅暴露CCA、ECA及ICA，不做插線處理，余操作相同?？p合肌肉和皮膚。術(shù)前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食一夜，術(shù)前可飲水，避免急性腸梗阻的發(fā)生，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，密切關(guān)注大鼠生命體征變化。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積測(cè)定

大鼠缺血2 h再灌注12 h后，按Zea Longa 5分制評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。入組標(biāo)準(zhǔn)為：評(píng)分為1～3分，且無(wú)蛛網(wǎng)膜下腔出血。

大鼠腦缺血2 h再灌注12 h后，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干，于-20 ℃冰箱中速凍18 min，然后將腦組織放入腦槽中，沿腦組織冠狀切面切成5片，隨后將腦片放入2% TTC溶液中，37 ℃避光置水浴箱30 min。染色結(jié)果顯示正常腦組織呈紅色，梗死灶呈白色。再將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，數(shù)碼相機(jī)拍照，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算腦片梗死面積并計(jì)算腦梗死體積占大腦體積的百分比。

1.6 腦組織病理組織學(xué)檢查

大鼠腦缺血再灌注后，用10%水合氯醛麻醉，迅速開(kāi)胸，用生理鹽水沖洗心臟，然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛灌注液，4 ℃固定1周，依次行脫水、透明、浸蠟及包埋，常規(guī)HE染色封片，光鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測(cè)AQP4的表達(dá)

取缺血側(cè)大腦皮層進(jìn)行蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗(AQP4，1∶500；β-actin，1∶2000)，4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育，ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用Image J圖像分析測(cè)定Western blot條帶灰度值，結(jié)果以AQP4與β-actin灰度值得比值顯示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，采用Graphpad軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 GK和BB對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)功能缺損的影響

腦缺血2 h再灌注12 h，Sham組無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，評(píng)分為0分；MCAO組均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀，主要表現(xiàn)為其左側(cè)明顯的Horner’s癥狀，右側(cè)前肢不能完全伸展，大鼠行走時(shí)主要右側(cè)轉(zhuǎn)圈或是右側(cè)傾倒；GK5組、GK10組和BB5組、BB10組可明顯改善大鼠神經(jīng)癥狀(P<0.05)。提示GK和BB對(duì)大鼠神經(jīng)功能損傷有改善作用。見(jiàn)表1。

表1 缺血2 h再灌注12 h后各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及梗死體積百分比結(jié)果

2.2 HE染色組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

Sham組未見(jiàn)明顯病理改變，各種神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)多樣化，胞核界限清晰，胞質(zhì)均勻，可清晰見(jiàn)到細(xì)胞核。MCAO組見(jiàn)大鼠腦缺血中心區(qū)大量神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)部分神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮，胞核固縮、碎裂或溶解。GK10和BB10組與MCAO組相比，梗死區(qū)縮小，神經(jīng)元損傷程度減輕，細(xì)胞排列尚規(guī)則，殘存的細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常，GK10組殘留的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較BB10組稍多，但GK2.5，GK5，和BB2.5，BB5與MCAO組比較形態(tài)學(xué)有所好轉(zhuǎn)，但不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 缺血再灌注后各組大鼠HE染色結(jié)果(×400)

2.3 GK和BB對(duì)大鼠腦梗死范圍的影響

大鼠腦缺血2 h再灌注12 h后，腦組織經(jīng)過(guò)2% TTC染色后，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織不著色，即為白色。Sham組腦組織呈均一紅色，未見(jiàn)梗死灶；MACO組皮層和皮層下梗死面積大，與MCAO組相比，GK5組，GK10組和BB5組，BB10組腦梗死范圍明顯減小(P<0.05)，且與劑量呈負(fù)相關(guān)，提示GK和BB對(duì)缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用(圖2、表1)。

圖2 缺血2h再灌注12h后各組大鼠TTC染色結(jié)果

2.4 腦缺血再灌注大鼠皮層AQP-4的表達(dá)

Western blot結(jié)果：大鼠缺血2 h再灌注12 h后，與Sham組比較，MCAO組的AQP-4表達(dá)量明顯升高；與MCAO組比較，GK各亞組和BB亞組中AQP-4蛋白表達(dá)量都有所下降，其中GK10組和BB10組下降最為顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.001。見(jiàn)圖3。

與Sham組比較，###P<0.001；與MCAO組比較，***P<0.001圖3 Western blot檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮層AQP-4蛋白的表達(dá)

3 討 論

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的75%，而腦水腫是缺血性腦血管病常見(jiàn)的病理環(huán)節(jié)之一。腦水腫的發(fā)展是分階段的，細(xì)胞毒性水腫表現(xiàn)為急性損傷后數(shù)分鐘，而血管源性水腫則發(fā)生在缺血性卒中損傷后數(shù)小時(shí)，主要由于血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞而引起。

近年來(lái)，水通道被認(rèn)為是腦水腫與水通透有關(guān)的重要介質(zhì)。已知的水通道有14個(gè)，但只有AQP 1、AQP4、AQP9和AQP11在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。其中，AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的主要水通道蛋白，是腦水腫形成和清除的主要參與者[6]。AQP4可介導(dǎo)水跨膜的雙向運(yùn)動(dòng),參與血漿滲透壓的調(diào)節(jié)、血腦屏障的發(fā)育和功能維系,并兼有細(xì)胞外滲透壓感受器的功能,對(duì)維持腦內(nèi)水平衡至關(guān)重要[7]。

Aoki等[8]通過(guò)免疫組織化學(xué)雙標(biāo)法檢測(cè)AQP4的表達(dá)，研究表明，在缺血性腦卒中發(fā)生后，AQP4在腦組織中表達(dá)水平顯著升高，且在缺血中周圍較中心高。王秀輝[9]等應(yīng)用Werstrn Blot法檢MCAO模型腦組織中的AQP4水平，結(jié)果顯示，缺血側(cè)腦組織中AQP4表達(dá)水平隨時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì)，在24 h時(shí)達(dá)到最高峰，48 h時(shí)AQP4表達(dá)稍有下降。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[10]，敲除AQP4基因的小鼠在腦缺血和水中毒期間，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹減少，腦水腫程度減輕，其神經(jīng)功能缺損程度也隨之變小。

銀杏內(nèi)酯及白果內(nèi)酯是目前研究較多的銀杏葉制劑中最為有效的腦保護(hù)劑。銀杏內(nèi)酯主要作用為抗血小板、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗興奮毒性[11]及抗細(xì)胞凋亡[12]等作用；白果內(nèi)酯主要有抗炎[13]、抗興奮毒性[14]、調(diào)節(jié)能量代謝[15]等作用。上述兩種物質(zhì)均易通過(guò)血腦屏障。

本研究通過(guò)制備大鼠MCAO模型并給予不同濃度銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯進(jìn)行干預(yù)，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度探討銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腦缺血再灌注過(guò)程中，AQP4蛋白水平的增高有可能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)水的通透性增加，從而造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可以通過(guò)顯著降低缺血側(cè)AQP4蛋白的表達(dá)，減輕腦水腫程度，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，改善大鼠神經(jīng)功能損害,這可能為臨床預(yù)防和治療腦水腫及腦梗死提供新的靶點(diǎn)。