徐寒冰，郁書(shū)懷

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

菊粉(菊糖)是自然界中資源豐富的功能性低聚果糖，主要存在于菊科類(lèi)植物中，具有改善腸道微生態(tài)，促進(jìn)益生菌增殖，調(diào)節(jié)血糖、血脂，改善便秘，促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收以及減少患癌風(fēng)險(xiǎn)等功能，在乳制品、面制品、肉制品加工中有廣泛的應(yīng)用[1]。菊糖有多條代謝途徑，其中一條途徑是利用菊粉外切酶將菊粉分解為果糖[2]，利用菊粉內(nèi)切酶將菊糖降解為菊粉型低聚果糖[3]。菊粉型低聚果糖是不同聚合度的低聚果糖的混合物，如菊二糖(果果二糖)、菊三糖(果果三糖)、菊四糖(果果四糖)、菊五糖(果果五糖)、蔗果三糖、蔗果四糖和少量果糖，可發(fā)揮益生元作用，可較好地改善妊娠期的糖脂代謝，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，調(diào)節(jié)體內(nèi)菌群平衡以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3-6]。另一條途徑是利用菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(inulin fructotransferase，IFTase)降解菊糖為雙果糖酐(difructose anhydride, DFA)，菊糖可被三型菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(DFA-Ⅲ-forming inulin fructotransferase, IFTase-Ⅲ，EC 4.2.2.18)和一型菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(DFA-I-forming inulin fructotransferase, IFTase-Ⅰ，EC 4.2.2.17)分別酶解為三型雙果糖酐DFA-Ⅲ和一型雙果糖酐DFA-Ⅰ[7-8]。DFA-Ⅲ是一種功能性甜味劑，能量低，可以促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收，降低膽固醇，抗齲齒，增殖有益菌[9]。DFA-Ⅲ可被DFA-Ⅲase進(jìn)一步水解為菊二糖。菊糖這2條代謝途徑都生成了菊二糖，其中菊糖、菊粉型低聚果糖和DFA-Ⅲ都具有特殊的功能，菊二糖卻沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。另外，對(duì)低聚果糖的研究，多是直接研究混合糖的作用，沒(méi)有分離出單一的糖，不能確定是哪種成分起作用，或是多種糖起協(xié)同作用。這主要由于酶法制備的低聚果糖為多種成分的混合體，其單一成分難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；铣梢约凹兓?。

基于低聚果糖的生理功效，菊二糖也被推測(cè)為一種具有特殊功能的糖。然而菊二糖的產(chǎn)量很低，這限制了菊二糖相關(guān)性質(zhì)的研究。天然菊二糖存在于牛蒡等植物的根莖和香蕉等水果內(nèi)[10-11]，但是量很少，且與其他糖分離困難。酶法生產(chǎn)菊二糖有較大潛力，蔗糖轉(zhuǎn)化酶催化的蔗糖轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中，不僅生成了果糖和葡萄糖，同時(shí)還生成了菊二糖、1-蔗果三糖、6-蔗果三糖、新蔗果三糖，但是果糖和葡萄糖是主要產(chǎn)物[12]。菊粉酶和DFA-Ⅲase也能催化獲得菊二糖。菊粉酶水解菊粉得到的低聚果糖，主要成分為菊三糖、菊四糖，而菊二糖相對(duì)較少[3,13]。DFA-Ⅲase能夠水解DFA-Ⅲ獲得單一的菊二糖，無(wú)其他副產(chǎn)物產(chǎn)生，因此，DFA-Ⅲase在合成菊二糖方面有望成為一種關(guān)鍵酶。1975年，具有水解DFA-Ⅲ功能的酶首次從Arthrobacterureafaciens中被鑒定出來(lái)[14]。1997年，DFA-Ⅲase在Arthrobactersp. H65-7中被分離純化出，該酶在pH 4.5，60 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化DFA-Ⅲ為菊二糖的活性最高，同時(shí)該酶具有可逆催化功能，即催化菊二糖轉(zhuǎn)化為DFA-Ⅲ[15]。SAITO等[16]實(shí)現(xiàn)了DFA-Ⅲase基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的異源表達(dá)。YU等[17]從ArthrobacteraurescensSK8.001中獲得了DFA-Ⅲase編碼基因，并將其在大腸桿菌中克隆和表達(dá)，開(kāi)啟了國(guó)內(nèi)有關(guān)DFA-Ⅲase的研究。通過(guò)凝膠過(guò)濾和SDS-PAGE結(jié)果，得知該酶是一種同源三聚體，其單亞基相對(duì)分子質(zhì)量和全相對(duì)分子質(zhì)量分別為49 kDa和145 kDa，酶的活性中心位于亞基與亞基的裂縫之間，在pH 5.5，55 ℃時(shí)催化DFA-Ⅲ的活性最高。郁書(shū)懷[18]鑒定出了ArthrobacterchlorophenolicusA6中的DFA-Ⅲase，該酶是首個(gè)被報(bào)道能同時(shí)降解菊糖為DFA-Ⅲ，并催化DFA-Ⅲ水解為菊二糖的酶，即該酶具有連續(xù)催化性，其晶體結(jié)構(gòu)也被首次解析出。關(guān)于DFA-Ⅲase的研究目前仍然較少，且活性都較低，因此，獲得活性高、專(zhuān)一性強(qiáng)的DFA-Ⅲase對(duì)于菊二糖的研究至關(guān)重要。

本研究對(duì)來(lái)源于A.chlorophenolicusA6的AcDFA-Ⅲase進(jìn)行分子改造，以期得到酶活性提高的突變體。由于設(shè)計(jì)的突變體數(shù)量較多，一一純化測(cè)定酶活性，將十分耗時(shí)繁瑣。糖分析方法主要有色譜法、比色法和滴定法等[19]。色譜法準(zhǔn)確，但是耗時(shí)，滴定法不適用于大批量樣品的測(cè)定。比色法利用紫外-可見(jiàn)分光光度法和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法，前2種方法利用濃硫酸將多糖水解為單糖并脫水生成糖醛，再和苯酚/蒽酮生成有色化合物，利用分光光度計(jì)測(cè)量[19]。DNS法的原理是還原糖在堿性條件下與DNS反應(yīng)生成紅棕色化合物，且顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖的量成正比，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，被廣泛使用[20-21]。菊二糖作為一種還原糖[14]，可利用DNS法檢測(cè)。另外，高通量篩選技術(shù)可大大提高篩選效率[22-23]，所以本研究采用96孔板進(jìn)行高通量培養(yǎng)，配合DNS法快速檢測(cè)酶活性，篩選高酶活性的突變體，以期為DFA-Ⅲase突變體文庫(kù)的快速篩選，菊二糖的大量生產(chǎn)、性質(zhì)研究以及菊糖這一代謝途徑的補(bǔ)充奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)、EscherichiacoliDH5α，生工生物工程(上海)股份有限公司、含ArthrobacterchlorophenolicusA6來(lái)源的DFA-Ⅲase基因的重組質(zhì)粒pET22b-AcDFA-Ⅲase由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，保藏在本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 工具酶

PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶和DpnⅠ消化酶，TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基與主要試劑配制

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，調(diào)整pH至7.0，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min。液體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素至50 μg/mL，固體培養(yǎng)基中添加至100 μg/mL。配好的液體培養(yǎng)基于室溫存放，平板置于4 ℃冰箱存放。

純化所用緩沖液參考文獻(xiàn)[18]的配制方法。Binding buffer：500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4和50 mmol/L Na2HPO4，pH 7.4；Wash buffer：在Binding buffer基礎(chǔ)上添加50 mmol/L的咪唑，用于洗除雜蛋白；Elution buffer：在Binding buffer基礎(chǔ)上添加200 mmol/L咪唑，用于洗脫結(jié)合在柱子上的目的蛋白；酶透析液Ⅰ:Binding buffer中不添加NaCl和咪唑但添加10 mmol/L EDTA，用于去除蛋白溶液中的高濃度鹽分和金屬離子；酶透析液Ⅱ：在透析液I的基礎(chǔ)上不添加EDTA，目的是進(jìn)一步去除溶液中的鹽分、金屬離子以及EDTA。

DNS試劑：18.2 g酒石酸鉀鈉溶解于50 mL去離子水中，趁熱加入0.63 g DNS，2.1 g NaOH和0.5 g苯酚，攪拌至溶解，冷卻后定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存，放置1周后使用。

1.1.4 主要儀器

ProFlex PCR儀，美國(guó)賽默飛公司；Nano-300微量分光光度計(jì)，杭州奧盛公司；酶標(biāo)儀，南京拜爾沃公司；電泳儀，美國(guó)BIO-RAD公司；4600SF凝膠成像儀，上海天能公司；GL-21MS離心機(jī)，盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；臺(tái)式搖床，上海知楚儀器公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)-粗頻變桿，南京非奇經(jīng)貿(mào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變體的構(gòu)建

基于AcDFA-Ⅲase生物信息學(xué)分析、晶體結(jié)構(gòu)，理性設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)。基于AcDFA-Ⅲase基因序列設(shè)計(jì)含有突變氨基酸的PCR引物，序列見(jiàn)表1，其中C387A是重復(fù)本課題組之前的工作[18]。

表1 定點(diǎn)突變所用引物Table 1 Primers for site-directed mutagenesis

以重組質(zhì)粒pET22b-AcDFA-Ⅲase為模板，通過(guò)重疊延伸PCR引進(jìn)突變。PCR體系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，引物各100 pmol，模板10 ng，DNA聚合酶0.5 μL，加入滅菌水至50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s；55 ℃退火5 s，72 ℃延伸6.5 min；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用DpnI酶消化質(zhì)粒模板，消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，涂布于含有氨芐青霉素的抗性平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序成功后返回質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于抗性平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)得到重組菌。

1.2.2 高通量孔板初篩

在已滅菌的超凈工作臺(tái)中，用移液排槍將LB培養(yǎng)基分裝于已滅菌96深孔板，每孔分裝600 μL。用滅菌槍頭/牙簽挑取單菌落轉(zhuǎn)至深孔板中，用已滅菌的紗布或96孔板硅膠蓋封住深孔板。將96孔板固定在搖床上，37 ℃、900 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至裝有600 μL LB培養(yǎng)基的96深孔板，37 ℃、900 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，向孔板中添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，于28 ℃低溫誘導(dǎo)6 h。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)深孔板進(jìn)行離心，向其中加入200 μL溶菌酶(750 g/L)進(jìn)行破碎，并加入400 μL磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋。使用DNS法測(cè)定酶活性，直接在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，用酶標(biāo)儀批量測(cè)定540 nm下的吸光值，DNS法測(cè)酶活性時(shí)，酶活性定義為pH 6.5，55 ℃條件下，1 min生成1 μg葡萄糖還原當(dāng)量的還原糖所需酶量為1個(gè)酶活性單位。

1.2.3 搖瓶復(fù)篩驗(yàn)證

將初篩得到的酶活性提高的突變體菌株接種于10 mL含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，按2%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)，置于28 ℃搖床中培養(yǎng)6 h，在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，50 mmol/L)洗滌并懸浮，在冰水浴的條件下用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞(300 W，開(kāi)1 s，停2 s，破碎10 min)，破碎液在冰水浴中離心15 min，取上清液用于后續(xù)的蛋白純化。蛋白純化采用Ni-NTA柱親和層析法，用不同濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，收集各部分洗脫液。收集液進(jìn)行SDS-PAGE，驗(yàn)證純度。得到純酶后，用HPLC法進(jìn)行酶活性測(cè)定。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

酶活性測(cè)定：酶促反應(yīng)體系1 mL包括10 g/L DFA-Ⅲ、100 nmol/L純酶液、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)，反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時(shí)間10 min。沸水浴滅酶活性后，10 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。色譜柱：NH2P-50 4E氨基柱；流動(dòng)相：65%乙腈；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。HPLC法測(cè)定時(shí)的酶活性定義為在pH 6.5，55 ℃條件下，1 min生成1 μmol菊二糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。

最適溫度：分別在30～80 ℃(間隔5 ℃)下測(cè)定酶活性，把最適溫度下的酶活性定義為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活性。

最適pH：通過(guò)檸檬酸鈉鹽緩沖液(pH 5.0～6.5)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.5～7.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.0)配制10 g/L的DFA-Ⅲ底物，在最適溫度條件下反應(yīng)后測(cè)酶活性，把最適pH下的酶活性定為100%，計(jì)算其他pH下的相對(duì)酶活性。

動(dòng)力學(xué)研究：100 nmol/L的純酶液與2.0～50 mmol/L的DFA-Ⅲ在pH 6.5、55 ℃時(shí)反應(yīng)10 min。反應(yīng)后測(cè)定酶活性，根據(jù)雙倒數(shù)法或者非線性擬合方法計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.5 D380A同源建模

將D380A氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在線蛋白質(zhì)模型構(gòu)建服務(wù)器(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)進(jìn)行同源建模，模式選定為自動(dòng)構(gòu)建模式。選定AcDFA-Ⅲase晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：5ZKS)作為模板進(jìn)行三聚體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，模型的立體化學(xué)質(zhì)量主要是通過(guò)Wincoot軟件的拉氏構(gòu)象圖來(lái)判定，而原子模型(3D)和氨基酸序列(1D)兼容性的合理性是通過(guò)ASVES服務(wù)器的VERIFY-3D模塊進(jìn)行判定(http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)。最后使用可視化軟件PyMOL對(duì)模擬結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

AcDFA-Ⅲase的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出(PDB ID：5ZKS)，AcDFA-Ⅲase和底物雙果糖酐復(fù)合物的結(jié)構(gòu)也被解析出(PDB ID：5ZKU)，AcDFA-Ⅲase是1個(gè)同源三聚體，活性口袋位于2個(gè)相鄰亞基形成的裂縫中，口袋中心的活性殘基分為親水和疏水殘基兩部分，親水殘基有Ser84、Tyr163、Glu210、Arg258、Gln391、Asp177、Asp199、Gln222、Phe80、Ile85、Phe256以及Trp309?；钚钥诖戏酱嬖?個(gè)具有重要調(diào)控作用的loop環(huán)(將其稱(chēng)為活性口袋上方的蓋子，區(qū)域?yàn)锳sp378～Asp402)[18]，loop區(qū)是蛋白最柔性部分，保守性低，選擇這個(gè)區(qū)域的氨基酸殘基可以避免改變酶蛋白的保守結(jié)構(gòu)，而且活性中心以及蓋子周?chē)陌被釟埢鶎?duì)催化起重要作用[24-25]。所以最終選擇了這些區(qū)域的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，例如Ala209位點(diǎn)是關(guān)鍵催化位點(diǎn)Glu210附近的殘基，Ser82在活性口袋里，以及Thr310在活性口袋且與蓋子交界處，Val379、Asp380、Ala381、Phe388、Ala397處于蓋子區(qū)域，改變這些位點(diǎn)的殘基有可能影響到酶的催化能力。

2.2 雙果糖酐水解酶DFA-Ⅲase突變文庫(kù)的高通量篩選

DNS法是還原糖測(cè)定常用的經(jīng)典方法，但應(yīng)用傳統(tǒng)方法對(duì)大批量樣品檢測(cè)仍較繁瑣，所以有必要建立微型化DNS法。本研究利用微孔板進(jìn)行還原糖與DNS試劑反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下的吸光度。在96孔板中進(jìn)行DNS法比色時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=5.59x-0.026回歸系數(shù)為0.993 4，線性良好，能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)測(cè)定的需要。而且利用96孔板作為反應(yīng)容器時(shí)可同時(shí)處理96個(gè)樣品，樣品處理完再利用移液排槍轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板，幾分鐘內(nèi)即可讀取數(shù)據(jù)，操作簡(jiǎn)便；另外在96孔板中反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系小，可節(jié)約試劑。所以微孔板結(jié)合DNS法檢測(cè)有望成為酶活性高通量分析的方法。

將設(shè)計(jì)的突變體利用96孔板同步發(fā)酵培養(yǎng)，DFA-Ⅲase在大腸桿菌中是以胞內(nèi)酶形式表達(dá)，利用96孔板對(duì)菌體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，盡量保持每個(gè)孔的菌體濃度一致，為了保持結(jié)果的重復(fù)性，將同一樣品的重組酶液分裝在深孔板中，利用粗酶和底物反應(yīng)，采用DNS法對(duì)水解物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 原始酶和突變體的酶活性結(jié)果Fig.1 Enzyme activities of wild enzyme and mutants

對(duì)原始AcDFA-Ⅲase進(jìn)行定點(diǎn)突變得到的突變體酶仍然具有水解雙果糖酐的能力，但是大部分突變體的酶活性大幅度降低，只有D380A和C387A的酶活性有明顯提高。利用此方法測(cè)出D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的152.5%，C387A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的168.5%，而之前課題組用HPLC法測(cè)得C387A純酶的相對(duì)酶活性是AcDFA-Ⅲase的185.2%[18]，2種方法所得結(jié)果比較一致。可以初步認(rèn)定，D380A也是1個(gè)正向突變體，但是之前并未有人利用DNS法來(lái)檢測(cè)DFA-Ⅲase的酶活性，所以還需進(jìn)一步用HPLC法對(duì)其可信度進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 搖瓶復(fù)篩

將D380A突變體在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化，純化后的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示，有2條清晰的單條帶，純度較高，D380A的相對(duì)分子質(zhì)量在47 kDa左右，和AcDFA-Ⅲase一致，可以進(jìn)行酶活性測(cè)定。

M-蛋白marker；1-AcDFA-Ⅲase；2-D380A圖2 純化后的AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的 SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

酶活性測(cè)定以DFA-Ⅲ為底物，在pH 6.5、55 ℃條件下，采用HPLC檢測(cè)原始酶和突變酶的活性，突變體D380A的酶比活性為164.33 U/mg，原始菌株AcDFA-Ⅲase的酶比活性為101.25 U/mg，突變體D380A酶活性顯著高于原始酶，是AcDFA-Ⅲase的162.3%。而DNS法初篩結(jié)果得出，D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的152.5%，初篩和復(fù)篩結(jié)果一致。突變體庫(kù)初篩時(shí)采用的96孔板和搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩在體積、溶氧以及酶的純度等參數(shù)上存在較大的差異，在這種情況下，2種測(cè)定方法的結(jié)果仍然有較好的一致性，這表明96孔板結(jié)合DNS法可以作為AcDFA-Ⅲase的酶活性篩選手段，大大提高篩選效率，減少勞力和成本。

2.4 AcDFA-Ⅲase和D380A的酶學(xué)性質(zhì)

如圖3所示，突變體D380A和原始酶的最適溫度和最適pH均為55 ℃和6.5，在40～65 ℃以及pH 5.0～7.5范圍內(nèi)，酶活性仍能保持50%以上，結(jié)果表明理性設(shè)計(jì)可以在不改變酶的最適反應(yīng)條件下進(jìn)行。

a-溫度；b-pH圖3 AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的最適反應(yīng)條件Fig.3 Optimum reaction conditions of AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

2.5 AcDFA-Ⅲase和D380A的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

對(duì)AcDFA-Ⅲase和D380A進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，計(jì)算出它們的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。D380A的Km值較原始酶AcDFA-Ⅲase有所下降，說(shuō)明突變之后D380A對(duì)底物雙果糖酐的親和力提高了，而且D380A催化效率提高到了原始酶的1.5倍。

表2 AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

2.6 D380A同源建模

針對(duì)突變體D380A酶活性高的原因進(jìn)行分析，首先以野生酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:5ZKS)為模板，利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模。所構(gòu)建的模型通過(guò)Wincoot在拉氏圖(Ramachandran plot)進(jìn)行氨基酸分析。結(jié)果顯示，94.52%、4.80%和0.68%的氨基酸殘基分別坐落于核心區(qū)、允許區(qū)和非允許區(qū)域。當(dāng)落在核心區(qū)和允許區(qū)的氨基酸殘基占整個(gè)蛋白質(zhì)的比例高于90%，便可認(rèn)為該模型的構(gòu)象符合立體化學(xué)規(guī)則，而D380A模型拉氏圖中核心區(qū)和允許區(qū)的氨基酸所占比例總和高達(dá)99.32%。同時(shí)，D380A模型有91.14%氨基酸殘基的平均3D-1D分?jǐn)?shù)在0.2以上。蛋白質(zhì)原子三維結(jié)構(gòu)模型(3D)和一級(jí)氨基酸序列(1D)的匹配程度(兼容性)也是一個(gè)模型合理性的判定依據(jù)，一般要求80%的氨基酸殘基平均3D-1D分?jǐn)?shù)達(dá)到0.2以上即可判定此模型較合理。綜合這兩方面的檢測(cè)結(jié)果，所構(gòu)建的D380A模型合理，可用于后續(xù)研究分析。

均方根偏差(relative mean square deviation，RMSD)可用于分析試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)和實(shí)際數(shù)據(jù)的偏差，2種酶之間RMSD值越小，說(shuō)明其差異越小。D380A模型結(jié)構(gòu)與AcDFA-Ⅲase結(jié)構(gòu)比對(duì)的RMSD值為0.015 7 nm，說(shuō)明380位點(diǎn)氨基酸突變并沒(méi)有引發(fā)酶整體結(jié)構(gòu)的變化。圖4-a所示，野生酶AcDFA-Ⅲase活性口袋上方有1個(gè)loop環(huán)結(jié)構(gòu)，類(lèi)似蓋子封住口袋，有利于口袋疏水微環(huán)境的形成和催化。此蓋子富含疏水氨基酸，380位點(diǎn)的天冬氨酸與周邊氨基酸并沒(méi)有形成相互作用。且380毗鄰的379、381、382位點(diǎn)以及對(duì)立的397位點(diǎn)皆為疏水性氨基酸，這些疏水氨基酸的存在使水分子不易進(jìn)入活性中心。將380位點(diǎn)突變?yōu)楸彼岷?圖4-c)，這5個(gè)位點(diǎn)全部為疏水性氨基酸，蓋子區(qū)域疏水性顯然增強(qiáng)(圖4-d相對(duì)圖4-b中的疏水面積更大)。因此，外界水分子更加不易通過(guò)蓋子上方進(jìn)入活性口袋內(nèi)部，口袋中疏水微環(huán)境增強(qiáng)，更加有利于催化，即表現(xiàn)在380位點(diǎn)突變后的活性增加。

a-AcDFA-Ⅲase活性口袋區(qū)域結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基 (活性口袋中底物DFA-Ⅲ為黃色)；b-AcDFA-Ⅲase 活性口袋區(qū)域疏水性(疏水區(qū)域?yàn)榉奂t色)； c-D380A活性口袋區(qū)域結(jié)構(gòu)及氨基酸殘基； d-D380A活性口袋區(qū)域疏水性圖4 D380A活性提高機(jī)制分析Fig.4 Enhancement mechanism of D380A activity

3 結(jié)論

為了解決酶在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中穩(wěn)定性差，活性不高等問(wèn)題，需要對(duì)酶進(jìn)行合理的改造，如定點(diǎn)突變，定向進(jìn)化，這些方法取得了很大的成功。但是巨大的突變體庫(kù)增加了篩選難度以及篩選的成本，解決此問(wèn)題的關(guān)鍵是建立高通量篩選技術(shù)。

本研究對(duì)AcDFA-Ⅲase進(jìn)行了分子改造，并基于DFA-Ⅲase與DFA-Ⅲ反應(yīng)生成還原糖，建立了96孔板結(jié)合DNS法高效檢測(cè)DFA-Ⅲase活性的方法。利用高通量方法篩選與HPLC法驗(yàn)證，成功從17個(gè)突變體中篩選到1個(gè)酶活性提高62.3%的突變體D380A。利用同源建模模擬分析得出，將380位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，增?qiáng)了蛋白活性口袋上方loop區(qū)的疏水性，使水分子不易進(jìn)入活性中心，更益于催化，提高了酶的催化活性。

本研究建立的DFA-Ⅲase的高通量篩選方法，在人工操作的情況下可重復(fù)性高，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，提高了菌株的篩選效率。篩選得到的菌株為菊二糖的大量生產(chǎn)和性質(zhì)研究提供了可能性，也為催化機(jī)制解析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但是構(gòu)建的重組DFA-Ⅲase生產(chǎn)菌的酶活性仍有較大的提升空間，接下來(lái)可以嘗試通過(guò)多位點(diǎn)改造或隨機(jī)突變等手段來(lái)進(jìn)一步提高酶活性，提升其工業(yè)利用價(jià)值。