尹秋玉， 朱雅婷， 許文婷， 歐江華

(1新疆醫(yī)科大學(xué)， 烏魯木齊 830017； 2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部， 3新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科， 烏魯木齊 830000)

在一項美國女性乳腺癌篩查中，乳腺癌以最常見的腫瘤，成為癌癥第二大死亡原因[1]。三陰性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人表皮生長因子受體(HER2)表達(dá)全為陰性的乳腺癌，占乳腺癌類型的20%左右[2]?；煶蔀門NBC唯一的全身治療選擇[3]。盡管以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案還未被批準(zhǔn)為乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，但其臨床治療效果較為理想[4-5]，然而長期用藥發(fā)現(xiàn)，隨著應(yīng)用時間的延長，其顯示出較為明顯的耐藥性和細(xì)胞毒性，是導(dǎo)致化療失敗的主要原因[6]。

有研究指出，F(xiàn)OXO蛋白有助于調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的敏感性和耐藥性[7-8]，通過多種途徑影響腫瘤耐藥。為了提供更多的基礎(chǔ)理論支持，本實驗構(gòu)建順鉑耐藥的TNBC細(xì)胞，了解叉頭框基因O4(FOXO4)在順鉑耐藥TNBC細(xì)胞中的作用，再通過構(gòu)建FOXO4基因過表達(dá)細(xì)胞株，探討FOXO4對TNBC耐藥細(xì)胞順鉑敏感性的影響，為進(jìn)一步研究FOXO4在乳腺癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制提供新的細(xì)胞模型和更多理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥品三陰性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)購自武漢普諾賽生物細(xì)胞庫，順鉑(貨號MB1055)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，嘌呤霉素(貨號A610593)購自上海生物工程股份有限公司。

1.2 主要試劑和儀器DMEM(高糖)培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗(10000U)、胰酶(0.25% Trypsin-EDTA)購自美國Gibco公司；胎牛血清購自澳洲Excell Bio公司；PBS磷酸鹽緩沖液粉劑購自北京中杉金橋生物公司；DMSO(二甲基亞砜)購自德國Sigma公司；CCK-8細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；病毒助感染試劑HitransG A、病毒助感染試劑HitransG P、LV-FOXO4-OERNA、陰性對照病毒、GV492載體，BamHI / AgeI 酶切均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 耐藥細(xì)胞株的建立 取人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和BT549培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的混合DMEM高糖培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基加入2 μg/mL的DDP，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄含藥培養(yǎng)基，加不含藥物培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，重復(fù)劑量誘導(dǎo)，劑量為2 μg/mL到64 μg/mL遞增方式干預(yù)。期間需在不同時間段(每周)確定耐藥指數(shù)(RI)，當(dāng)耐藥指數(shù)達(dá)到4時，認(rèn)為耐藥細(xì)胞株建立成功。細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，將細(xì)胞在無藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4周，再進(jìn)行各項實驗。

1.3.2 目的基因片段的制備與慢病毒載體的構(gòu)建 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FOXO4基因(mRNA序列號：NM_005938)片段。FOXO4引物序列：5′-GCCAAGGTTATTGTCCGCTAAA，3′-GTCCCTCCCACCCTCAATGAAG。根據(jù)FOXO4基因全序列設(shè)計PCR引物，并在其上下游分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和AgeI酶切相應(yīng)位點獲得線性化載體，然后利用DNA瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定并回收。將目的基因擴(kuò)增片段與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，得到FOXO4基因的重組慢病毒連接產(chǎn)物L(fēng)V-FOXO4。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取與雙酶切凝膠電泳鑒定。對鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證，序列對比正確即表明重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

1.3.3 慢病毒包裝以及滴度檢測 采用載體質(zhì)粒GV492、病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48～72 h后收集細(xì)胞上清液。在4℃條件下，以4 000 r/min離心10 min。用0.45 μm濾器過濾上清液收集病毒濃縮液，根據(jù)熒光顯微鏡下熒光表達(dá)情況應(yīng)用倍比稀釋法檢測病毒滴度。

1.3.4 預(yù)實驗確定最佳感染條件 將培養(yǎng)好的耐藥株用完全培養(yǎng)基制備2 mL密度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL懸液，37℃培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞匯合度達(dá)30%左右。從冰箱取出陰性對照病毒，冰上緩慢融化，用無血清培養(yǎng)基依次將病毒稀釋至滴度為1×108TU/mL，1×107TU/mL，1×106TU/mL，各50 μL。吸掉各孔中上清液，加入病毒及相應(yīng)助感液，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。感染12 h后換回正常培養(yǎng)基，感染約48 h，當(dāng)熒光表達(dá)豐度較高時，用顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。將感染效率80%左右且生長狀態(tài)良好的組所對應(yīng)的感染條件和轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)值(MOI)作為后續(xù)感染實驗的依據(jù)。

1.3.5 確定嘌呤霉素最適劑量 取生長狀態(tài)良好、匯合率達(dá)90%的耐藥株細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104個/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(每孔100 μL，5個復(fù)孔)。接種24 h細(xì)胞貼壁后，將FOXO4過表達(dá)慢病毒在助轉(zhuǎn)試劑A下轉(zhuǎn)染后，使用不同濃度嘌呤霉素(0、0.5、1.5、2.5、5 μg/mL)干預(yù)72 h，后于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，以絕大部分(約90%)細(xì)胞死亡所對應(yīng)的嘌呤霉素濃度作為最佳篩選濃度。

1.3.6 病毒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選 用完全培養(yǎng)基制備2 mL密度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL懸液，37℃培養(yǎng)24 h。首先將GV492病毒冰上融化，根據(jù)預(yù)實驗篩選的最佳MOI值和助感液類型進(jìn)行相應(yīng)稀釋后備用。棄原培養(yǎng)液加入已稀釋好的病毒和助感液，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將實驗細(xì)胞分為4組：MDA-MB-231組(Control組)、MDA-MB-231/DDP組(耐藥組)、NC組(GV492-空載組)以及FOXO4-OERNA組(FOXO4-過表達(dá)組)。轉(zhuǎn)染72 h后，NC組和FOXO4-OERNA組更換用含最適嘌呤霉素濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3天更換新鮮的含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后收集細(xì)胞進(jìn)行驗證。

1.3.7 qRT-PCR檢測FOXO4 mRNA 的表達(dá)量 收集轉(zhuǎn)染前后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，棄原培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol消化細(xì)胞，后續(xù)實驗按照qRT-PCR實驗報告操作，用 2- ΔΔCt法計算FOXO4 mRNA的表達(dá)水平。

1.3.8 Western blotting檢測目的基因表達(dá) 取4組細(xì)胞(Control組、耐藥組、 NC組以及FOXO4-OERNA組)分別用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，然后于濃縮膠和分離膠中分別電泳，在4℃、300 mA恒流條件下電轉(zhuǎn)150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。5%脫脂奶封閉，先后加入一抗和HRP標(biāo)記的二抗，在室溫下分別孵育2 h和1.5 h，洗膜、曝光后檢測條帶灰度值，分析各組細(xì)胞目的基因蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.9 CCK-8法確定耐藥指數(shù) 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Control組、耐藥組和FOXO4-OERNA組細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以每孔5×104個/mL密度接種于96孔板中，置于37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入配置好的10% CCK-8溶液避光培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，通過計算順鉑半致死濃度(IC50)值確定細(xì)胞耐藥指數(shù)RI和逆轉(zhuǎn)指數(shù)，RI=各組耐藥細(xì)胞系的IC50/敏感細(xì)胞系的IC50，逆轉(zhuǎn)指數(shù)=IC50(耐藥細(xì)胞) / IC50(耐藥細(xì)胞+FOXO4-OERNA)。

2 結(jié)果

2.1 順鉑耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建通過小劑量濃度梯度法誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞，構(gòu)建MDA-MB-231/DDP順鉑耐藥細(xì)胞株。與親本株MDA-MB-231細(xì)胞相比，MDA-MB-231/DDP的抑制率更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) (圖1)。MDA-MB-231/DDP和MDA-MB-231的IC50值分別為28.344 μg/mL和5.418 μg/mL，RI=5.231。RI>4，表明耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。

DDP concentration (μg/mL)

2.2 FOXO4在TNBC順鉑耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，目的基因FOXO4在耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP中的表達(dá)較親本株MDA-MB-231顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖2)，提示FOXO4可能與TNBC順鉑耐藥具有顯著相關(guān)性。

注：與MDA-MB-231組相比， **P<0.01。

2.3 FOXO4過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

2.3.1 重組慢病毒質(zhì)粒鑒定 重組慢病毒質(zhì)粒LV-FOXO4經(jīng)BamHI和AgeI雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，電泳結(jié)果可見一條1 500 bp左右的條帶，與目的基因理論值1 559 bp相符。重組質(zhì)粒測序結(jié)果見圖4，質(zhì)粒中插入的目的基因片段與FOXO4基因序列一致，表明FOXO4基因成功插入GV492載體中。

注：1，陰性對照(ddH2O)； 2，陰性對照(空載自連對照組)； 3，陽性對照(GAPDH)； 4，轉(zhuǎn)染組 5-12： 1-8號轉(zhuǎn)化子。

圖4 重組慢病毒質(zhì)粒FOXO4插入片段的部分測序圖譜

2.3.2 病毒滴度檢測與熒光表達(dá)情況 病毒滴度結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO4慢病毒的滴度為3.5×108TU/mL，NC組的滴度為1.0×108TU/mL。轉(zhuǎn)染慢病毒后的LV-FOXO4細(xì)胞用嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選出FOXO4穩(wěn)定株，當(dāng)細(xì)胞幾乎無死亡現(xiàn)象時，表明細(xì)胞具有嘌呤抗性。對照組為未轉(zhuǎn)染病毒的組，暗場觀察不到熒光；加入不同體積的慢病毒后，可明顯觀察到綠色熒光，表明目的基因慢病毒轉(zhuǎn)染成功(圖5)。

圖5 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況

2.3.3 轉(zhuǎn)染最佳MOI值、助感染液的確定 在不同濃度病毒感染MDA-MB-231/DDP細(xì)胞48 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況，將感染效率80%左右且生長狀態(tài)良好的組所對應(yīng)的感染條件和MOI值作為后續(xù)感染實驗的依據(jù)。根據(jù)熒光表達(dá)結(jié)果顯示(圖6)，確定MOI=100、HitransG A助感液為病毒最佳感染條件。

2.3.4 嘌呤霉素最適篩選濃度的確定 經(jīng)不同濃度嘌呤霉素(0、0.5、1.5、2.5、5 μg/mL)干預(yù)72 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況(表1)。當(dāng)嘌呤霉素濃度達(dá)到2.5 μg/mL時，細(xì)胞死亡率達(dá)到90%以上，且隨著嘌呤霉素濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞死亡率未見明顯升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，將2.5 μg/mL確定為嘌呤霉素最佳篩選濃度。

表1 不同濃度嘌呤霉素對MDA-MB-231/DDP細(xì)胞增殖的影響

圖6 MDA-MB-231/DDP細(xì)胞感染熒光圖片

2.4 qRT-PCR檢測FOXO4表達(dá)情況qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：NC組的基因表達(dá)量(1.034±0.302)較Control組(1.051±0.257)無明顯差異。FOXO4-OERNA組的基因表達(dá)量(3.459±0.983)較Control組和NC組，表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明FOXO4過表達(dá)耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功，基因表達(dá)柱狀圖見圖7。

注：與Control和NC組比較，*P<0.05。

2.5 Western blotting檢測目的基因表達(dá)情況Western blotting結(jié)果顯示，耐藥組FOXO4蛋白表達(dá)明顯低于Control組和FOXO4-OERNA組，且FOXO4-OERNA組蛋白表達(dá)明顯高于NC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖8)。

注：與Control組和FOXO4-OERNA組相比， *P<0.05； 與NC組相比，#P<0.05。

2.6 過表達(dá)FOXO4可逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性CCK-8法檢測顯示， FOXO4-OERNA組對順鉑的IC50值為16.598 μg/mL，耐藥指數(shù)RI=3.063，與轉(zhuǎn)染前MDA-MB-231/DDP組RI值(5.231)相比，逆轉(zhuǎn)指數(shù)達(dá)到1.708，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞耐藥指數(shù)和逆轉(zhuǎn)指數(shù)

3 討論

以鉑為基礎(chǔ)的化療在三陰性乳腺癌治療中表現(xiàn)出較好的效果[2]，但目前乳腺癌治療有效率仍然不高，這與治療過程中產(chǎn)生的耐藥性有關(guān)，是治療過程中的一個關(guān)鍵問題[9]。因此，盡快找到影響鉑類耐藥的有效分子靶點，是目前逆轉(zhuǎn)乳腺癌順鉑耐藥的關(guān)鍵。

叉頭框基因FOXO4作為公認(rèn)的腫瘤抑制因子，影響著多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]。Yu等[11]指出，迷迭香酸通過下調(diào)miR-6785-5p和miR-642a-3p以增加FOXO4的表達(dá)，從而增強(qiáng)胃癌SGC7901耐藥細(xì)胞對5-FU的化療敏感性。在結(jié)腸癌中，F(xiàn)OXO4的激活有利于減輕細(xì)胞對化療藥物的耐藥性[12]。在鼻咽癌中, 上調(diào)miRNA-421通過靶向FOXO4的3′端非編碼區(qū)抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而影響細(xì)胞增殖[13]。雙硫侖由于其抗腫瘤特性，與銅聯(lián)合療法目前正在進(jìn)行轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的II期臨床試驗，Kaowinn等[14]指出，雙硫侖通過誘導(dǎo)FOXO4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而增強(qiáng)順鉑等化療藥物的抗增殖作用。本實驗通過qRT-PCR和Western blotting檢測FOXO4在順鉑耐藥株和病毒轉(zhuǎn)染株中的表達(dá)差異，初步驗證了FOXO4基因在順鉑耐藥株MDA-MB-231/DDP中的表達(dá)量是降低的，與我們的前期研究結(jié)果一致：在順鉑耐藥患者病理標(biāo)本中FOXO4呈低表達(dá)狀態(tài)。

逆轉(zhuǎn)錄病毒作為近年來使用較為廣泛的載體，已被普遍應(yīng)用于各種癌癥的研究[15]。其包括三種類型的載體，分別是慢病毒、腺病毒以及腺相關(guān)病毒(AAV)載體。在病毒載體中，慢病毒載體作為腫瘤基因治療中最有前途的基因傳遞系統(tǒng)之一，具有進(jìn)入細(xì)胞并將遺傳物質(zhì)穩(wěn)定運送到目的細(xì)胞的能力[16-17]，目前廣泛應(yīng)用于過表達(dá)實驗的研究。慢病毒DNA能夠在病毒整合酶的作用下穩(wěn)定地插入到宿主基因組中，從而將非增殖或緩慢增殖的細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)導(dǎo)[18-19]。本研究通過將LV-FOXO4-OERNA慢病毒載體質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入耐藥細(xì)胞株MDA-MB-231/DDP中增強(qiáng)目的基因FOXO4的表達(dá)，在一定程度上恢復(fù)了TNBC對順鉑的敏感性。Shi等[20]綜述了FOXO在卵巢癌鉑類耐藥的環(huán)境中表達(dá)量是降低的，這可能與PI3K/Akt/FOXO信號通路有關(guān)。本研究通過基因過表達(dá)實驗，發(fā)現(xiàn)FOXO4具有逆轉(zhuǎn)乳腺癌順鉑耐藥性的作用，推測FOXO4可能是乳腺癌順鉑耐藥的一個重要分子靶點，然而本實驗僅局限于細(xì)胞方面的研究，缺乏相應(yīng)的動物實驗，其影響耐藥的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。