陳媛鑫， 阿衣努爾·買提斯迪克， 劉闐生， 買買提明·努爾買買提, 劉 凱

(1新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830017； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科顯微修復(fù)外科， 烏魯木齊 830054)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是絕經(jīng)后婦女由于雌激素缺乏發(fā)生骨代謝失衡、骨量低為主要特征的全身代謝性疾病[1]。骨代謝機(jī)制極復(fù)雜，在防治PMOP方面存在諸多爭議，需進(jìn)一步研究闡明其發(fā)病機(jī)制。下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的中樞，參與調(diào)控PMOP[2]。弓狀核為下丘腦神經(jīng)分泌系統(tǒng)中重要的核團(tuán)，通過多途徑調(diào)控骨代謝[3]，弓狀核β-EP則是調(diào)控骨代謝的重要途徑[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)濕寒證可造成大鼠骨密度降低，骨折應(yīng)力及楊氏模量下降，骨代謝尿指標(biāo)鈣、磷、I型膠原交聯(lián)N-末端肽、I型膠原交聯(lián)C-末端肽等處于紊亂狀態(tài)[5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，濕寒證模型組大鼠血清中腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)酮較正常對照組升高，下丘腦、垂體、腎上腺細(xì)胞器有不同程度的改變，提示濕寒證模型組的下丘腦-垂體-腎上腺軸可能處于應(yīng)激中[6]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究濕寒證對下丘腦弓狀核β-EP表達(dá)的影響，探討濕寒證與弓狀核功能之間的關(guān)系，從弓狀核功能角度闡明濕寒證對骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)發(fā)生發(fā)展的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物4月齡未交配的SPF級(jí)雌性SD大鼠，體重(240±10)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。生產(chǎn)許可證：SCXK(新)-2018-0002。倫審會(huì)批號(hào)：LACUC20190916-01。

1.2 主要試劑與儀器β- EP一抗購自美國Novus Biologicals公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒等購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體稀釋液購自中杉金橋公司；EDTA修復(fù)液購自北京索萊寶科技有限公司；徠卡攤片機(jī)、徠卡組織包埋機(jī)、徠卡石蠟切片機(jī)(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)；RQH-350型人工氣候箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 寒涼性飼料制備將普通飼料、芫荽籽+菠菜籽按7∶3比例混合制備[5]，委托于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司加工。

1.4 分組及造模

1.4.1 分組 將30只雌性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組6只。依次設(shè)為正常對照組、假手術(shù)組、濕寒證模型組、OVX模型組、OVX+濕寒證模型組。正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)，假手術(shù)組僅做假手術(shù)，濕寒證模型組加濕寒證病因因素，OVX模型組做OVX手術(shù)，OVX+濕寒證模型組做OVX手術(shù)加濕寒證病因因素。各組大鼠均自由攝食飲水。

1.4.2 造模 濕寒證模型的建立:參照文獻(xiàn)[6]將濕寒證模型組大鼠置于濕寒環(huán)境,設(shè)置環(huán)境溫度(6±1)℃，相對濕度85%～95%、寒涼性飼料喂養(yǎng)、冷水強(qiáng)迫游泳,水溫: (6±1)℃，1 d/次、持續(xù) 5 min聯(lián)合刺激24 d。骨質(zhì)疏松癥模型的建立：對OVX模型組大鼠采用摘除雙側(cè)卵巢法，第9周建立OVX模型。假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢周圍的脂肪組織。OVX+濕寒證模型的建立：參照文獻(xiàn)[5]對OVX+濕寒證模型組大鼠用濕寒證造模方法與骨質(zhì)疏松癥造模方法聯(lián)合同時(shí)干預(yù)，第9周建立模型。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 外觀表征的觀察 每周記錄各組大鼠的證候表征變化，包括鼻唇、舌、行為狀態(tài)、情緒反應(yīng)、興奮程度、體重、飲食等。

1.5.2 大鼠骨密度和微結(jié)構(gòu)參數(shù) 脛骨甲醛固定24 h后，乙醇脫水，甲醛處理，包埋；用Micro-CT測量骨密度和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)。

1.5.3 病理切片 用HE法染色觀察下丘腦弓狀核病理變化，包埋，切片，染色。

1.5.4 弓狀核β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù) 使用SABC免疫組化法，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，圖片采用FIJI8.0圖形分析軟件分析，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外在表征與正常對照組比，濕寒證模型組大鼠體型臃腫，鼻部潮濕，舌體胖大，舌苔白膩，蜷臥少動(dòng)，尿色清、尿量明顯增多，大便塘稀，體重增長緩慢，攝食量增加，飲水量減少，但總體呈上升趨勢，呈現(xiàn)濕寒證候表征。見圖1～3。

圖1 正常對照組和濕寒證模型組大鼠攝水量比較

圖2 正常對照組和濕寒證模型組大鼠攝食量比較

圖3 正常對照組和濕寒證模型組大鼠體重增長比較

2.2 大鼠脛骨骨密度和微結(jié)構(gòu)變化與正常對照組相比OVX模型組骨密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中骨體積百分比下降、骨小梁分離度上升，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明骨微結(jié)構(gòu)受到破壞，有差異性改變，OVX造模成功。與OVX模型組相比，OVX+濕寒證模型組骨密度下降(P>0.05)，但骨小梁分離度上升、骨小梁分離度標(biāo)準(zhǔn)差、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明骨微結(jié)構(gòu)有改變。見表1。

2.3 大鼠下丘腦HE染色病理結(jié)果正常對照組大鼠下丘腦在低倍鏡下可見弓狀核區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量均勻，組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞間空隙較小，細(xì)胞核形態(tài)排列規(guī)則，細(xì)胞界限清晰(圖4A)。濕寒證模型組細(xì)胞核形態(tài)排列不規(guī)則(圖4B)，下丘腦基質(zhì)疏松，開始出現(xiàn)部分細(xì)胞界限不清晰，核顏色加深(圖4C)。OVX模型組弓狀核區(qū)域出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元壞死，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮、溶解、消失，組織結(jié)構(gòu)變疏松，細(xì)胞間空隙變大，呈現(xiàn)空隙狀(圖4D)。OVX+濕寒證模型組神經(jīng)元細(xì)胞大面積凋亡，細(xì)胞界限不清，組織結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞間出現(xiàn)大面積空隙(圖4E)。

2.4 大鼠下丘腦弓狀核β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)變化β-EP著色于胞漿呈黃色或棕黃色的顆粒。生理狀態(tài)下下丘腦β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞呈高表達(dá)(圖6A)，與正常對照組比，濕寒證模型組β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常對照組對比，OVX模型組β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與OVX模型組對比，OVX+濕寒證模型組β-EP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、6。

表1 各組大鼠脛骨骨密度和微結(jié)構(gòu)參數(shù)

注：A,正常對照組;B,假手術(shù)組;C,濕寒證模型組;D,OVX模型組;E,OVX+濕寒證模型組。

注：與正常對照組(A)比較, △P<0.05; 與假手術(shù)組(B)比較, ▲P<0.05; 與濕寒證模型組(C)比較, #P<0.05; 與OVX模型組(D)比較, *P<0.05。

注：A,正常對照組;B,假手術(shù)組;C,濕寒證模型組;D,OVX模型組;E,OVX+濕寒證模型組(箭頭示陽性細(xì)胞)。

3 討論

中醫(yī)病證結(jié)合模型是按中醫(yī)基礎(chǔ)理論復(fù)制，同時(shí)疊加現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病的模型[7]。本研究加入中醫(yī)濕寒證致病因素，再聯(lián)合OVX手術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松濕寒病證大鼠模型。本研究結(jié)果顯示濕寒證模型組、OVX+濕寒證模型組加入濕寒證候病因，所構(gòu)建的濕寒證大鼠模型，其外在表征與濕寒證臨床癥狀基本相似。

中醫(yī)理論認(rèn)為腦具有調(diào)控骨的作用，“髓充骨養(yǎng)腦”和“腦-骨”軸為抗OP機(jī)制提供了新思路[8]。人體在低溫環(huán)境下可激活中樞應(yīng)激系統(tǒng)，改變應(yīng)激因子和神經(jīng)遞質(zhì)[9]。故濕寒證可引起下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)改變，濕寒證可影響并加重其凋亡。β-EP是由弓狀核前阿片黑皮質(zhì)素裂解生成的神經(jīng)肽，可被釋放進(jìn)入腦脊液影響大腦區(qū)域，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[10]。β-EP對食物攝入量的長期調(diào)節(jié)是中度抑制，限制了食物的消耗[11]，故濕寒證模型組大鼠β-EP下降后，攝食量較正常對照組增加。β-EP產(chǎn)生的欣快感和幸福感使大鼠活躍，大鼠長期或反復(fù)受約束應(yīng)激會(huì)減少β-EP作用在下丘腦μ-阿片受體的表達(dá)，出現(xiàn)整體應(yīng)激反應(yīng)，故濕寒證組β-EP降低后出現(xiàn)蜷臥少動(dòng)的狀態(tài)改變；β-EP受體的配體介導(dǎo)了骨系統(tǒng)中的生物效應(yīng)，包括骨礦化、骨保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)，通過能量代謝的相互作用參與骨骼形成。有研究表明，可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，降低破骨細(xì)胞活性，從而預(yù)防或治療OP[12]。β-EP可通過減少NF-κB信號(hào)通路下游的I-κBα和p65蛋白的磷酸化水平，從而調(diào)控NF-κB通路[13]。有研究表明，提高β-EP水平可調(diào)節(jié)骨代謝[14]?？梢姦?EP在OP的形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果提示濕寒證是影響β-EP表達(dá)水平下降的原因，與正常對照比，濕寒證模型組β-EP表達(dá)下降，與OVX模型組比，OVX+濕寒證模型組β-EP表達(dá)較減少更為明顯。環(huán)境因素對PMOP的形成密切相關(guān)，寒冷環(huán)境對骨密度影響較大，易造成骨量丟失，加速OP進(jìn)程[15]。與OVX組比，OVX+濕寒證模型組骨密度下降更顯著。本研究認(rèn)為濕寒證可使下丘腦弓狀核β-EP表達(dá)水平下降，而β-EP可調(diào)節(jié)骨代謝，故濕寒證可引起骨密度下降。本研究結(jié)果指出濕寒證可能是通過弓狀核神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及β-EP表達(dá)水平下降，導(dǎo)致絕經(jīng)后大鼠骨密度減少、骨微結(jié)構(gòu)改變,從而誘發(fā)OP的發(fā)生發(fā)展。β-EP可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，通過調(diào)控β-EP表達(dá)水平從而預(yù)防OP。本研究闡明了濕寒證與β-EP的內(nèi)在聯(lián)系，為防治OP提供了新思路。但本研究樣本量小，也沒有相關(guān)信號(hào)通路的支持，今后的研究，應(yīng)開展大樣本并加入信號(hào)通路的檢測，以期為中醫(yī)藥治療OP提供更多理論依據(jù)。