張 亮， 唐 城， 薛紅瑞， 謝湘云,3， 劉曉航， 單 宇， 高曉黎,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830017； 2新疆特豐藥業(yè)股份有限公司， 烏魯木齊 830000；3新疆及中亞特色醫(yī)藥資源教育部工程研究中心， 烏魯木齊 830017； 4新疆第二醫(yī)學(xué)院， 新疆 克拉瑪依 834000)

復(fù)方甘草酸苷片最早由日本Minophagen pharmaceutical Co., Ltd.公司研發(fā)，于1954年以商品名美能?，英文名：Stronger Neo-Minophagen C在日本獲批上市[1-2]，上市劑型為糖衣片劑，每片含甘草酸苷25 mg，甘氨酸25 mg，DL-蛋氨酸25 mg。2018年國家藥審中心公布的第十三批參比制劑目錄(第38號通告)中指定美能?為復(fù)方甘草酸苷片仿制藥質(zhì)量與療效一致性評價(以下簡稱一致性評價)的參比制劑[3]。仿制藥一致性評價研究內(nèi)容主要包括藥學(xué)一致性研究和生物等效性研究兩大部分。在固體制劑藥學(xué)一致性研究中，須建立具有區(qū)分力的溶出曲線測定方法，用以評價仿制制劑和原研制劑在不同溶出介質(zhì)中體外溶出曲線的相似性。保證仿制藥和原研制劑在體外多種溶出介質(zhì)中溶出曲線的相似性，可提高體內(nèi)生物等效性試驗(yàn)的成功率。為了開展復(fù)方甘草酸苷片仿制藥一致性評價研究，本研究以參比制劑美能?為研究對象，建立高效液相色譜法測定其中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸3種活性成分的含量測定方法，按照《中國藥典》2020版第四部附錄藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行分析方法驗(yàn)證[4]。參照《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]，采用漿法，轉(zhuǎn)速為50 r/min，選擇與日本橙皮書[6]中相同的溶出介質(zhì)：pH1.2鹽酸溶液、pH4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液與水為溶出介質(zhì)，測定了3個批次的復(fù)方甘草酸苷片參比制劑美能?中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸3種活性成分在4種不同的溶出介質(zhì)中的含量，計算平均累積溶出百分率，繪制溶出曲線，為復(fù)方甘草酸苷片質(zhì)量控制和開展固體仿制藥溶出曲線的相似性評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫)；自動溶出儀(上海富科思儀器有限公司)；真空脫氣機(jī)(上海富科思儀器有限公司)。

1.2 試藥甘草酸銨(中國食品藥品檢定研究院，110731-202021) ，甘氨酸(中國食品藥品檢定研究院，140689-201605)，DL-蛋氨酸(SIGMA，MKBT7964V)，復(fù)方甘草酸苷片(美能?)(Akiyama Jozai Co.,Ltd.，批號19125/19188/19221)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 甘草酸銨色譜條件[7]色譜柱： C18(4.6×150 nm，5 μm)；流動相：乙腈-冰乙酸水溶液(35∶65)；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；運(yùn)行時間：15 min。

2.1.2 氨基酸檢測色譜條件 色譜柱：SHIM-PACK AMINO-NA(6.0×100 mm，5 μm)；流動相：檸檬酸鈉溶液；熒光檢測器；檢測波長：激發(fā)光波長350 nm，發(fā)射光波長450 nm；柱溫：60 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：對照品20 μL，樣品2 μL；運(yùn)行時間：15 min；柱后衍生條件：衍生試劑：鄰苯二甲醛溶液；流速：0.3 mL/min；衍生溫度：60℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 甘草酸銨對照品貯備液 稱取甘草酸銨對照品12.5 mg置50 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，搖勻，即得甘草酸銨對照品貯備液。

2.2.2 氨基酸對照品儲備液制備

2.2.2.1 甘氨酸對照品儲備液 稱取甘氨酸對照品12.5 mg置50 mL量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，搖勻，作為甘氨酸對照品儲備液。

2.2.2.2 DL-蛋氨酸對照品儲備液 稱取DL-蛋氨酸對照品25 mg置100 mL量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，搖勻，作為DL-蛋氨酸對照品儲備液。

2.2.2.3 甘氨酸-DL-蛋氨酸混合對照品溶液 分別量取甘氨酸對照品儲備液、DL-蛋氨酸對照品儲備液各1 mL，置同一100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，作為甘氨酸-DL-蛋氨酸混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取供試品20片，精密稱定，計算平均片重，研磨，精密稱定1/10平均片重供試品至100 mL容量瓶中，加入各介質(zhì)振搖并超聲15 min，然后稀釋并定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.3 溶出介質(zhì)配制

2.3.1 水介質(zhì)配制 自制純化水采用脫氣裝置經(jīng)37℃脫氣30 min。

2.3.2 pH1.2介質(zhì)的配制 取氯化鈉2.0 g，加水適量使溶解，加鹽酸約5 mL，加水稀釋至1 L，混勻后用鹽酸調(diào)pH至1.2。

2.3.3 pH4.0介質(zhì)的配制 取十二水合磷酸氫二鈉17.91 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，即得0.05 mol/L的磷酸氫二鈉溶液；另取一水合檸檬酸(亦稱枸櫞酸)5.25 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，即得0.025 mol/L的檸檬酸溶液。用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)磷酸氫二鈉溶液，混勻后用鹽酸調(diào)pH至4.0。

2.3.4 pH6.8介質(zhì)的配制 稱取磷酸二氫鉀1.70 g和無水磷酸氫二鈉1.775 g，用水溶解至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.80。

2.4 4種溶出介質(zhì)中甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸分析方法驗(yàn)證

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 甘草酸苷系統(tǒng)適用性：取甘草酸銨對照品溶液按“2.1.1”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，甘草酸苷峰保留時間的RSD為0.27%，峰面積的RSD為0.13%，理論板數(shù)按甘草酸苷峰計算不低于2 000，拖尾因子不大于2.0，表明系統(tǒng)適用性良好。氨基酸系統(tǒng)適用性：取甘氨酸、DL-蛋氨酸混合對照品溶液按照“2.1.2”項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，4種介質(zhì)中，甘氨酸峰與DL-蛋氨酸峰的分離度均大于1.5，pH1.2、pH 4.0、pH 6.8及水介質(zhì)中甘氨酸峰和DL-蛋氨酸峰面積的RSD分別為0.15%、0.17%；0.71%、0.80%；0.39%、0.53%；0.10%、0.18%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.4.2 專屬性測定 甘草酸苷專屬性：取溶劑對照、空白輔料樣品對照、對照品、供試品各20 μL，按“2.1.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，甘草酸苷保留時間約為12.9 min，4種介質(zhì)與輔料均不干擾甘草酸苷測定，方法專屬性良好，代表性圖譜如圖1所示。氨基酸專屬性：取溶劑對照、空白輔料樣品對照、供試品各20 μL，對照品2 μL，按“2.1.2”項色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明，甘氨酸保留時間約為8.3 min，DL-蛋氨酸約為13.0 min，4種介質(zhì)與輔料均不干擾甘氨酸和DL-蛋氨酸測定，方法專屬性良好，代表性圖譜如圖2所示。

注： A為水介質(zhì)， B為陰性對照， C為對照品溶液， D為供試品溶液。

注：A為水介質(zhì)，B為陰性對照，C為對照品溶液，D為供試品溶液。

2.4.3 線性范圍考察 甘草酸苷線性范圍考察：取“2.2.1”項下對照品儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，用4種介質(zhì)定量稀釋制成甘草酸苷濃度分別為1.25、5、10、15、20 μg/mL的溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)線性回歸，4種介質(zhì)中質(zhì)量濃度在1.065～17.03 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。氨基酸線性考察：取“2.2.2.3”項下對照品儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，用4種介質(zhì)定量稀釋制成甘草酸苷濃度分別為0.125、0.5、1、1.5、2 μg/mL的溶液，按照“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，測定甘氨酸和DL-蛋氨酸峰面積，測定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)線性回歸，4種介質(zhì)中質(zhì)量濃度在0.123 8～2.984 4 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)果如表1所示。

2.4.4 準(zhǔn)確度的測定 甘草酸苷的回收率考察：按處方量稱取甘草酸單銨鹽、空白輔料、甘氨酸、DL-蛋氨酸，置500 mL量瓶中，用各介質(zhì)溶解并定容，超聲20 min，5 000 r/min離心5 min取上清液；再分別精密量取1、2.5、5、6 mL，置10 mL量瓶中，各濃度平行制備3份，分別用各介質(zhì)溶解并定容，配制成20%、50%、100%、120% 4個濃度的供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表2。氨基酸的回收率考察：取1/10平均片重輔料至100 mL容量瓶中，分別精密量取甘氨酸對照品儲備液、DL-蛋氨酸對照品儲備液各0.5 mL，置同一100 mL量瓶中，加各溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，平行3份，得5 %回收率樣品。取1/10平均片重輔料至20 mL容量瓶中，分別精密量取甘氨酸對照品儲備液、DL-蛋氨酸對照品儲備液各1 mL、各2 mL，分別置20 mL量瓶中，加各溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，平行3份，得50%、100%回收率樣品。按“2.1.2”項下色譜條件測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表1 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸在4種介質(zhì)中的線性方程

表2 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸回收率結(jié)果/%

2.4.5 重復(fù)性測定 甘草酸苷重復(fù)性考察：取供試品20片，精密稱定，計算平均片重，研磨，精密稱定1/10平均片重供試品至100 mL容量瓶中，分別加入4種介質(zhì)振搖并超聲15 min，稀釋并定容，得供試品溶液，平行制備6份，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算甘草酸苷含量的RSD，結(jié)果見表3，在4種介質(zhì)中甘草酸苷含量的RSD均小于2.00%，表明方法重復(fù)性良好。氨基酸重復(fù)性考察：取供試品20片，精密稱定，計算平均片重，研磨，精密稱定1/10平均片重供試品至100 mL容量瓶中，分別加入4種介質(zhì)振搖并超聲15 min，稀釋并定容，得供試品溶液，平行制備6份，按照“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算甘氨酸和DL-蛋氨酸含量，結(jié)果見表3，在4種介質(zhì)中甘氨酸和DL-蛋氨酸含量的RSD均小于2.00%，表明方法重復(fù)性良好。

表3 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸重復(fù)性結(jié)果/%

2.4.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、4、8、12、20、24、48 h各進(jìn)樣20 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算甘草酸苷含量的RSD，按照“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，計算甘氨酸和DL-蛋氨酸含量的RSD，結(jié)果見表4，在4種介質(zhì)中供試品溶液室溫放置48 h甘草酸苷含量、甘氨酸含量、DL-蛋氨酸含量與0時間相比無顯著變化，RSD均小于2.00%，表明供試品溶液室溫放置48 h穩(wěn)定。

表4 甘草酸苷、甘氨酸、DL-蛋氨酸穩(wěn)定性結(jié)果/%

2.5 復(fù)方甘草酸苷片溶出曲線測定采用漿法，轉(zhuǎn)速為50 r/min，隨機(jī)取復(fù)方甘草酸苷片12片，分別置于900 mL4種不同溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)，pH1.2的鹽酸溶液和pH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中分別在10、15、20、30、45、60、90、120 min取樣7 mL；pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液中和水介質(zhì)中分別在5、10、15、20、30、45、60 min取樣7 mL，同時在各取樣時間點(diǎn)補(bǔ)充同體積溶出介質(zhì)，經(jīng)濾膜相容性考察，選擇安譜-PEFE-水系0.22 μm濾膜過濾；按照、“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，繪制甘草酸苷在4種介質(zhì)中溶出曲線，結(jié)果見圖3；按照“2.1.2”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，繪制甘氨酸和DL-蛋氨酸在4種介質(zhì)中溶出曲線，甘氨酸溶出曲線結(jié)果見圖4，DL-蛋氨酸溶出曲線結(jié)果見圖5。

注：A為水介質(zhì)，B為pH1.2鹽酸溶液，C為pH 4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，D為pH6.8磷酸鹽緩沖液。

注：A為水介質(zhì)，B為pH1.2鹽酸溶液，C為pH 4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，D為pH6.8磷酸鹽緩沖液。

注：A為水介質(zhì)，B為pH1.2鹽酸溶液，C為pH 4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，D為pH6.8磷酸鹽緩沖液

3 討論

進(jìn)行固體制劑溶出曲線測定[8]，首先要建立藥物在溶出介質(zhì)中專屬性好和靈敏度高的含量測定方法，片劑溶出曲線測定的初始含量低，濾膜吸附對累積溶出百分率的影響不容忽視。濾膜的種類不同，對不同溶出介質(zhì)中主成分的吸附作用不同[9-10]，本試驗(yàn)對濾膜相容性進(jìn)行了考察?？疾炝送灰?guī)格安譜-PEFE-水系膜、島津-水系膜、安譜-聚醚砜-水系膜、希波氏-有機(jī)系膜4種不同的濾膜對甘草酸苷的吸附作用，結(jié)果表明希波氏-有機(jī)系對4種介質(zhì)中甘草酸苷吸附作用均比較明顯，3種水系膜對水介質(zhì)、pH4.0、pH6.8介質(zhì)中甘草酸苷幾乎無吸附作用，對pH1.2介質(zhì)中甘草酸苷具有不同程度的吸附作用，安譜-PEFE-水系膜對甘草酸苷的吸附作用最弱，因此本實(shí)驗(yàn)選擇使用安譜-PEFE-水系膜。

其次要考慮選擇轉(zhuǎn)籃法或漿法，溶出介質(zhì)的體積[11]、攪拌速度外[12]，還需要根據(jù)制劑本身的特性，考慮被測成分在不同介質(zhì)中的溶解度[13-14]、解離度等各種理化性質(zhì)及在不同介質(zhì)中的溶出行為，考察不同介質(zhì)配制方法及溶出行為等對累積溶出百分率的影響。本試驗(yàn)觀察到用檸檬酸鹽和醋酸鹽不同緩沖鹽配制pH4.0介質(zhì)測得的甘草酸苷累積溶出百分率明顯不同，分析原因是復(fù)方甘草酸苷片處方中含有碳酸鈣，碳酸鈣與酸性溶液發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生氣體，可克服甘草酸在酸性溶液中溶解后形成凝膠狀不易溶出的問題，有利于片劑迅速崩解溶出。檸檬酸酸性強(qiáng)于醋酸，與處方中碳酸鈣的反應(yīng)更劇烈，所以甘草酸苷在pH4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系中溶出快于pH4.0醋酸緩沖體系。另外緩沖溶液中離子強(qiáng)度也會影響片劑溶出度，離子強(qiáng)度越高溶出越快。影響離子強(qiáng)度的因素[15-16]有溶液中離子種類、離子的質(zhì)量摩爾濃度、離子所帶電荷，pH4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖緩沖溶液中離子種類較多、質(zhì)量摩爾濃度及所帶電荷也比較高，所以甘草酸苷的溶出更快。用pH4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液測得的溶出曲線與日本橙皮書網(wǎng)站公布的美能溶出曲線一致，因此，本實(shí)驗(yàn)采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖緩沖體系配制pH4.0介質(zhì)。

復(fù)方甘草酸苷片的參比制劑美能?為糖衣片，本實(shí)驗(yàn)測得3批美能?在4種介質(zhì)中溶出曲線顯示，糖衣片具有延遲釋放現(xiàn)象(即在前5～20 min溶出量小于10%，之后溶出量迅速提升)，以甘草酸苷為例，美能?糖衣片在pH1.2介質(zhì)、水介質(zhì)中的延遲釋放時間為10 min；在pH4.0介質(zhì)和pH6.8介質(zhì)中甘草酸苷的延遲釋放時間為15 min。結(jié)合溶出測定中觀察到的現(xiàn)象，糖衣片在溶出的過程中，首先糖衣層要經(jīng)過約10～15 min的溶蝕開裂后慢慢脫落，片芯中的主成分才能釋放出來，說明糖衣層是引起延遲釋放的主要原因。

國產(chǎn)仿制藥可在工藝上進(jìn)一步優(yōu)化與改進(jìn)，在片劑生產(chǎn)過程中混料、制粒、壓片、包衣等關(guān)鍵工藝過程進(jìn)行控制，并對其與溶出行為的關(guān)系進(jìn)行研究，在保證各主成分含量合格、制劑穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步保證批間溶出的均一性，全面提升仿制藥的質(zhì)量。