伏雪 涂敏 蔡海濱 張紅驥 于德才 曾霞

摘??要：細胞壁降解酶是諸多病原真菌的重要致病因子，其中木聚糖酶作為最重要的半纖維素酶，在絲狀真菌降解細胞壁侵染寄主的過程中占有重要作用。本研究以橡膠樹紅根病病原菌HD3為材料，采用RT-PCR克隆木聚糖酶編碼基因GpTR1774的基因序列，對其進行生物信息學(xué)分析；用HD3侵染橡膠樹熱研73397組培苗根部，電鏡觀測病原菌對根部細胞的侵染和破壞過程，并利用qRT-PCR方法測定不同侵染時間GpTR1774基因的表達量。結(jié)果表明：GpTR1774基因cDNA全長為780?bp，編碼259個氨基酸，其中含量最豐富的氨基酸為丙氨酸（Ala），占15.1%；預(yù)測蛋白分子量為28.12?kDa，脂肪系數(shù)為81.93，等電點為9.07，屬親水性蛋白，共有15個磷酸化位點，無信號和肽跨膜域，定位于細胞溶質(zhì)；α-螺旋和無規(guī)則卷曲是GpTR1774蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件，分別占氨基酸序列的38.10%和41.31%。系統(tǒng)進化樹分析顯示，GpTR1774基因與狹長孢靈芝木聚糖酶基因相似度最高，達87.5%。qRT-PCR顯示，木聚糖酶GpTR1774基因表達量整體趨勢為先上升后下降，侵染3?d和4?d表達量極顯著上升，4?d達到最高水平，約為侵染初始的16倍。本研究結(jié)果初步表明，木聚糖酶編碼基因GpTR1774很可能參與橡膠樹紅根病病原菌的致病過程，為橡膠樹紅根病的致病機理解析和綠色防控提供參考。

關(guān)鍵詞：熱研73397；紅根病病原菌；GpTR1774基因；侵染過程；qRT-PCR中圖分類號：S763.7??????文獻標(biāo)識碼：A

Cloning?and?Expression?Analysis?of?Xylanase?GpTR1774?Gene?from?Ganoderma?pseudoferreum

FU?Xue1，2，?TU?Min2*，?CAI?Haibin1，2，?ZHANG?Hongji1，?YU?Decai1*，?ZENG?Xia2

1.?Plant?Protection?College，?Yunnan?Agricultural?University，?Kunming，?Yunnan?650201，?China;?2.?Rubber?Research?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China

Abstract：?Cell?wall?degrading?enzymes?are?important?pathogenic?factors?of?many?pathogenic?fungi，?among?which?xylanase，?as?the?most?important?hemicellulase，?plays?an?important?role?in?the?process?of?host?cell?wall?degrading?by?filamentous?fungi?to?achieve?host?infection.?In?this?study，?RT-PCR?was?used?to?clone?the?coding?region?of?xylanase?GpTR1774?gene?of?Ganoderma?pseudoferreum?strain?HD3?and?analyze?its?bioinformatics.?The?root?of?Hevea?tissue?cultured?seedlings?Reyan?73397?were?infected?with?HD3，?meanwhile?infection?and?destruction?process?of?root?cells?were?observed?by?electron?microscopy.?The?gene?expression?of?GpTR1774?was?determined?by?qRT-PCR.?The?results?showed?that?the?total?length?of?GpTR1774?cDNA?was?780?bp，?encoding?259?amino?acids，?among?which?the?most?abundant?amino?acid?was?alanine?（Ala），?accounting?for?15.1%.?The?molecular?weight?of?GpTR1774?protein?was?28.12?kDa，?fat?coefficient?was?81.93，?and?the?isoelectric?point?was?9.07.?It?was?a?hydrophilic?protein?with?15?phosphorylation?sites，?no?signal?and?peptide?transmembrane?domain，?and?was?located?in?the?cell?solute.?The?main?components?of?the?secondary?structure?α-helix?and?random?curling?are?the?main?components?of?the?secondary?structure?of?GpTR1774?protein，?accounting?for?38.10%?and?41.31%?of?the?amino?acid?sequence，?respectively.Phylogenetic?analysis?showed?that?GpTR1774?gene?had?the?highest?similarity?with?xylanase?gene?of?Ganoderma?boninense，?reaching?87.5%.?qRT-PCR?showed?that?the?overall?gene?expression?trend?of?xylanase?GpTR1774?was?firstly?increased?and?then?decreased.?The?expression?level?of?GPTR1774?increased?significantly?on?the?3rd?and?4th?day?after?infection，?and?reached?the?highest?level?on?the?4th?day，?about?16?times?of?the?initial?level.?The?results?of?this?study?indicate?that?the?xylanase?GpTR1774?gene?was?likely?to?be?involved?in?the?pathogenesis?of?G.?psedoferreum，?providing?reference?for?the?pathogenesis?analysis?and?green?prevention?and?control?of?G.?psedoferreum.

Keywords：?Hevea?brasiliensis?Reyan?73397;?Ganoderma?pseudoferreum?（Wakef）?v.?Over.?et?Steinm;?GpTR1774;?infection?process;?qRT-PCR

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.011

橡膠樹（Hevea?brasiliensis）生產(chǎn)的天然橡膠是重要工業(yè)原料和戰(zhàn)略物質(zhì)，世界范圍內(nèi)共有8種根病為害，其中紅根病是我國植膠區(qū)發(fā)病面積最廣、嚴重度最高的土傳病害，發(fā)病嚴重的林段發(fā)病率可達40%，給我國橡膠產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失[1-2]。其病原菌為Ganoderma?pseudoferreum?（Wakef）?v.?Over.?et?Steinm，屬擔(dān)子菌，層菌綱，靈芝屬[3-4]，是一類木腐真菌。木腐真菌主要借助菌絲或菌絲體蔓延，菌絲端頭能分泌半纖維素降解酶類、纖維素降解酶類、木質(zhì)素降解酶類等，分解細胞壁組織中的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等，使長鏈大分子斷裂，損害植株組織結(jié)構(gòu)，削弱寄主生活力[5-7]。

植物細胞壁是病菌與寄主互作的重要場所，同時也是病原菌入侵、擴展的第一道防線[8]，多種植物病原真菌的重要致病因子主要是細胞壁降解酶，主要通過降解植物細胞壁以便病原菌侵入植物體內(nèi)[9]。木聚糖是半纖維素的主要組成成分，也是自然界中含量及其豐富的多糖，廣泛存在于植物組織的細胞壁中[10-13]。木聚糖酶是一類可降解木聚糖的酶系，主要來源有放線菌、細菌和真菌，它可以隨機切斷植物細胞壁木聚糖的β-1，4主鏈，可將木聚糖降解為木糖或低聚木糖[12，?14-15]。近些年，對木聚糖酶基因的分子生物學(xué)的研究快速展開，許多真菌木聚糖酶基因被克隆，而研究最多的是木霉、青霉、黑曲霉和棒曲霉等。KINOSHITA等[16]從黑曲霉中克隆得到編碼木聚糖酶B的基因xynNB，并在白曲霉中成功表達。AHMED等[17]綜述了真菌來源木聚糖酶的分子克隆。BAGEWADI等[18]從桔青霉HZN13菌株中克隆得到Xyl-Iib基因。周彩霞等[8]從梳棉狀嗜熱真菌克隆了2種木聚糖酶基因，分別是xyn11A和xyl43。XIE等[19]從鐮刀菌Q7-31中克隆得到對水稻細胞壁具有強降解能力的木聚糖酶基因Xyn8。JIANG等[20]和楊行等[21]在土壤中分離鑒定得到1株具有高木質(zhì)纖維素分解能力的嗜熱絲狀真菌毛殼霉CQ31，從中克隆得到對阿拉伯木聚糖具有較高酶活的GH11家族木聚糖酶基因CsXyn11B。

隨著研究的不斷深入，細胞壁降解酶基因的功能及致病機理被逐漸認識，但細胞壁降解酶基因在橡膠樹紅根病病原菌中研究卻未見報道，相關(guān)基因的克隆、表達分析等均需進行研究。本研究克隆得到1個橡膠樹紅根病病原菌的木聚糖酶編碼基因GpTR1774，通過分析其生物信息學(xué)和不同侵染時間基因表達變化，確定細胞壁降解酶是否為橡膠樹紅根病病原菌主要的致病生化因子，為橡膠樹紅根病的防控和抗紅根病育種奠定理論基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1??材料

橡膠樹紅根病病原菌菌株HD3由本課題組分離鑒定和保存，分離自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊感染紅根病的橡膠樹病根。接種材料為巴西橡膠樹無性系熱研73397組培苗，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所組培與轉(zhuǎn)基因育種課題組提供，苗高10～13?cm，根健壯，具一蓬葉。

1.2??方法

1.2.1??RNA提取和反轉(zhuǎn)錄??參照林仕凱等[22]的方法將橡膠樹紅根病病原菌HD3接種后的0、3、4、5、6、7、8、9、10?d菌絲進行收集，使用TIANGEN多糖多酚植物總RNA試劑盒提取總RNA，裂解液使用HL，利用北京全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。

1.2.2??木聚糖酶編碼基因GpTR1774基因克隆??通過本實驗室建立的橡膠樹紅根病病原菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選獲得木聚糖酶編碼基因序列。采用Primer?Premier?5.0軟件對橡膠樹紅根病病原菌木聚糖酶編碼GpTR1774設(shè)計相關(guān)引物（表1），參照柯萍萍[23]的方法選用18S?rRNA為內(nèi)參基因。以橡膠樹紅根病病原菌的cDNA為模板，利用PCR擴增木聚糖酶編碼基因GpTR1774的全長序列，對PCR產(chǎn)物目的條帶進行切膠回收，送往?？陂交蛏锛夹g(shù)有限公司測序。

1.2.3??木聚糖酶編碼基因GpTR1774生物信息學(xué)及進化分析??使用表2中的7類軟件進行木聚糖酶編碼基因GpTR1774的生物信息學(xué)和進化分析。

1.2.4??橡膠樹紅根病病原菌侵染根部觀察??參考涂敏等[24]的方法，將紅根病病原菌接種至橡膠樹組培苗根部，每個處理3個重復(fù)。分別在接種后的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10?d觀察、拍照。

1.2.5??木聚糖酶GpTR1774基因表達分析??刮取侵染3～10?d橡膠樹組培苗根部菌絲體，參照1.2.1和1.2.2的方法，提取不同侵染時間的紅根病病原菌的總RNA，選用橡膠樹紅根病病原菌18S?rRNA基因為內(nèi)參（表1）。采用qRT-PCR方法檢測木聚糖酶編碼基因GpTR1774基因相對表達量，反應(yīng)體系和程序參考孫茜茜等[25]的方法。

1.3??數(shù)據(jù)處理

通過2–ΔΔCT法計算木聚糖酶編碼基因GpTR 1774相對表達量，使用Excel軟件制圖。

2??結(jié)果與分析

2.1??木聚糖酶編碼基因GpTR1774的克隆分析

測序結(jié)果和凝膠電泳顯示，PCR克隆得到木聚糖酶編碼基因GpTR1774序列長度為780?bp?（圖1），編碼259個氨基酸（圖2），丙氨酸（Ala）的含量最豐富，占氨基酸總數(shù)的15.1%，木聚糖酶GpTR1774蛋白分子式C1259H1956N360O372S1，推導(dǎo)的氨基酸分子量為28.12?kDa，等電點為9.07，不穩(wěn)定系數(shù)為27.73，脂肪系數(shù)為81.93，正電荷殘基數(shù)為31，負電荷殘基數(shù)為28，總平均親水性–0.2000，木聚糖酶GpTR1774蛋白為親水性蛋白。

2.2??木聚糖酶編碼基因GpTR1774生物信息學(xué)分析

2.2.1??信號肽、亞細胞定位、跨膜區(qū)及磷酸化位點預(yù)測??利用生信軟件分析工具預(yù)測木聚糖酶GpTR1774蛋白存在信號肽的概率為0.0146（圖3A），沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，位于細胞溶質(zhì)中（圖3B）。

磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)木聚糖酶GpTR1774肽鏈中可能發(fā)生磷酸化，含有6個蘇氨酸磷酸化位點，7個絲氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點（圖3C）。

2.2.2??木聚糖酶GpTR1774蛋白保守結(jié)構(gòu)域及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測??生物信息學(xué)分析表明木聚糖酶GpTR1774在8～259氨基酸之間存在1個NADB保守結(jié)構(gòu)域（圖4A）。在木聚糖酶GpTR1774蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占38.10%，β-折疊占15.44%，β-轉(zhuǎn)角占4.63%，無規(guī)則卷曲占41.31%（圖4B）。由此可以看出，在GpTR1774蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲和α-螺旋所占比重較多，β-轉(zhuǎn)角占比較少，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是木聚糖酶GpTR1774蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件。其三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合（圖4C）。

2.3??木聚糖酶GpTR1774蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進化分析

通過對木聚糖酶GpTR1774進行氨基酸序列同源比對，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶GpTR1774氨基酸序列與靈芝屬參考序列的蛋白序列（LR_28215.1）相似度較高（圖5）。通過構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，可知橡膠樹紅根病病原菌木聚糖酶GpTR1774與引起油棕莖基腐病的狹長孢靈芝木聚糖酶親緣關(guān)系最近，相似度達87.5%；與茄根菌木聚糖酶的親緣關(guān)系最遠，相似度為11.2%（圖6）。

2.4??木聚糖酶編碼基因GpTR1774基因表達分析

2.4.1??紅根病病原菌侵染橡膠樹組培苗根部??將HD3菌株接種至橡膠樹組培苗根部后，第1天和第2天肉眼無法觀察到菌絲體在根部的侵染，至第3天可見菌絲體侵染至根表面（圖7），隨著侵染天數(shù)的增加，菌絲體逐漸迅速向上蔓延至整個根部（侵染10?d），菌絲平均侵染速度為2.1?mm/d。

2.4.2??橡膠樹紅根病病原菌木聚糖酶編碼基因GpTR1774基因表達分析??采用qRT-PCR分析紅根病病原菌侵染橡膠樹組培苗材料后木聚糖酶編碼基因GpTR1774相對表達量的變化。結(jié)果顯示，木聚糖酶編碼基因GpTR1774表達量整體趨勢為先上升后下降，侵染第3天和4天表達量極顯著上升，在第4天達到最高水平，為5.62，約為侵染初始（0?d）表達量的16倍（圖8）。

3??討論

紅根病是我國橡膠樹生產(chǎn)中最重要的土傳病害，而橡膠紅根病病原菌致病機理包括病原菌在根部的侵染進程、侵染中的關(guān)鍵基因等報道甚少。在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，通過利用橡膠樹組培苗進行試管內(nèi)無菌接種，可以觀察病原菌的侵染進程。孫明明等[26]研究大豆菌核病菌絲侵染過程，發(fā)現(xiàn)接種大豆菌核病的葉片及莖稈在取樣過程中需要有一定的發(fā)病區(qū)域，通過取樣觀察，選擇在接種后3?d發(fā)病區(qū)域內(nèi)可以滿足取樣操作。本研究接種后觀察發(fā)現(xiàn)，接種3?d后可肉眼觀察到少量菌絲體蔓延至橡膠樹根部，透射電鏡結(jié)果顯示3?d后根部表皮最外層細胞被破壞，多數(shù)表皮細胞中可見菌絲體。直接觀察和透射電鏡結(jié)果可知，第3天是紅根病病原菌穿透表層細胞壁，侵染橡膠樹根部的關(guān)鍵時間點。

真菌細胞壁降解酶基因與真菌的致病性密切相關(guān)，本研究從橡膠樹紅根病病原菌中克隆到一個木聚糖酶編碼基因GpTR1774，預(yù)測主要定位于細胞溶質(zhì)中且無跨膜結(jié)構(gòu)域。孫茜茜等[25]通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，GPFTR1蛋白編碼基因分別在橡膠紅根病病原菌受己唑醇和青蒿琥酯脅迫處理0、2、6、12、24、72?h，在處理6?h表達量最高，表明GPFTR1蛋白編碼基因早期上調(diào)顯著。孫佳寧等[27]發(fā)現(xiàn)木葡聚糖酶編碼基因CvXEG1在葡萄白腐病病原菌侵染早期大量表達。LU等[28]分析了木聚糖酶編碼基因RcXYN1-RcXYN9基因在侵染過程中接種后18、36、72、96、240?h的表達，接種稻瘟病菌后，RcXYN6和RcXYN7的轉(zhuǎn)錄水平在72、96、240?h時上調(diào)，在240?h時顯著上調(diào)。LAI等[29]和GARC?A等[30]從其他真菌病原

體中也觀察到一些木聚糖酶基因的早期表達。本研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶編碼基因GpTR1774在橡膠樹紅根病病原菌中表達，但表達量存在一定差異，早期大量表達，隨著侵染時間的增加，該基因表達水平先上升后下降，在侵染第3天和第4天基因表達量劇增，可以推測在第3天和第4天，紅不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。

根病病原菌分泌較多木聚糖酶，促進了根部細胞壁中半纖維素的降解。在后續(xù)研究中，可通過構(gòu)建木聚糖酶GpTR1774基因的基因敲除突變體，進一步研究木聚糖酶GpTR1774基因在橡膠樹紅根病病原菌致病過程中的功能，為橡膠樹紅根病病原菌的致病機理解析奠定基礎(chǔ)。

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