李和平 張樹河 林江波 鄒暉 戴藝民

摘??要：金線蓮（Anoectochilus?roburghii）是具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍稀瀕危蘭科藥用植物，高溫是制約其廣泛生產(chǎn)栽培的首要限制因子，選育耐熱品種是抵御高溫?zé)岷ψ罱?jīng)濟(jì)有效的措施之一。本研究利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)24份金線蓮種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并利用多元統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)其中20份樣本進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示：在遺傳系數(shù)0.602水平上，可以把金線蓮種質(zhì)分成I和II兩大類，I類分成A和B兩個(gè)亞群，臺(tái)灣金線蓮（TJ）與其他資源遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)歸為II類；A亞群中除了W來(lái)源于云南，其他均為福建西北部收集的資源；B亞群主要來(lái)自閩南地區(qū)和廣西。通過(guò)對(duì)20份金線蓮資源5個(gè)生理參數(shù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)熱處理后葉綠素含量和SOD活性明顯下降，相對(duì)電導(dǎo)率明顯升高，而丙二醛和可溶性蛋白含量熱處理后各資源表現(xiàn)不一。利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行耐熱性初步評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，TL、L1、A20、GZ1等4份資源較為耐熱，TJ、HX、L、M、A21等5份資源不耐熱。

關(guān)鍵詞：金線蓮；SCoT；遺傳多樣性；耐熱性中圖分類號(hào)：S567.239??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis?of?Genetic?Diversity?and?Evaluation?of?Heat?Resistance?of?Anoectochilus?roburghii

LI?Heping，?ZHANG?Shuhe，?LIN?Jiangbo，?ZOU?Hui，?DAI?Yimin*

Institute?of?Subtropical?Agriculture，?Fujian?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Zhangzhou，?Fujian?363005，?China

Abstract：?Anoectochilus?roburghii?is?a?rare?and?endangered?medicinal?orchid?with?high?economic?value.?High?temperature?is?the?primary?limiting?factor?for?its?extensive?production?and?cultivation.?Breeding?heat-resistant?varieties?is?one?of?the?most?economical?and?effective?measures?to?resist?heat?damage?caused?by?high?temperature.?In?this?study，?we?analyzed?the?genetic?diversity?of?24?A.?roburghii?germplasm?resources?by?Start?codon?targeted?polymorphism?（SCoT）?molecular?markers，?and?evaluated?the?heat?tolerance?of?20?samples?by?multivariate?statistical?analysis.?The?results?of?genetic?diversity?analysis?showed?that?at?the?genetic?coefficient?was?0.602，?A.?roburghii?germplasm?could?be?divided?into?two?groups：?I?and?II，?Group?I?was?divided?into?two?subgroups?A?and?B，?Anoectochilus?formosanus?was?classifiedd?into?Group?II?alone.?In?subgroup?A，?except?W?from?Yunnan，?all?the?other?resources?were?collected?in?the?north?and?west?of?Fujian.?Subgroup?B?mainly?came?from?Southern?Fujian?and?Guangxi.?The?cluster?diagram?showed?that?the?relatives?of?A.?roburghii?from?the?same?origin?was?close，?and?the?presence?or?absence?of?reticulated?veins?was?not?the?basis?for?the?classification.?Five?physiological?parameters?were?measured?in?the?20?samples.?It?was?found?that?the?chlorophyll?content?and?SOD?activity?decreased?obviously?after?heat?treatment，?and?the?relative?conductance?increased?obviously，?while?the?malondialdehyde?and?soluble?protein?contents?of?each?resource?were?different?after?heat?treatment.?The?preliminary?evaluation?of?heat?resistance?was?conducted?by?the?multivariate?statistical?analysis?method，?and?the?results?showed?that?four?resources?（TL，?L1，?A20，?GZ1）?were?heat?resistant，?while?five?resources?（TJ，?HX，?L，?M，?A21）?were?not.

Keywords：?Anoectochilus?roburghii?（Wall.）?Lindl;?Start?codon?targeted?polymorphism?（SCoT）;?genetic?diversity;?heat?resistance

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.015

金線蓮[Anoectochilus?roburghii?（Wall.）?Lindl]是蘭科開(kāi)唇蘭屬多年生常綠草本植物，產(chǎn)于中國(guó)、日本、斯里蘭卡、印度、尼泊爾及東南亞各國(guó)。開(kāi)唇蘭屬植物全世界有40余種，我國(guó)有20種，2個(gè)變種，其中部分種的全草在民間用以入藥，為珍貴的中藥材[1-3]。金線蓮來(lái)源廣泛，有些種外形較相似，且金線蓮葉片表面又存在從無(wú)金色網(wǎng)紋到有金色網(wǎng)紋的過(guò)渡類型[2]。因此，僅通過(guò)外形來(lái)鑒定金線蓮存在極大難度。鄭純等[4]曾做過(guò)福建金線蓮和廣西金線蓮的生藥鑒定，但用傳統(tǒng)的形態(tài)組織學(xué)無(wú)法區(qū)別二者遺傳上的差異。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)金線蓮資源進(jìn)行遺傳關(guān)系分析不僅可以排除生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)期的影響，還有助于雜交育種親本的選擇，為金線蓮資源優(yōu)良基因的發(fā)掘和利用提供參考。

金線蓮對(duì)生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，特別是對(duì)溫度較為敏感，適宜生長(zhǎng)溫度為20～25?℃，超過(guò)35?℃不適宜其生長(zhǎng)[5]。金線蓮人工種植主要集中在我國(guó)南方省區(qū)，夏季長(zhǎng)期高溫是普遍現(xiàn)象，而冬季低溫天數(shù)較少，夏季高溫是制約金線蓮廣泛生產(chǎn)栽培的首要限制因子，選育耐熱品種是抵御高溫?zé)岷ψ罱?jīng)濟(jì)有效的措施之一。目前，多元統(tǒng)計(jì)分析已在植物耐熱性評(píng)價(jià)中有較多應(yīng)用，如小麥耐熱性[6]、玉米耐熱性[7]和香蔥耐熱性[8]等，使用該方法獲得的耐熱性鑒定結(jié)果與品種在田間的耐熱表現(xiàn)基本一致，可有效地避免單一耐熱指標(biāo)的片面性與局限性，較全面地評(píng)價(jià)作物的耐熱性。本研究對(duì)收集的金線蓮資源在組織培養(yǎng)階段進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)，可以盡可能地確保樣本生長(zhǎng)環(huán)境和個(gè)體大小的一致性，并縮短優(yōu)異種質(zhì)的篩選時(shí)間。

1??材料與方法

1.1??材料

分子標(biāo)記使用材料：24份金線蓮資源取自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所組培室培養(yǎng)的金線蓮組培苗，采集各樣品的正常葉片，裝入編號(hào)袋，在–80?℃冰箱中保藏備用。

試驗(yàn)?zāi)蜔嵝陨韰?shù)測(cè)定材料：由于4份金線蓮資源是新收集資源，樣品量不足，且田間種植各資源同一時(shí)間采樣時(shí)長(zhǎng)勢(shì)不一致，個(gè)體大小存在較大差異，因此取20份金線蓮資源組培苗進(jìn)行相關(guān)生理參數(shù)測(cè)定與分析。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的金線蓮，利用恒溫光照培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度35?℃、相對(duì)濕度70%、光照4000～5000?lx、每天光照時(shí)間12?h等條件，培養(yǎng)時(shí)間5?d，然后全株采樣，混合后分成3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

試劑：2×PCR?Mix購(gòu)自北京聚合美生物技術(shù)有限公司，CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、RNase?A、瓊脂糖、引物等分子生物學(xué)使用試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他生理參數(shù)測(cè)定試劑購(gòu)自漳州市騰信化玻儀器有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2??方法

1.2.1??SCoT分析??使用CTAB法提取金線蓮葉片基因組DNA，挑選12條多態(tài)性較好的SCoT引物（表2）對(duì)24份供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為（20??L）：2×PCR?Mix?10??L，DNA?50?ng模板，10??mol/L引物1.5??L。反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性3?min；94?℃變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，循環(huán)35次；72?℃終延伸5?min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照保存。

SCoT數(shù)據(jù)分析：根據(jù)電泳圖結(jié)果，對(duì)擴(kuò)增清晰且易于辨認(rèn)的條帶采用0-1系統(tǒng)記錄其位置，在同一遷移位置，有條帶（強(qiáng)帶或清晰弱帶）記為“1”，無(wú)條帶記為“0”。并建立分子數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS-pc2.1軟件分析，計(jì)算遺傳相似系數(shù)并按UPGMA方法聚類分析。

1.2.2??生理參數(shù)測(cè)定??參照李合生[9]的方法測(cè)定金線蓮葉片中葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白含量。

1.3??數(shù)據(jù)處理

采用WPS?Office?Excel軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理和簡(jiǎn)單分析；采用SPSS?17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析。

公式如下：

如果指標(biāo)與耐熱性呈正相關(guān)（葉綠素、SOD活性、可溶性蛋白、脯氨酸）：

隸屬函數(shù)值U（Xj）=（Xj－Xmin）/

（Xmax－Xmin） （1）

如果指標(biāo)與耐熱性呈負(fù)相關(guān)（相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛）：

隸屬函數(shù)值U（Xj）=1－（Xj－Xmin）/

（Xmax－Xmin） （2）

式中，j=1，2……n，Xj表示第j個(gè)指標(biāo)；Xmin表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值；Xmax表示第j個(gè)指標(biāo)的最大值；權(quán)重（W）和綜合評(píng)價(jià)值（D）計(jì)算公式參見(jiàn)湯佳樂(lè)等[10]的方法。

2??結(jié)果與分析

2.1??收集保持金線蓮資源描述

從福建省內(nèi)外收集24份金線蓮資源，于實(shí)驗(yàn)室離體保存和大棚種植，大棚種植4個(gè)月后，對(duì)正常金線蓮植株進(jìn)行拍照（圖1）和形態(tài)學(xué)描述（表1）。本研究選用穩(wěn)定性較好的葉脈、葉片上表面顏色和葉片長(zhǎng)寬比3個(gè)指標(biāo)來(lái)描述金線蓮形態(tài)學(xué)特征。形態(tài)學(xué)特征參考中國(guó)植物志，初步將葉脈分為金色、白色及無(wú)變色葉脈，葉片形狀按長(zhǎng)寬比區(qū)分，葉表面分為紫紅、黃色及綠色。結(jié)果可以看出大多數(shù)金線蓮資源有金色葉脈，少量資源無(wú)葉脈，只有臺(tái)灣金線蓮葉脈為白色，葉片長(zhǎng)寬比最大的是資源B，比值達(dá)到1.45，葉片為卵形，而葉片長(zhǎng)寬比最小的是資源M，比值達(dá)到0.98，葉片為卵圓形。

2.2??金線蓮資源遺傳多樣性分析

從40條SCoT引物中挑選12條多態(tài)性較好、條帶清晰且穩(wěn)定的引物，引物擴(kuò)增條帶多態(tài)率見(jiàn)表2，其中引物SCoT9的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖2。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建金線蓮種質(zhì)資源的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)在遺傳系數(shù)0.602的水平上，可以把金線蓮種質(zhì)分成兩大類：I類和II類，其中I?圖中字母代碼表示不同來(lái)源，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

類分成A和B兩個(gè)亞類群，臺(tái)灣金線蓮遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)歸為一類。A亞群中除了W來(lái)源于云南，其他均為福建西北部收集的資源，W與HJ和N關(guān)系較近；從聚類圖中可以看出，同來(lái)源地的金線蓮親緣關(guān)系較近，且有無(wú)網(wǎng)狀葉脈不作為金線蓮分類依據(jù)，如M和M1，TL和TL1，L和L1，GZ1和GZ2。B亞群主要來(lái)自閩南地區(qū)和廣西，其中大部分是來(lái)自福建長(zhǎng)泰和廈門，圖中顯示C和HX親緣關(guān)系較近（HX來(lái)源于C自交種子繁殖），這說(shuō)明SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在金線蓮親緣關(guān)系鑒定方面是可以使用的較好的標(biāo)記方法。

2.3??金線蓮各單項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果分析

由表3可知，熱處理后所有資源葉綠素含量均有降低，其中降幅最大的是HX、TJ和H，降幅不明顯的是C、G和M1；相對(duì)電導(dǎo)率均有升高，其中漲幅最大的是M1、TJ和W，漲幅最不明顯的是HJ、N和GZ1；丙二醛含量熱處理后各資源變異明顯，其中漲幅最大的是L、W和C，降幅最大的是M、GZ2和N；熱處理后金線蓮資源SOD活性降低，降幅最大的是GZ1、A20和W，降幅較少的是K、HX和TJ；可溶性蛋白含量熱處理前后各資源表現(xiàn)不一，其中漲幅最大的是A20、TL和GZ1，降幅最大的是A21、M和TJ。

2.4??耐熱性綜合評(píng)價(jià)

利用SPSS?17.0軟件對(duì)5個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)的耐熱系數(shù)進(jìn)行主成分分析（表4），按初始特征值大于1確定主成分個(gè)數(shù)為3個(gè)，前3個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為0.316、0.253、0.209，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)0.778，表明前3個(gè)綜合指標(biāo)反映了原指標(biāo)的絕大部分信息，可以代替原來(lái)的5個(gè)生理指標(biāo)，其余可以忽略不計(jì)。根據(jù)主成分分析的表達(dá)式和公式求出每個(gè)金線蓮種質(zhì)材料的所有綜合指標(biāo)值CI（x）和隸屬函數(shù)值U（x），詳見(jiàn)表5。用公式計(jì)算各個(gè)種類的綜合耐熱能力的大小，根據(jù)D值（表5）對(duì)其耐熱性進(jìn)行強(qiáng)弱排序。其中TL的D值最大，表明其耐熱性最強(qiáng)；其次為L(zhǎng)1，臺(tái)灣金線蓮TJ的D值最小，表明臺(tái)灣金線蓮TJ的耐熱性最差。采用最大距離法對(duì)D值進(jìn)行聚類分析，可將20個(gè)金線蓮種質(zhì)材料劃分為3類?：TL、L1、A20、GZ1為Ⅰ類，D值大于0.6，屬耐熱類型；F、K、N、C、G、H、W、HJ、GZ2、M1、Y作為Ⅱ類，D值大于0.4小于0.6，屬中度耐熱類型；其余5個(gè)金線蓮種質(zhì)D值小于0.4，屬不耐熱類型。

3??討論

本研究挑選12條SCoT引物從24份金線蓮資源中獲得70條清晰的多態(tài)性條帶，根據(jù)個(gè)體間UPGMA聚類分析，發(fā)現(xiàn)福建、廣西和云南收集的資源未依據(jù)地理差異單獨(dú)聚類，體現(xiàn)了不同地區(qū)個(gè)體遺傳差異與地理距離的相關(guān)性較小，而臺(tái)灣金線蓮與國(guó)內(nèi)收集的金線蓮資源遺傳距離較遠(yuǎn)，被聚類在最外層。秦朋[11]、葉煒等[12]的研究結(jié)果同樣顯示福建、廣西和云南金線蓮種質(zhì)資源間親緣關(guān)系較近，臺(tái)灣金線蓮與國(guó)內(nèi)金線蓮遺傳距離較遠(yuǎn)的現(xiàn)象。此外，民間將無(wú)線類型金線蓮稱為公、有線類型金線蓮稱為母，鄭純等[4]發(fā)現(xiàn)有線與無(wú)線金線蓮種質(zhì)在顯微及理化分析方面存在一致性，認(rèn)為二者是同種植物，而胡珊梅等[13]通過(guò)RAPD分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)二者存在較大差異，建議分別獨(dú)立成種。本研究中，有線和無(wú)線類型金線蓮是與相同來(lái)源地的不同單株聚類在進(jìn)化樹末端，表明有線與無(wú)線的金線蓮基因型較為相似，是同種植物，此結(jié)果與鄭純等研究結(jié)果一致。

高溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要非生物因子，當(dāng)溫度高于植物正常生長(zhǎng)溫度時(shí)，植物就會(huì)產(chǎn)生熱激反應(yīng)，產(chǎn)生各種生理生化變化，如改變細(xì)胞穩(wěn)定性，改變激素和次級(jí)代謝物的合成，甚至死亡[14-15]。通過(guò)對(duì)種質(zhì)材料的耐熱性進(jìn)行篩選、鑒定和評(píng)級(jí)歸類，可以為耐熱性育種提供優(yōu)異的種質(zhì)材料。目前，我國(guó)在金線蓮品種耐熱性鑒定及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)方面尚未規(guī)范統(tǒng)一，缺乏可操作性。鑒定指標(biāo)的合理選擇是耐逆性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。前人關(guān)于冬瓜幼苗[16]、灌漿期小麥[6]、棉花苗期[17]等從生理機(jī)制角度對(duì)植物耐逆性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，為金線蓮耐熱性鑒定提供了參考指標(biāo)。由于種質(zhì)資源間的差異，金線蓮生長(zhǎng)緩慢、開(kāi)花結(jié)果難，形態(tài)學(xué)性狀測(cè)量過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)耗力。因此，本研究從生理機(jī)制角度對(duì)其耐熱性進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、SOD活性和可溶性蛋白含量5個(gè)生理生化指標(biāo)，通過(guò)主成分分析將眾多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個(gè)綜合指標(biāo)，在主成分得分的基礎(chǔ)上利用模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算綜合評(píng)價(jià)D值，依據(jù)D值判斷耐高溫能力的強(qiáng)弱，從中篩選了4份耐熱種質(zhì)材料。本研究在金線蓮中對(duì)其耐熱性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，篩選出的耐熱資源將為耐熱金線蓮品種選育提供參考。

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