龍憲偉 劉 洪 菅志遠

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院1 胃腸外科，2 肝膽外科，廣西桂林市 541001)

胰腺導管腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升的趨勢[1-2]。胰腺導管腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多基因共同參與的過程[3]，目前其分子機制尚未完全清楚。近年來，隨著生物信息技術的快速發(fā)展，有研究表明多種基因的差異表達與胰腺導管腺癌密切相關[4]。程序性細胞死亡分子(programmed cell death,PDCD)10位于3號染色體(3q26.1)上，由212個氨基酸組成[5]。研究表明，PDCD10基因的差異表達與多種疾病的病理生理過程密切相關，包括肝癌[6]、膠質(zhì)母細胞瘤[7]、卵巢癌[8]、腦血管疾病[9-10]、肺癌[11]、胃癌[12]等。但目前關于PDCD10基因在胰腺導管腺癌中的作用機制尚未完全明確。本文通過生物信息學方法分析PDCD10基因在胰腺導管腺癌患者中的表達水平及其與患者預后的相關性，旨在為胰腺導管腺癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫的信息，用于差異表達分析、輪廓圖繪制、患者生存分析、相似基因檢測的在線工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織和正常胰腺組織中表達水平的差異，以及與胰腺導管腺癌患者預后的關系。

1.1.1 PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織和正常胰腺組織中的表達差異分析：選擇“Expression Analysis”中的“Expression DIY”，再選擇“Box Plot”，然后在“Gene”中輸入PDCD10，在“|log2FC|Cutoff”中輸入2，在“p-value Cutoff”中輸入0.001，設定“Cancer name”為“PAAD”，選擇“Match TCGA normal and GTEx data”，其他為默認選項。

1.1.2 PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌患者預后之間的關系分析：選擇“Expression Analysis”中的“Survival Analysis”。分析總體生存率時，在“Gene”中輸入PDCD10，設定“Methods”為“Overall Survival”在“Cutoff-High(%)”和“Cutoff-Low(%)”中均輸入50，設定“Cancer name”為“PAAD”，設定“Axis Units”為“Months”，其他為默認選項。分析無病生存率時，設定 “Methods”為“Disease Free Survival(RFS)”，其他參數(shù)同上。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)是主要基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關癌癥數(shù)據(jù)進行分析的在線工具，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的甲基化水平。設定“Enter gene symbol(s)”為PDCD10，選擇“TCGA”為“dataset Pancreatic Adenocarcinoma”，再選擇“Methylation”。

1.3 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org)是一個多組學數(shù)據(jù)庫，本研究利用其分析PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的共表達基因，并對共表達基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。

1.3.1 PDCD10基因在胰腺導管腺癌病灶組織中的共表達基因分析：在LinkFinder模塊中，設定“Select cancer cohort”為“PAAD”，設定“Select search dataset:Data type”為“RNA seq”， 在“Select sample dataset”中輸入No input， 在“Select search dataset attribute”中輸入PDCD10，設定“Select target dataset:Data type”為“RNAseq”選擇“Select statistical method”為“Pearson Correlation test”。

1.3.2 PDCD10基因的富集分析：選擇“Select LinkInterpreter”，設定“Select tool”為“Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)”，選擇“Enrichment Analysis”為“GO Analysis or KEGG”，然后點擊“Select Submit Query”。

1.4 STRING網(wǎng)站分析 通過STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)構建PDCD10基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡圖，設定“protein name”為PDCD10，“Organism”為Homo sapiens。

1.5 TIMER數(shù)據(jù)庫分析 在TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)，設定“Gene Expression”為PDCD10，分析PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌細胞純度、各類型免疫細胞(CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞)浸潤水平的相關性。

2 結(jié) 果

2.1 PDCD10基因在胰腺導管腺癌病灶組織和正常胰腺組織中的表達差異 GEPIA數(shù)據(jù)庫的泛癌分析及PDCD10基因表達情況箱式圖提示PDCD10在胰腺導管腺癌組織中呈高表達水平， PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于正常胰腺組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 PDCD10基因在胰腺導管腺癌病灶組織和正常胰腺組織中的表達差異

2.2 PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌患者預后的關系 病灶組織中PDCD10基因低表達水平的胰腺導管腺癌患者的總體生存率及無病生存率均高于病灶組織中PDCD10基因高表達水平的患者(均P<0.05)。見圖2。

圖2 病灶組織中不同PDCD10基因表達水平的胰腺導管腺癌患者的生存曲線

2.3 PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的甲基化水平 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的甲基化水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的甲基化水平

2.4 胰腺導管腺癌組織中PDCD10基因的共表達基因、功能及通路富集分析結(jié)果 在胰腺導管腺癌組織中，共有19 774個基因與PDCD10基因具有相關性，即共表達(見圖4A)，與PDCD10基因呈正相關和負相關的前50個基因的熱圖見圖4B、圖4C。進一步對與PDCD10共表達的基因進行KEGG分析和GO富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示：與PDCD10基因共表達的基因的分子功能以細胞黏附分子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、細胞外基質(zhì)結(jié)構成分、谷氨酸受體結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、谷氨酸受體活性等為主；生物學過程以染色體分離、染色體定位、皮膚發(fā)育、ERBB信號通路、白細胞凋亡過程、GABA能神經(jīng)肌肉過程、多細胞生物信號傳導、突觸傳遞、谷氨酸受體信號通路等為主；細胞組成以濃縮染色體、脫氧核糖核酸損傷部位、參與細胞黏附的蛋白質(zhì)復合物等為主。KEGG通路分析結(jié)果顯示：與PDCD10基因共表達的基因主要涉及免疫調(diào)節(jié)反應信號通路、ERBB信號通路、谷氨酸受體信號通路。見圖5。

圖4 在胰腺癌中與PDCD10基因具有相關性的基因火山圖及正負相關基因熱圖

圖5 與PDCD10基因共表達的基因的GO功能和KEGG通路富集分析

2.5 PDCD10基因的PPI網(wǎng)絡 在PPI網(wǎng)絡中，與PDCD10基因編碼蛋白相互作用的主要蛋白有STRN4、SLMAP、STRIP1、STK24、SIKE1、STRN、FGFR1OP2、CCM2、MST4、STK25等(Degree值均>0.4)。見圖6。

圖6 PDCD10基因的PPI網(wǎng)絡圖

2.6 PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌細胞純度、各類型免疫細胞浸潤水平的相關性 PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌細胞純度無相關性(r=-0.026，P=0.734)，與CD4+T淋巴細胞浸潤水平呈負相關(r=-0.186，P=0.015)，與CD8+T淋巴細胞(r=0.362，P<0.001)、B淋巴細胞(r=0.334，P<0.001)、中性粒細胞(r=0.364，P<0.001)、巨噬細胞(r=0.232，P<0.001)、樹突狀細胞(r=0.392，P<0.001)浸潤水平均呈正相關。見圖7。

圖7 PDCD10基因表達水平與胰腺導管腺癌細胞純度、各類型免疫細胞浸潤水平的相關性

3 討 論

胰腺癌是一種具有高度侵襲性且致死率較高的消化道腫瘤，其中以胰腺導管腺癌最為常見。研究表明，胰腺癌患者的5年生存率不足8%，我國過去10年中胰腺癌導致的死亡病例在癌癥相關死亡病例中占比增加了9%[13]。由于目前缺乏早期診斷胰腺癌的實驗室指標，大多數(shù)患者就診時腫瘤已處于晚期，治療手段有限，且效果未達理想狀態(tài)，患者的復發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高[14-16]。因此，亟待進一步明確胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，以探尋更為有效的診斷和治療手段。

PDCD基因家族成員高度保守，除了與細胞程序性死亡有關，還與發(fā)育障礙、免疫疾病、癌癥等有關[17]。PDCD10基因最初被確定為凋亡相關基因[18]。研究表明，PDCD10廣泛表達于各種類型細胞，如星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞等，在許多生理和病理生理過程中起著重要作用，包括細胞周期調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生[19-20]、化療耐藥[21]和神經(jīng)元細胞遷移[22-23]等。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)細胞瘤中過表達PDCD10會招募和激活小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞，從而促進腫瘤進展。Fu等[24]發(fā)現(xiàn)，PDCD10與前列腺癌細胞增殖、遷移有關。由此可見，PDCD10與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

本文運用生物信息學方法對胰腺導管腺癌的多個數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行分析。應用 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于正常胰腺組織，病灶組織中PDCD10基因低表達水平的胰腺導管腺癌患者的總體生存率及無病生存率高于病灶組織中PDCD10基因高表達水平的患者(均P<0.05)，這表明 PDCD10基因可能是胰腺導管腺癌診斷及預后評估的潛在分子標志物。為了解PDCD10基因在胰腺導管腺癌中的調(diào)控機制，本研究基于LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對與PDCD10基因共表達的基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，與PDCD10基因共表達的基因主要參與染色體分離及定位、皮膚發(fā)育、多細胞生物信號轉(zhuǎn)導、突觸傳遞、GABA能神經(jīng)肌肉過程等；KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，與PDCD10基因共表達的基因主要通過免疫調(diào)節(jié)反應信號通路、ERBB信號通路、谷氨酸受體信號通路參與胰腺癌的發(fā)生。因此推測PDCD10基因可能通過上述生物學過程及信號通路來介導胰腺導管腺癌的發(fā)生和發(fā)展。甲基化是表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容，基因的甲基化水平是評價惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要標志物[25]。本研究結(jié)果顯示，PDCD10基因在胰腺導管腺癌病灶組織中的甲基化水平升高(P<0.05)，這提示胰腺導管腺癌的發(fā)生和發(fā)展有可能受PDCD10基因甲基化水平的影響，但具體調(diào)控機制仍需進一步證實。

腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境密切相關，免疫微環(huán)境影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[26]。CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞具有顯著的抗腫瘤作用[27]。本研究結(jié)果顯示，PDCD10基因表達水平與CD4+T淋巴細胞浸潤水平呈負相關，與CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞浸潤水平均呈正相關(均P<0.05)，這或可為研究胰腺導管腺癌患者的免疫治療提供新思路。此外，本研究的PPI網(wǎng)絡結(jié)果顯示，PDCD10基因編碼的蛋白具有較多的相互作用蛋白，PDCD10基因編碼的蛋白可能與這些蛋白相互作用參與胰腺導管腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，PDCD10基因在胰腺導管腺癌組織中呈高表達，其表達水平與胰腺導管腺癌患者的生存預后密切相關，胰腺導管腺癌的發(fā)生和發(fā)展可能與PDCD10基因甲基化水平有關。PDCD10基因或可成為胰腺導管腺癌診斷及預后評估的潛在分子標志物，這為胰腺導管腺癌的免疫治療提供一定的理論基礎。