陳媛媛，唐曉寧?，崔 帥，馬 浩，孫佳慧

1) 昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，昆明 650500 2) 云南工商學(xué)院，昆明 651701

隨著自然環(huán)境保護(hù)力度的加大以及人們健康安全意識(shí)的提高，生活中抗菌劑的使用越來越廣泛，對(duì)于抗菌材料的設(shè)計(jì)研發(fā)以及抗菌機(jī)理的分析研究也在不斷地取得進(jìn)展.按照作用活性成分不同，抗菌劑分為有機(jī)、無機(jī)以及有機(jī)無機(jī)復(fù)合型三類抗菌劑.相較于有機(jī)抗菌劑中的陽離子吸附型殺菌[1]和無機(jī)抗菌劑中的直接接觸型殺菌以及離子滲透型殺菌[2]，活性氧抗菌由于具有高效持久、良好的生物相容性和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視，其涉及的領(lǐng)域包括生物醫(yī)學(xué)[3]、遺傳學(xué)[4]及環(huán)境保護(hù)[5]等.活性氧主要來源于催化材料受光激發(fā)的表面高活性反應(yīng)區(qū)域[6-7]，是催化反應(yīng)過程中光生電子/空穴與O2和H2O 之間的氧化還原反應(yīng)中間產(chǎn)物，具有較高的反應(yīng)活性.其抗菌過程實(shí)質(zhì)是活性氧與生物分子內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)之間不平衡而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[8]，例如活性氧與細(xì)胞膜局部反應(yīng)造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，增強(qiáng)了膜滲透性而引起胞內(nèi)物質(zhì)泄露；也可以使DNA 鍵斷裂而破壞基因表達(dá)，以及引發(fā)功能蛋白失活等結(jié)果[9-10]，最終導(dǎo)致了細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制和死亡.近期的主要研究已經(jīng)表明[10-12]，不同構(gòu)造的催化材料對(duì)于活性氧的產(chǎn)量和種類具有顯著影響，不同種類的活性氧在穩(wěn)定性和抗菌表現(xiàn)上也有明顯的區(qū)別，值得認(rèn)真分析討論.因此本文從活性氧的產(chǎn)生方式、化學(xué)作用以及抗菌機(jī)理等方面進(jìn)行總結(jié)，尤其介紹了主要活性氧物種之間的轉(zhuǎn)化過程以及抗菌過程中常用的檢測(cè)分析方法，希望能對(duì)活性氧抗菌機(jī)理的分析和光催化材料的設(shè)計(jì)提供幫助.

1 活性氧

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是由光催化材料表面上的光生電子（e-）和空穴（h+）這一類具有高能量的載流子與含氧分子反應(yīng)所生成的氧化還原產(chǎn)物，具有較高的反應(yīng)活性[2,10,12].主要的活性氧種類包括以下4 種，分別是超氧陰離子自由基（）、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）和羥基自由基（·OH）.除了這四種主要的ROS，還有臭氧（O3）和脂類過氧化RO·（烷氧基）、ROO·（烷過氧基）、ROOH·（氫過氧化物）[13]等，其中脂類過氧化物是由亞油酸等不飽和脂肪酸被或·OH 氧化形成.若以氧化還原電勢(shì)（將0.00 V 的標(biāo)準(zhǔn)氫電極參考電勢(shì)作為標(biāo)準(zhǔn)還原電勢(shì)）來具體度量ROS獲取電子并被還原的能力，則電位越強(qiáng)，ROS 對(duì)電子的親和力越大，氧化性越強(qiáng)[10]，因此電極電位是決定反應(yīng)能否發(fā)生的關(guān)鍵因素之一.表1 列出了活性氧半反應(yīng)及其已知的氧化還原電位[14]以供參考.在生物代謝過程中，正常濃度的ROS 可作為信號(hào)分子[8]介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳輸，調(diào)控生命活動(dòng)或參與細(xì)胞內(nèi)功能性物質(zhì)的氧化修飾[15].然而，在特殊環(huán)境下（例如，電離輻射），ROS 水平會(huì)急劇增加，引起氧化應(yīng)激[8,10]而導(dǎo)致細(xì)胞死亡.同時(shí)ROS對(duì)有機(jī)污染物也具有降解除污的能力[6,16]，具備高效環(huán)保的特點(diǎn).在當(dāng)今綠色環(huán)保的時(shí)代背景下，ROS作為抗菌去污雙效活性成分，在廢水處理、大氣污染治理、醫(yī)療保健以及食品安全等領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景[5,16-17].當(dāng)前的研究表明，ROS 作為重要的化學(xué)反應(yīng)中間體[10]，其鑒定分析、作用機(jī)制和動(dòng)力學(xué)評(píng)估[18]都非常重要.目前檢測(cè)ROS 的手段還無法完全消除雜質(zhì)的影響，不同種類ROS對(duì)細(xì)胞具體作用方面還存在機(jī)理不明確之處.結(jié)合新技術(shù)，利用生物分子學(xué)理論，以ROS 的生成鏈及多種ROS 動(dòng)態(tài)平衡的體系為分析基礎(chǔ)，對(duì)其抗菌機(jī)理的認(rèn)知可以得到更細(xì)致的補(bǔ)充完善.

表1 相關(guān)分子和活性物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位Table 1 Standard redox potential of related molecules and active substances

2 光催化抗菌材料中ROS 的產(chǎn)生

光催化材料表面活性位點(diǎn)區(qū)域能夠捕獲O2和H2O 分子，經(jīng)過催化氧化可以產(chǎn)生足夠數(shù)量的ROS[10,12]，這是光催化材料抗菌過程中ROS 主要的產(chǎn)生來源.另外，生物體內(nèi)本身也會(huì)產(chǎn)生少量ROS，例如真核細(xì)胞中線粒體的能量轉(zhuǎn)化，人體內(nèi)吞噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答等[19].在生理濃度下，ROS 在細(xì)胞內(nèi)作為信使[20]有效調(diào)節(jié)信號(hào)通路或?qū)垢腥?，但過量ROS 產(chǎn)生會(huì)使細(xì)胞抗氧化防御活性不足，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡[8]，此結(jié)果即為氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成細(xì)胞生理功能紊亂使細(xì)菌死亡.

2.1 光催化抗菌材料

光催化抗菌材料按成分不同將其劃分為有機(jī)光催化材料、無機(jī)光催化材料和有機(jī)無機(jī)復(fù)合光催化材料三大類，其中有機(jī)光催化抗菌材料一般通過電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生ROS[12]，即自身（1PS）形成三重電子激發(fā)態(tài)（3PS*）.3PS*通過電子或氫原子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成、H2O2和·OH 等ROS，或通過能量轉(zhuǎn)移到分子氧（3O2）產(chǎn)生1O2，例如金屬有機(jī)骨架材料（MOFs）[21]和共價(jià)有機(jī)骨架材料（COFs）[22].有機(jī)光催化抗菌材料具有特殊的生物靶向功能，生效快、能力強(qiáng)，但抗菌有效期短、熱穩(wěn)定性差且安全性[23]需進(jìn)一步探索研究.目前所報(bào)道的無機(jī)光催化抗菌材料是以Ti、Zn、Cu、Bi、W、Mo、In 為主的氧化物和硫化物及其多元金屬?gòu)?fù)合材料，均屬于半導(dǎo)體光催化材料.按材料所含載流子濃度的差異分為p 型半導(dǎo)體和n 型半導(dǎo)體，n 型半導(dǎo)體中自由電子濃度遠(yuǎn)大于空穴的濃度，如TiO2[6,9,24]、BiVO4[16,25]和ZnO[26-27]，反之為n 型半導(dǎo)體，如CuO[28-29]和Cu2O[30]等.無機(jī)光催化抗菌材料成本低、效果顯著、有效期長(zhǎng)且無耐藥性[2]，但是單一成分的無機(jī)光催化抗菌材料也存在諸多問題，如可見光區(qū)域的窄吸收、帶隙能高、光生載流子分離效率低及復(fù)合率高，使其光催化活性受到影響[18]，因此選取合適帶隙能值的半導(dǎo)體材料用以構(gòu)造異質(zhì)結(jié)[6,27]，合成復(fù)合材料成為提高無機(jī)抗菌材料光催化活性的有效手段之一.

如圖1 所示，光催化劑異質(zhì)結(jié)構(gòu)一般分為三大類：p-n 型、肖特基結(jié)和Z 型異質(zhì)結(jié)構(gòu)[31].簡(jiǎn)而言之，p-n 型異質(zhì)結(jié)包括兩種機(jī)制，分別為I 型（圖1 (a)）和Ⅱ型（圖1 (b)），I 型異質(zhì)結(jié)因其光催化效果不佳已被II 型異質(zhì)結(jié)所取代，II 型異質(zhì)結(jié)利用兩材料之間的能級(jí)差分離光生電荷，抑制它們之間的重組；肖特基結(jié)（圖1 (c)）是半導(dǎo)體-金屬接觸結(jié)構(gòu)，可以有效地減少電荷載流子的重組，促進(jìn)材料對(duì)光的吸收.最后，Z 型異質(zhì)結(jié)的電荷轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（圖1 (d)）是由光催化還原系統(tǒng)、光催化氧化系統(tǒng)以及中間電子傳遞體組成[31]，通過氧化還原介質(zhì)或固態(tài)電子介質(zhì)捕獲并犧牲兩半導(dǎo)體之間的少量載流子，以獲得大量具有高氧化/還原電位的電荷載體.與傳統(tǒng)的光催化劑相比，Z 型異質(zhì)結(jié)光催化劑的電荷載流子遷移路徑更短，載流子分離效率更高，氧化還原能力更強(qiáng)[32]，因此Z 型異質(zhì)結(jié)機(jī)制被研究者認(rèn)為是高效光催化應(yīng)用中最富有價(jià)值的研究策略.無機(jī)光催化材料的抗菌機(jī)制基礎(chǔ)來自于活性物質(zhì)ROS[33]，所以本文以下部分主要討論無機(jī)光催化材料中ROS 的產(chǎn)生機(jī)制.

圖1 異質(zhì)結(jié)中載流子遷移途徑.(a) Ⅰ型;(b) Ⅱ型;(c) 肖特基結(jié);(d) Z 型異質(zhì)結(jié)Fig. 1 Carrier migration path in heterojunctions: (a) type Ⅰ;(b) type Ⅱ;(c) Schottky junction;(d) Z-scheme

2.2 ROS 產(chǎn)生

無機(jī)光催化材料產(chǎn)生ROS 的一般機(jī)理如圖2所示，光催化材料吸收光能，在固體表面產(chǎn)生光生電子（e-）和光生空穴（h+），即當(dāng)入射光能量大于光催化材料自身帶隙時(shí)，電子空穴發(fā)生分離，電子從價(jià)帶被激發(fā)到導(dǎo)帶，空穴則留在價(jià)帶，此時(shí)導(dǎo)帶上的電子和價(jià)帶上的空穴分別具有強(qiáng)還原性和強(qiáng)氧化性，這些載流子與含氧分子接觸后通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ROS[10].在實(shí)際條件下，H2O 和O2是光催化過程中重要的反應(yīng)物種，O2與光生電子的還原反應(yīng)以及H2O 與光生空穴的氧化反應(yīng)同時(shí)發(fā)生[34].不同種類的ROS 之間還會(huì)相互轉(zhuǎn)化[4]，例如的歧化反應(yīng)，·OH 的二聚反應(yīng)以及Haber-Weiss 反應(yīng)等，相關(guān)反應(yīng)匯總?cè)绫? 所示.在光催化抗菌中，抗菌效率受所使用的半導(dǎo)體的種類[6,10,16]、微晶結(jié)構(gòu)及尺寸[29,35]、所采用的菌液條件[27]和光照條件等多種因素的影響.鑒于光催化材料表面載流子的遷移及與吸附物質(zhì)的多重反應(yīng)，結(jié)合以上影響因素可以優(yōu)化催化材料設(shè)計(jì)方案使材料達(dá)到最佳效果.另外，缺陷是影響光催化材料性能的重要因素，氧空位（OV）[36]是最常見的陰離子空位點(diǎn)缺陷，適當(dāng)增加氧空位可以有效調(diào)節(jié)載流子的傳輸，增加載流子的濃度，提供豐富的氧吸附位點(diǎn)[6,18].在催化反應(yīng)過程中，氧空位可以作為電子供體來提高氧活化能[37]，有利于等ROS 的生成，對(duì)提高催化氧化還原效率具有重要意義.例如Lyu 等[7]制備了富含表面氧空位（SOV）的碳包覆TiO2材料，O2通過碳層完成吸附—活化—解離的過程，產(chǎn)生和1O2.Zhou 等[38]研究了無光環(huán)境中ZnO 納米材料的{2110}晶面存在氧空位并產(chǎn)生ROS 的過程，同時(shí)證實(shí)0.5 g·L-1的{2110}-ZnO 在黑暗條件下表現(xiàn)出約為99.99%的抗菌率.由于氧空位對(duì)半導(dǎo)體材料，尤其是金屬氧化物的物理和化學(xué)特性具有顯著影響，如電阻阻抗、超導(dǎo)性能、光電化學(xué)特性等[6,39]，因此在材料中應(yīng)該盡量通過溫和、簡(jiǎn)便的方法引入氧空位缺陷，同時(shí)注意調(diào)控引入位置及氧空位濃度[7]，細(xì)致研究材料中氧空位缺陷對(duì)其他功能的影響[36]，以避免對(duì)結(jié)果產(chǎn)生誤導(dǎo)，但目前尚未有此類文章報(bào)道.

圖2 光催化氧化水和還原氧氣逐步生成活性氧[34]Fig. 2 Photocatalytic oxidation of water and reducing oxygen gradually generate active oxygen[34]

表2 ROS 反應(yīng)鏈匯總Table 2 ROS reaction chain summary

3 ROS 抗菌機(jī)理

3.1 活性氧(ROS)產(chǎn)生及作用機(jī)理

活性氧（ROS）抗菌是指過高濃度的活性氧打破細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制，與細(xì)菌內(nèi)的遺傳物質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)等物質(zhì)反應(yīng)造成氧化損傷，或與細(xì)胞膜（壁）的結(jié)構(gòu)成分反應(yīng)，造成細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，使細(xì)菌受損死亡[2,10,13].和H2O2可以被細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)源性抗氧化劑（酶促和非酶促）分解[13]，因此兩者的反應(yīng)活性略低于·OH 和1O2.ROS雖具有高度的反應(yīng)活性，但受環(huán)境和自身結(jié)構(gòu)的影響很難長(zhǎng)時(shí)間存在[8]，因此在水生系統(tǒng)中的ROS壽命短且濃度通常較低.除相對(duì)穩(wěn)定的H2O2外，其余ROS 只能在亞毫秒級(jí)的時(shí)間范圍內(nèi)被檢測(cè)到（表3）[40]，但其在光催化抗菌過程中卻發(fā)揮著重要作用.因此探究ROS 的產(chǎn)生過程及作用機(jī)理顯得尤為重要.

表3 四種ROS 性質(zhì)表Table 3 Four types of ROS properties

3.1.1 ·OH 的產(chǎn)生及其作用

·OH 是一種具有高氧化能力的非選擇性氧化劑[34]，可以快速氧化大多數(shù)有機(jī)化合物，因此通常被認(rèn)為是最有效的氧化劑，其生成過程對(duì)于討論光催化氧化反應(yīng)非常重要.首先在催化劑有效反應(yīng)區(qū)內(nèi)，由活性位點(diǎn)捕獲H2O 所產(chǎn)生的表面羥基是生成·OH 的關(guān)鍵中間體，其次表面羥基因官能團(tuán)配位數(shù)的不同被分為橋接羥基自由基和末端羥基自由基[41]，其中橋接氧離子的質(zhì)子化以及溶液的pH 值影響兩種羥基的生成速率和產(chǎn)量[34].最后所有表面羥基被催化劑價(jià)帶上的光生空穴所氧化為·OH，如公式(13)所示.此外H2O2的單電子還原或H2O2和的哈伯-韋斯（Haber-Weiss）反應(yīng)也可以轉(zhuǎn)化為·OH，如表2 中反應(yīng)公式(4)和(12)所示.

·OH 不能直接透過細(xì)胞膜[41]，因此其主要作用于細(xì)胞表面，與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面的結(jié)構(gòu)成分發(fā)生氧化反應(yīng)，例如·OH 作為氧化劑與細(xì)胞膜脂質(zhì)中的碳=碳雙鍵反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物和氫過氧化物[42]，導(dǎo)致可溶性金屬離子或氧化性分子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而加劇 ROS 介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，最終使細(xì)胞死亡.·OH 甚至還可以作用于真菌細(xì)胞壁，通過取代表面成分中的H 原子使其裂解并將糖苷鍵轉(zhuǎn)變?yōu)轷ユI.這種現(xiàn)象破壞了真菌細(xì)胞壁的完整性，并使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松動(dòng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過細(xì)胞邊界流出，Basu 等[43]通過觀察MoS2納米材料處理的鏈格孢菌的電鏡照片發(fā)現(xiàn)菌絲產(chǎn)生嚴(yán)重變形.

3.1.3 H2O2的產(chǎn)生及其作用

H2O2的產(chǎn)生主要來源于O2的兩電子還原和H2O 的氧化[18]（公式(8)）.從還原為H2O2有兩種途徑，除導(dǎo)帶電子對(duì)的還原（公式（1）～（3）），還有超氧化物歧化酶（SOD）作用下的歧化，如公式（14）所示，H2O2后續(xù)反應(yīng)如在過氧化氫酶（CAT）作用下的歧化分解產(chǎn)生O2（公式（15））.

H2O2因其穩(wěn)定的熱力學(xué)狀態(tài)，壽命較長(zhǎng)并能穩(wěn)定發(fā)揮氧化作用[8,40]，是光催化抗菌材料長(zhǎng)期保持殺菌活性的主要物質(zhì).H2O2作為一種擴(kuò)散型小分子，可以跨過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞深處與多種蛋白質(zhì)或酶反應(yīng)，阻礙細(xì)胞的正常生理功能致細(xì)胞死亡[18].另外，進(jìn)入細(xì)胞后的部分H2O2經(jīng)過酶分解產(chǎn)生·OH，具有更強(qiáng)氧化性的·OH 將會(huì)激發(fā)一系列的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，攻擊膜結(jié)構(gòu)，加重細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，同時(shí)使更多的自由基能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的損傷程度.

3.1.41O2的產(chǎn)生及其作用

1O2的產(chǎn)生涉及三個(gè)過程[12]，常規(guī)三線態(tài)分子氧在光催化材料表面的活性吸附、單電子還原、失電子氧化，而高活性的1O2后續(xù)會(huì)在催化劑表面淬滅繼而發(fā)生解離還原成分子氧，因此光生載流子的氧化還原能力是本過程的控速步驟[47].

1O2是氧分子吸收能量后的激發(fā)態(tài)，其最外層有一個(gè)空軌道，易得電子并與其他物質(zhì)結(jié)合生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵.1O2攻擊色氨酸、組氨酸和酪氨酸等各類氨基酸以及核糖堿基造成蛋白質(zhì)和DNA（RNA）的不可逆氧化損傷[48].例如為研究ROS 對(duì)遺傳性物質(zhì)的作用，鳥嘌呤[49]中的2’-脫氧鳥苷被1O2從正反兩個(gè)方向攻擊，經(jīng)過一系列的反應(yīng)之后形成一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體：螺環(huán)亞胺基二乙內(nèi)酰脲dSp，并且H2O 參加了反應(yīng)中的氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，降低中間產(chǎn)物的反應(yīng)活化能，有利于反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行.石婧明用量子化學(xué)的方法具體研究了1O2氧化2’-脫氧鳥苷的過程和機(jī)理，從活化能、頻率分析和NBO 電荷計(jì)算等多方面確定了此氧化反應(yīng)進(jìn)行的最優(yōu)路徑和機(jī)理的合理性[50].

通過以上的分析，可以看出主要的四種ROS可以同時(shí)存在，并且可以相互轉(zhuǎn)化，以TiO2為例，其整體反應(yīng)過程如圖3 所示，因此ROS 的抗菌作用機(jī)理其實(shí)是一種協(xié)同作用機(jī)制.各種ROS 在催化體系中存在一種動(dòng)態(tài)的平衡，使得細(xì)胞在多種ROS 的綜合作用下，產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，細(xì)胞器與細(xì)胞功能物質(zhì)均會(huì)受到不同程度的攻擊和損害，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的衰弱與凋亡.為了能夠分辨不同種類ROS 的具體產(chǎn)生機(jī)理和抗菌作用機(jī)制，就需要較為精確的檢測(cè)手段來證明各種ROS 的存在證據(jù)和作用表現(xiàn).

圖3 ROS 在TiO2 表面上的光催化產(chǎn)生過程Fig. 3 Photocatalytic generation processes of ROS on TiO2 material surfaces

3.2 抗菌過程中活性氧檢測(cè)方法

ROS 檢測(cè)方法大致分為直接方法和間接方法兩類[40]，直接方法為電子自旋共振（Electron spin resonance，ESR）檢測(cè)方法，是利用不成對(duì)電子在磁場(chǎng)中產(chǎn)生能級(jí)分裂或躍遷展現(xiàn)出順磁性的特點(diǎn)檢測(cè)ROS[51]，該方法僅利用自由基的順磁性特征，具有靈敏度高、時(shí)間快速、無損檢測(cè)、定量分析等優(yōu)勢(shì)，非常適合于檢測(cè)環(huán)境壽命短的活性氧自由基.此外借助冷凍技術(shù)有助于延緩自由基的淬滅過程，研究者在氣相低溫（77 K 或4 K）條件下，可以通過ESR 直接觀察到·OH 和[24,52]，1O2本身雖電子均已配對(duì)，但其軌道角動(dòng)量引起的順磁特性也會(huì)導(dǎo)致ESR 信號(hào)變化，因此也可以被ESR 檢測(cè)到[51].

由于每種ROS 都可以吸收光能，在特定的波長(zhǎng)下可以觀察到吸收特征峰，同時(shí)，吸收峰的觀測(cè)也受到自由基的最大吸收波長(zhǎng)和摩爾吸收系數(shù)的影響（表3），摩爾吸收系數(shù)越小，對(duì)自由基進(jìn)行光吸收的直接檢測(cè)就越困難.1O2吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射屬于磷光發(fā)光過程，因此磷光發(fā)光法成為直接檢測(cè)1O2的一種獨(dú)特方法，是常用檢測(cè)1O2存在的手段之一.1O2失活轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的基態(tài)氧有兩種能量釋放方式[53]：1O2→ O2+hv（發(fā)光波長(zhǎng)為1268 nm）；21O2→ 2O2+hv（發(fā)光波長(zhǎng)分別為634 nm 和703 nm）.近紅外區(qū)1268 nm 處的磷光發(fā)光法被普遍認(rèn)為是檢測(cè)1O2最直接最可靠的方法，且發(fā)光強(qiáng)度與1O2的量成正比[12].除此之外，此種技術(shù)還可以確定1O2的產(chǎn)率、壽命和失活速率常數(shù)等參數(shù)[40].為了延緩自由基的淬滅，通常溶劑環(huán)境用D2O 代替H2O，可將其壽命提高到76 μs[40].時(shí)間分辨磷光法、空間分辨磷光法及近紅外區(qū)半導(dǎo)體二極管法等[53-54]技術(shù)都提高了傳統(tǒng)磷光法的檢測(cè)靈敏度，但當(dāng)1O2微量（1 μg）時(shí)無法滿足前兩種方法定量分析要求[34]，檢測(cè)下限還需要提高.

由于抗菌系統(tǒng)多為溶液環(huán)境，在此條件下ROS壽命短且濃度通常較低[8]，除相對(duì)穩(wěn)定的H2O2外，其余ROS 只能在毫秒級(jí)以下的時(shí)間直接觀察到，研究人員提出了使用探針分子捕獲自由基以產(chǎn)生較穩(wěn)定分析物的間接方法[55].相較之下，ESR 檢測(cè)成本稍高，不適用于大批量檢測(cè)樣品，磷光發(fā)光法也只適合檢測(cè)1O2，因此在抗菌領(lǐng)域當(dāng)中直接檢測(cè)還存在一定的限制，間接方法則較大程度上解決了這些問題.間接方法通常涉及特定ROS 與探針分子的反應(yīng)，以產(chǎn)生更穩(wěn)定、壽命更長(zhǎng)的分析物，這樣的反應(yīng)一般以特定的化學(xué)衍生化技術(shù)（例如，用氮氧化物或其他自旋試劑捕獲自由基）或者競(jìng)爭(zhēng)動(dòng)力學(xué)為測(cè)試基礎(chǔ)[40].考慮到實(shí)驗(yàn)室條件下檢測(cè)的可行性、必要儀器和探針分子成本等因素，通常使用光譜檢測(cè)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，例如吸光光度法（UV/ Vis），熒光法（FL）、化學(xué)發(fā)光法（CL）和電子自旋共振法（ESR）等.由于引入了額外的化學(xué)反應(yīng)，這些間接技術(shù)有可能擾亂觀察到的系統(tǒng).除此之外，大部分光譜檢測(cè)策略雖然操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、反應(yīng)迅速，是實(shí)驗(yàn)室通用檢測(cè)手段，但在外部光源條件下從采樣到檢測(cè)活性氧與探針分子的穩(wěn)定產(chǎn)物還需要一定的時(shí)間，無法反映實(shí)時(shí)ROS 產(chǎn)生，因此還需要穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析、停止流方法、時(shí)間分辨激光光譜、快速光解和脈沖輻射分解等方法兼并分析[56].而化學(xué)發(fā)光法（CL）是借助化學(xué)反應(yīng)能量驅(qū)動(dòng)，檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)過程中產(chǎn)生的能量發(fā)射，不需要額外的光能，規(guī)避了大部分問題，因此CL 過程被認(rèn)為是最靈敏的檢測(cè)方法之一[34].但不可避免的是，在使用CL 探針時(shí)，也會(huì)受到溶液酸堿性和其他氧化劑的影響，例如魯米諾（Luminol）探針只適合在堿性環(huán)境下檢測(cè)ROS，且溶解的O2和H2O2也可以氧化Luminol 產(chǎn)生CL 信 號(hào)[57]；MCLA 探針（6-(4-methoxyphenyl)-2-methyl-3,7-dihydroimidazo-[1,2-a]pyrazin-3-one hydrochloride）雖選擇性優(yōu)于Luminol 探針，但檢測(cè)的同時(shí)1O2也會(huì)氧化MCLA[55]，即便CL 系列探針基本是在中性使用的，但pH 值和其他高反應(yīng)活性離子仍然是多數(shù)探針分子的關(guān)鍵影響因素.目前可以通過使用萃取、自由基清除劑或色譜法，在分析之前盡量消除其他活性物質(zhì)的干擾以獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)分析結(jié)果[56].表4 匯總了四種ROS 的常用探針分子的間接檢測(cè)方法，包括使用探針分子反應(yīng)原理及其產(chǎn)物（含產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)條件）、產(chǎn)物的相應(yīng)檢測(cè)數(shù)據(jù)、檢測(cè)方法類別、檢測(cè)限、影響因素和該方法的參考文獻(xiàn)，供大家參考.

表4 常用探針分子的間接檢測(cè)方法Table 4 Indirect detection methods of commonly used probe molecules

選擇ROS 分析方法時(shí)應(yīng)著重考慮該方法的敏感性、該方法對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性和特異性，以及該方法允許以足夠快的時(shí)間分辨率進(jìn)行測(cè)量的能力[40].不同方法之間的特異性差異很大，在進(jìn)行ROS 鑒定或定量分析時(shí)應(yīng)慎重選擇，爭(zhēng)取在有限的條件下使用相對(duì)合理的檢測(cè)方法得到較精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

3.3 ROS 催化活性的影響因素和優(yōu)化措施

ROS 是光催化抗菌過程中最關(guān)鍵的反應(yīng)物質(zhì)，研究表明ROS 的產(chǎn)量與細(xì)菌存活率之間存在線性相關(guān)性（R2=0.84）[68]，此外ROS 的反應(yīng)活性也很大程度上決定著光催化材料的抗菌效果.研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的產(chǎn)量和活性取決于光催化材料的基本種類[2,30,35]、能帶結(jié)構(gòu)[27,29,69]、反應(yīng)介質(zhì)pH[70]、環(huán)境溫度[28]、摻雜元素[9,71]以及表面修飾[36,38]等因素.首先，ROS 生成類型取決于半導(dǎo)體的禁帶寬度值（Energy band）和ROS 生成反應(yīng)的氧化還原電位（Eh，具體數(shù)值參考表1）[14].當(dāng)光催化材料正電位的價(jià)帶（Ev）頂或負(fù)電位導(dǎo)帶（Ec）底相對(duì)電位值超過相應(yīng)的ROS 生成電位[10]，即可產(chǎn)生對(duì)應(yīng)ROS 物種.例如銳鈦礦型TiO2（A-TiO2）、ZnO 和ZnS 納米顆?？僧a(chǎn)生三種類型ROS（1O2、OH、），金紅石型TiO2（R-TiO2）、CuO、In2S3等只產(chǎn)生一種或兩種ROS，而Bi2S3不能產(chǎn)生ROS[72]，如圖4 所示.

圖4 與超氧物、單線態(tài)氧和羥基自由基的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位相比，典型半導(dǎo)體材料的禁帶寬度值及帶邊位置Fig. 4 Compared with the standard redox potential of superoxide,singlet oxygen,and the hydroxyl radical,the energy band and band edge position of typecial semiconductors.

其次，光催化材料的結(jié)構(gòu)特征，例如尺寸、形貌、晶面暴露率等均對(duì)ROS 的產(chǎn)量和活性有一定影響[10,18].通過形態(tài)調(diào)整技術(shù)獲得小尺寸大比表面積的材料，能夠更容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)菌底物結(jié)合，產(chǎn)生更多的表面活性位點(diǎn)提高載流子分離能力，達(dá)到良好的抗菌效果.例如Wen 等[35]制備的1.1 nm 的WO3-x納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)均表現(xiàn)出顯著的膜透過性和高毒性ROS 的產(chǎn)生.2D 超薄（厚度＜10 nm）銳鈦礦型TiO2研究發(fā)現(xiàn)其{001}面暴露率高達(dá)90%以上[73]，光照短時(shí)間內(nèi)就可以檢測(cè)出大量ROS，使得此類光催化抗菌材料見效較快.

第三，環(huán)境條件作為外在因素對(duì)ROS 活性也起著重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)反應(yīng)介質(zhì)的pH 值和溫度研究較多[28,70].生物體內(nèi)源ROS 活性在極端pH 值和高溫下受到明顯抑制，但光催化材料產(chǎn)生的外源性ROS 對(duì)惡劣條件表現(xiàn)出優(yōu)異的抗性[74].例如，CuO 納米棒[28]和銅摻雜磷酸鹽玻璃（Cu-PBG）納米球[75]在較寬的pH 范圍（3.0～7.0）及溫度范圍（25～60 ℃）內(nèi)均有ROS 的產(chǎn)生，在醫(yī)學(xué)生理?xiàng)l件（pH 值為6，環(huán)境溫度是37 ℃）下也可以保持對(duì)大腸桿菌良好的殺菌效果.

最后，通過表面修飾手段[26,29,71]對(duì)光催化材料本體表面物理和化學(xué)性質(zhì)實(shí)現(xiàn)有目的性的改變，以增強(qiáng)ROS 產(chǎn)生和殺菌作用，例如表面異質(zhì)結(jié)、表面缺陷控制和表面摻雜等手段.前兩種手段已在前文講述，而表面摻雜元素（金屬/非金屬）是以調(diào)整材料固有的晶體和電子結(jié)構(gòu)從而達(dá)到優(yōu)化氧化還原能力[71,76].對(duì)于金屬含氧光催化劑而言，構(gòu)建異質(zhì)結(jié)構(gòu)和負(fù)載貴金屬是提高其活性的兩種最佳策略[18].例如Liang 等[77]制備的TiO2-ZnO/Au復(fù)合材料優(yōu)異的光催化產(chǎn)氫性能（1068 μmol.g-1，可見光照射4 h）和抗菌性能（達(dá)到98.2%），Au 和p-n異質(zhì)結(jié)在此過程中起協(xié)同作用.

根據(jù)上述影響ROS 產(chǎn)量和活性的條件，可以從以下幾個(gè)方面提高催化材料ROS 的作用效果：（1）根據(jù)ROS 氧化還原電位和材料能帶結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)復(fù)合材料，有目的性地制備新型材料；（2）建立一套統(tǒng)一完整的ROS 活性評(píng)價(jià)體系，方便不同材料不同條件下的對(duì)比分析；（3）根據(jù)實(shí)際使用條件和目標(biāo)要求，合理改性催化材料，避免過度修飾，同時(shí)注意綠色環(huán)保和可循環(huán)處理等要求.

4 總結(jié)與展望

綜上所述，活性氧（ROS）抗菌在光催化抗菌過程中具有顯著的直接作用與多重功效，例如高效、安全、廣譜等特點(diǎn)，在很多領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的實(shí)際應(yīng)用前景.但對(duì)于活性氧的研究中還存在些許亟待解決的問題，值得深思.首先在機(jī)理方面，活性氧自由基在介質(zhì)中以多種類、多狀態(tài)（例如活性氧中間體等）相互轉(zhuǎn)化并達(dá)到一種穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)外的各個(gè)區(qū)域，協(xié)同作用于細(xì)胞氧化損傷，所以單獨(dú)認(rèn)定哪一類活性氧自由基在抗菌過程中起到最主要作用具有一定的局限性.雖然活性氧抗菌已是普遍認(rèn)可的一種重要機(jī)制，活性氧產(chǎn)生的數(shù)量和種類對(duì)細(xì)菌活動(dòng)有至關(guān)重要的影響，但是活性氧與細(xì)菌生物體之間的詳細(xì)作用關(guān)系也缺乏細(xì)致研究，不同種類的活性氧自由基對(duì)細(xì)菌生物之間所產(chǎn)生的具體影響還不夠明確，需要在生物學(xué)的基礎(chǔ)上給予更深入的研究.

其次在檢測(cè)方面，雖然在目前技術(shù)下可以做到ROS 質(zhì)和量的整體研究，但在活體細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行屏蔽劑清除實(shí)驗(yàn)時(shí)，破壞體系平衡后難免會(huì)對(duì)被檢測(cè)的活性氧造成一定的影響，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析.此外，大部分活性氧自由基都存在濃度低、有效存在時(shí)間短的問題，目前檢測(cè)手段還不足以支持對(duì)整個(gè)活性氧自由基的活體進(jìn)行原位示蹤，觀察記錄其動(dòng)態(tài)衰減過程.因此改進(jìn)或創(chuàng)建用于檢測(cè)瞬態(tài)和痕量系統(tǒng)中活性氧的探針對(duì)于優(yōu)化定性和定量分析方法十分重要.

活性氧具有廣譜抗菌、無耐藥性限制的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼具降解有機(jī)污染物的性能，使得光催化抗菌材料具備自凈能力，這種安全、持久、穩(wěn)定的特點(diǎn)使得光催化材料在未來有很大的發(fā)展空間.但是此類材料的活性氧氧化特性對(duì)于有機(jī)物基底的材料是存在氧化腐蝕風(fēng)險(xiǎn)的，不能與有機(jī)物長(zhǎng)期穩(wěn)定共存；此外，在衛(wèi)生醫(yī)療領(lǐng)域，催化材料的材質(zhì)甄別尤為嚴(yán)格和重要，含金屬元素的催化材料需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，層層實(shí)驗(yàn)把關(guān)才可以在特定生物環(huán)境中推廣使用.因此，光催化抗菌材料的設(shè)計(jì)應(yīng)用需要在活性氧產(chǎn)生機(jī)理層面上出發(fā)，根據(jù)使用環(huán)境的要求和適度抗菌的目的綜合考慮，合理構(gòu)建材料的構(gòu)造和負(fù)載形式.